利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

从条件培养基等体液中分离细胞外囊泡，可使研究人员表征囊泡所携带的分子 cargo，并探究其细胞间通讯机制。该技术能够高效分离条件培养基中的细胞外囊泡（EVs）与细胞外蛋白，操作简便且易于使用。首先，将 PBS 置于 37 摄氏度水浴中。

在10倍和100倍物镜的复合显微镜下观察对照组和衣霉素处理的细胞培养瓶。记录各培养瓶之间的任何差异。移除培养瓶中的培养基，并将其转移至50毫升离心管中。

然后在4°C条件下以500 × g离心5分钟，将上清液转移至新管中。在4°C条件下以2000 × g离心20分钟。将上清液转移至新管，并将试管置于冰上。

取四个15毫升、截留分子量为3千道尔顿的超滤装置，向每管中加入5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。将装置在4°C、4,000 × g条件下离心10分钟，以预润滤膜。从装置中移除PBS后，将对照组和处理组的上清液分别等分至两个超滤装置中，每管加入约12.5毫升培养基。

在4,000 G、4摄氏度条件下离心管子1小时45分钟，或直至每个单元中的浓缩培养基或截留液浓缩至250 µL或更少。将两个对照单元的截留液转移至一个标记好的1.5 mL微量离心管中，将处理组单元的截留液转移至另一个管中。测量每个微量离心管中截留液的总体积。

如果体积小于500微升，加入0.22微米滤过的PBS，使最终体积达到500微升。将试管放入-80摄氏度冰箱中。打开自动组分收集器（AFC）。

将层析柱从4摄氏度环境中取出，使其升至室温。从-80摄氏度冰箱中取出截留样品，置于冰上解冻。等待期间，将八个已标记的1.5毫升离心管管盖朝内放入AFC样品盘中。将层析柱插入AFC，条形码面向读取器，并调整设置以收集八份馏分，每份500 µL，缓冲液体积设为默认值。

然后按照屏幕上的指示开始收集。待储存缓冲液完全被柱基质上部吸收后，向柱中加入15毫升PBS，开始冲洗层析柱。

不要过早加入 PBS，否则会稀释保存缓冲液，影响充分冲洗。当 15 毫升 PBS 即将完全被基质吸收时，立即点击“确定”停止冲洗，并用微量移液器吸除柱基质顶部残留的 PBS。切勿触碰基质。

将500微升样品加入到层析柱中央，点击确定以开始运行。待样品完全被基质吸收后，立即向层析柱中加入8毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。AFC会自动将空体积排入旋转架中央，随后收集全部八个组分，每个组分500微升。

运行结束后，从旋转收集器中取出各组分并置于冰上。然后，移除旋转收集器中心的空体积部分。接着，向层析柱中加入 10 毫升 PBS，以洗涤残留的样品。

当洗脱后的样品完全流出后，向层析柱中加入 15 毫升 PBS。当最后一次 PBS 被基质吸收时，向层析柱基质中央加入 500 微升 0.5 摩尔的氢氧化钠。随后在氢氧化钠被吸收的同时，向层析柱中加入 30 毫升 PBS，并使其流过层析柱。

完成所有样品处理后，向柱中加入15毫升0.05%叠氮化钠，以保存柱子供后续使用。在柱基质上方保留约5毫升叠氮化钠溶液。将柱子从AFC装置上取下，盖上上下端盖，然后置于4摄氏度保存。

构建超滤装置。每个样品准备两个 2 毫升、截留分子量为 3 千道尔顿的超滤装置。每个装置由三部分组成：锥形管、滤膜和滤过液收集管。

正确标记各部分。向滤膜部分加入一毫升 PBS，并用锥形部件盖紧。将超滤装置锥形端朝上，在 4 摄氏度下以 3,500 G 离心 10 分钟，然后从滤过液收集管中移除滤出的 PBS。

将超滤装置倒置，在4°C、1000 G条件下离心两分钟，以去除残留的PBS。收集四个500微升的组分并合并，加入超滤装置中。然后在4°C、3,500 G条件下离心1小时45分钟，或直至截留液体积达到100微升。

取下滤过液收集管，弃去滤过液。将超滤装置倒置，于4摄氏度、1000 ×g 条件下离心2分钟。将滤出液转移至1.5毫升离心管中，用0.22微米滤膜过滤的PBS将样品体积调至150微升，随后将离心管置于-80摄氏度冰箱中保存。

各组分的代表性Western印迹结果显示，CD9、CD63和CD81在第5至第8组分中表达较强，而在第1至第4组分中表达极少或无表达。所有组分中均未检测到GM130和calnexin的表达。

白蛋白仅存在于第六至第八组分中。同时评估了EV和蛋白质组分浓缩的效果。在细胞裂解液中检测到CD9和CD63的表达。

三种CD蛋白均存在于对照组和衣霉素处理样本的EV组分中，但不存在于蛋白组分中。肿瘤易感基因101存在于细胞裂解液中，但不存在于EV或蛋白组分中。GM130和钙联蛋白仅在细胞裂解液中检测到。

在外泌体耗竭的细胞培养基的蛋白质印迹实验中，细胞裂解液中存在细胞外囊泡（EV）标志物，但在培养基样品中未检测到。白蛋白在蛋白组分中表达，而在细胞裂解液中表达极少。透射电镜观察显示，对照组和衣霉素处理组的EV组分中均存在球形结构。

在两种样品类型的蛋白组分中均未观察到这些结构。纳米颗粒追踪分析显示，在细胞外囊泡（EV）组分中，与对照组相比，经处理组的颗粒浓度存在差异，其中衣霉素处理组的颗粒略多。然而，在蛋白组分中，检测到的颗粒数量较EV组分少。

对照组和处理组的样本体积必须保持一致，以便于对不同处理条件下的细胞外囊泡（EVs）进行简便比较。在从条件培养基中分离出EVs后，可通过蛋白质组学、RNA测序和脂质组学对囊泡中的蛋白质、RNA和脂质成分进行表征。