用于从条件细胞培养基中分离细胞外囊泡的体积排阻色谱
May 13th, 2022
这里的方案表明，可以使用尺寸排阻色谱从条件细胞培养基中充分分离细胞外囊泡。
从条件细胞培养基等液体中分离细胞外囊泡可以使研究人员表征前庭货物并探索其细胞内通讯机制。该技术允许从条件细胞培养基中充分分离EV和细胞外蛋白，简单且用户友好。首先将PBS置于37摄氏度的水浴中。
在带有10x和100x物镜的复合显微镜下观察对照和tunicamycin处理的细胞培养瓶。记下烧瓶之间的任何差异。从烧瓶中取出培养基并将其放入50毫升管中。
然后将管以500 G在4摄氏度下离心5分钟，然后将超级清液转移到新管中。将试管以 2000 G 在 4 摄氏度下离心 20 分钟。将超级清液转移到新管中，并将管放在冰上。
取四个15毫升三千道尔顿截止超滤装置，并向每个管中加入5毫升PBS。通过在 4， 000 G 的温度下将装置在 4 摄氏度下离心 10 分钟来灌注过滤器。从单元中除去PBS后，将对照和处理条件下的上清液分成两个超滤单元，每个单元中含有约12.5毫升的培养基。
将试管以4， 000 G在4摄氏度下离心1小时45分钟，或直到每个单元中的浓缩培养基或截留物浓缩至250微升或更低。将截留物从两个控制单元转移到标记的1.5毫升微量离心管中，并从处理过的单元转移到另一个管中。测量每个微量离心管中截留物的总体积。
如果体积小于500微升，则添加0.22微米过滤的PBS，直到最终体积为500微升。将试管放入零下 80 摄氏度的冰箱中。打开自动馏分收集器或 AFC。
将色谱柱从 4 摄氏度中取出，让色谱柱升温至室温。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出截留物样品，并将它们放在冰上解冻，在等待时，将八个标记的 1.5 毫升管放在 AFC 转盘中，盖子朝内。将色谱柱插入AFC，条形码面向阅读器，并调整设置以收集8个馏分，每个部分500微升，缓冲液体积为默认值。
然后验证屏幕上的说明以开始收集。在储存缓冲液被完全吸收到柱基质的顶部之后。通过向色谱柱中添加15毫升PBS开始冲洗色谱柱。
不要过早添加PBS，因为它会稀释存储缓冲液并防止充分冲洗。在所有15毫升PBS被基质吸收之前，单击确定停止冲洗，并用微量移液管从柱基质顶部去除任何残留的PBS。请勿触摸矩阵。
将 500 微升样品添加到色谱柱中心，然后单击 OK 开始运行。样品完全吸收到基质中后，立即向色谱柱中加入8毫升PBS。AFC自动将空隙体积分散到转盘的中心，然后收集所有八个部分，每个部分500微升。
跑步后，从旋转木马上取出碎屑并将它们放在冰上。然后从轮播中心移除空白体积。接下来，向色谱柱中加入10毫升PBS，以洗涤色谱柱上的任何残留样品。
一旦悔改的样品完全冲洗，向色谱柱中加入15毫升PBS。当最终PBS被基质吸收时，在色谱柱基质的中心加入500微升0.5摩尔氢氧化钠。然后，随着氢氧化钠被吸收，向色谱柱中加入30毫升PBS，使其冲洗通过。
完成所有样品后，通过向色谱柱中加入15毫升0.05%叠氮化钠来保存色谱柱以备后用。在柱基质顶部留下约5毫升叠氮化钠。从AFC上取下色谱柱并安装顶部和底部盖子，然后将色谱柱置于4摄氏度下进行储存。
构建超滤单元。每个样品获得两毫升，三千道尔顿截止超滤单元。每个单元由三部分组成，锥形，过滤器和流通式气缸。
正确标记每个部分。在过滤器部分加入一毫升PBS，并用锥形片盖住盖子。将超滤单元锥面朝上在 3， 500 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后从流通筒中取出过滤后的 PBS。
将超滤装置倒置，在 1000 G 下以 4 摄氏度离心两分钟，以去除任何剩余的 PBS。将每个馏分的四个500微升混合，并将它们添加到超滤装置中。然后将离心柱在4摄氏度下在3， 500 G下重合1小时45分钟，或直到截留液水平为100微升。
拆通气缸并丢弃流通。将超滤装置倒置，在 1000 XG 和 4 摄氏度下离心两分钟。将锥体中的截留物转移到1.5毫升管中，并用0.22微米过滤的PBS使样品体积达到150微升，然后将试管放入零下80摄氏度的冰箱中。
具有代表性的蛋白质单个级分块显示CD9，CD63和CD81的强烈表达。违规一到四，很少或没有表达 违反五到八。在任何级分中均未观察到GM130或钙连接蛋白的表达。
白蛋白仅存在于六至八分之一中。还评估了浓缩EV和蛋白质组分的有效性。在细胞裂解物中观察到CD9和CD63的表达。
所有三种CD蛋白均存在于对照和图尼霉素处理样品的EV级分中，但不存在于蛋白质级分中。肿瘤易感基因101存在于细胞裂解物中，但不存在于EV或蛋白质部分中。仅在细胞裂解物中观察到GM130和calnexin。
在外泌体去除细胞培养基的蛋白质印迹中，EV标志物存在于细胞裂解物中，但不存在于培养基样品中。在蛋白质级分中观察到白蛋白表达，在细胞裂解物中观察到最小表达。TEM观察表明，对照和图尼霉素处理样品的EV级分中存在球形结构。
在两种样品类型的蛋白质级分中均未观察到这些结构。纳米颗粒跟踪分析揭示了EV级分中对照和处理级分的颗粒浓度差异，与对照相比，兔霉素处理中存在的颗粒略多。然而，在蛋白质组分中，相对于电动汽车检测到的颗粒更少。
对于对照和处理条件，具有相同的样品量非常重要，以便轻松比较不同处理的EV。从条件细胞培养基中分离EV后，我们可以通过蛋白质组学RNA测序和脂质组学表征囊泡的蛋白质，RNA和脂质含量。
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概览
该协议展示了使用尺寸排阻色谱法高效分离来自条件培养基的细胞外囊泡（EV）。该方法允许研究人员分析囊泡的货物并检查细胞内通信机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 细胞外囊泡
- 色谱技术
背景
- 细胞外囊泡在细胞间通信中起着关键作用。
- 表征EV可以提供对其生物功能的洞察。
- 使用尺寸排阻色谱法可以有效地将其与蛋白质分离。
- 这种方法对研究人员来说是用户友好和直接的。
研究目的
- 提供可靠的EV提取协议。
- 促进EV内容的表征。
- 增强对EV介导的生物系统通信的理解。
使用的方法
- 研究采用尺寸排阻色谱法将EV从条件培养基中分离。
- 它利用各种离心步骤有效处理培养基。
- 使用超滤单元调整样品浓度。
- 关键步骤包括监测样品保留和洗涤色谱柱。
- 使用代表性的蛋白质印迹来验证EV标记表达。
主要结果
- 在特定的EV分数中观察到CD标记（CD9、CD63、CD81）的强表达。
- EV分数中某些蛋白质（GM130、calnexin）的无表达表明成功分离。
- 这些发现支持该方法在浓缩EV和表征其内容方面的有效性。
结论
- 该研究展示了一种可靠的分离EV的方法，增强了研究能力。
- 该方法为进一步研究EV功能和信号传导途径奠定了基础。
- 理解EV可以帮助开发针对细胞内通信的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable separation of extracellular vesicles (EVs) from conditioned cell culture media is critical for characterizing vesicular cargo and understanding intercellular communication mechanisms. This capability directly impacts early discovery, target validation, and translational biomarker research by enabling precise molecular profiling of EVs under different cellular conditions. Robust EV isolation supports predictive confidence in disease-relevant system studies and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-mediated signaling pathways and their biological relevance.
- Supports functional target validation by isolating vesicles reflective of specific cellular states.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative analysis of EV cargo under control and stress conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares highly purified EV fractions for downstream proteomic, RNA, and lipidomic assays.
- Standardizes sample input and output volumes, improving reproducibility across experiments.
- Enables quantitative readouts for screening EV-associated biomarkers or therapeutic candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with disease-relevant models for biomarker discovery and validation.
- Ensures continuity from in vitro discovery to preclinical evaluation by providing well-characterized vesicle populations.
- Reduces biological ambiguity in translational studies by confirming EV purity and marker expression.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized workflow for EV isolation, characterization, and quantitative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on EV-mediated communication and cargo specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EV fractions suitable for high-content assays.
- Analytics: Enables robust measurement of EV markers and particle concentrations for comparative studies.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical models through consistent EV profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for EV isolation across diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV-based biomarker and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of EV isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing biological noise in vesicle analyses.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-related discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatography, ultrafiltration, and nanoparticle analytics.
- Needs access to automated fraction collectors, SEC columns, and analytical platforms for EV characterization.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and fraction pooling.
- Adaptable to various cell types and stress conditions with appropriate validation controls.
- Sample volume consistency is essential for accurate comparative analyses.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:31
Collection and Concentration of Conditioned Cell Culture Media
2:51
Extracellular Vesicle (EV) Separation Using Size Exclusion Chromatography
6:02
Ultrafiltration of EV and Protein Fractions
7:52
Results: Separating EVs from the Conditioned Cell Culture Media Using Size Exclusion Chromatography
10:06
Conclusion
