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方法文章

用于培训与研究的动脉瘤疾病猪模型

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DOI：

10.3791/63616

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2022年3月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Area, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 2Centro de Investigación Biomédica En Red de Enfermedades Cardiovasculares CIBERCV, 3Scientific Director, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 4Microsurgery Unit, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre

本文内容

摘要

介绍了两种不同的用于神经放射学培训课程和研究的猪动脉瘤模型。本研究提供了证据，证明这些猪动脉瘤模型构建的可行性，以及可重复且接近临床实际情况的建模方法。

摘要

大型动物模型，特别是猪模型，被广泛用于心血管疾病及其治疗方法的研究，同时也用于培训目的。本文描述了两种不同的动脉瘤猪模型，这些模型可帮助研究人员研究动脉瘤疾病的新型治疗方法。这些动脉瘤模型通过外科手术将组织袋植入猪的颈动脉而建立。当模型用于科研时，组织袋必须为自体来源；而用于培训时，使用合成材料制成的组织袋即可满足需求。

首先，需手术暴露右侧颈外静脉（EJV）和右侧颈总动脉（CCA）。结扎EJV，并用其短段制备静脉袋。然后将该静脉袋缝合至在CCA上制作的椭圆形动脉切口。模型制备过程中必须使动物保持肝素化，可使用局部血管扩张剂以减少血管痉挛。缝合完成后，应检查血流是否正确，观察缝合线有无出血以及血管是否通畅。最后，逐层关闭手术切口，并进行血管造影以成像动脉瘤模型。

一种简化该动脉瘤颈动脉模型并降低侵入性和手术时间的方法是使用合成材料而非静脉制成的囊袋。为此，可预先用一段聚四氟乙烯（PTFE）假体制作一个囊袋，将其一端用聚丙烯血管缝线缝闭，并在手术前进行灭菌处理。然后将此“囊袋”连接至如前所述在颈总动脉（CCA）上所做的动脉切口处。

尽管这些模型无法再现与动脉瘤形成相关的许多病理生理事件，但其血流动力学特征与临床实际情况相似。因此，这些模型可用于科研或培训，使医生能够在接近人体系统的动物模型上学习和练习不同的血管内介入技术。

引言

颅内动脉瘤（IA）是一种严重的脑血管疾病，破裂时死亡率可高达50%。这是一种相对常见且可能致命的疾病，在血管造影研究中报道的患病率介于3.6%至6%之间1。颅内血管因多种危险因素而出现异常扩张和膨胀，这些因素包括但不限于吸烟、高血压、过量饮酒或年龄增长。若不加以治疗，颅内动脉瘤可自发破裂，导致蛛网膜下腔出血（SAH），进而引起显著的病残率和死亡率2,3,4。此外，约三分之一的患者需要住院或接受护理，仅有30%的SAH患者能够恢复独立生活能力，因此该疾病对人类健康构成重大负担，也正因如此，开展动物实验具有充分的必要性5。

目前，对于破裂和出血高风险的颅内动脉瘤（IA）患者，主要通过血管内栓塞术、显微外科夹闭术或血流导向支架进行闭塞治疗6,7。国际蛛网膜下腔动脉瘤试验（ISAT）已对血管内治疗术进行了评估，结果表明，与显微外科治疗相比，栓塞术更安全、创伤更小，因此不良反应更轻微3。 正因如此，血管内治疗已成为颅内动脉瘤治疗中最常用的技术3。医生需接受专门培训，才能正确实施这些微创手术8。

此外，在将新的颅内动脉瘤（IA）治疗装置或疗法应用于临床之前，必须在临床前研究中对其进行充分的建立和测试6,9。根据研究或培训的主要目的，存在多种不同的IA实验动物模型。这些模型已在多种物种中建立，各有其局限性与优势。然而，由于动物体内不存在天然的颅内动脉瘤，所有模型均需通过人工诱导或手术方式构建2,6,9,10,11,12。

尽管没有动物模型能够完美地再现人类的病理生理过程，但小型动物（如啮齿类动物） 仍是颅内动脉瘤（IA）研究中最常使用的实验动物6。大型动物通常用于新型血管内器械的开发或治疗性干预技术的培训2。在大型动物模型中，猪常被用于颅内动脉瘤相关疾病与疗法的研究以及培训课程，这主要归因于其对手术操作的良好耐受性，以及其血管直径和血流状态与人类脑血管相似2,13。

建立颅内动脉瘤（IA）动物模型的方法选择取决于各个研究项目的具体主要目标，例如是否需要评估血管造影或组织学终点指标。在此意义上，通过手术结扎或在颈总动脉（CCA）上附加自体组织袋所建立的模型适用于IA生长的研究。如果研究的主要终点是IA破裂，则必须将手术模型与高血压诱导相结合。当模型用于培训目的时，可通过在颈总动脉上缝合合成组织袋而不需诱导高血压的方式简化操作技术6。

本文介绍了两种不同的动脉瘤猪模型，这些模型可帮助研究人员研究颅内动脉瘤（IA）疾病的新型治疗方法或进行血管内介入治疗的培训。这些动脉瘤模型通过外科手术将一段组织袋植入猪的颈总动脉（CCA）而建立。当该模型用于科研时，组织袋为自体来源，因此可在排除动脉瘤后研究其愈合过程，且不受任何外来材料的干扰。而在培训用途中，使用能够模拟血管内解剖结构的合成组织袋即可满足手术操作的再现需求。

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方案

该实验已获得赫苏斯·乌松微创外科中心伦理委员会的批准，所有操作均依照西班牙皇家法令53/2013和欧洲法规（2010/63/EC）进行。

1. 术前准备与麻醉

  1. 将体重为35-40 kg的大型白色猪单独饲养，每天自由饮水和喂食一次。在干预前进行为期2周的适应性饲养，以完成临床检查，并留出时间检测潜在的隐匿性疾病。
  2. 为预防研究期间发生血栓事件，从建模前7天起至动脉内治疗（IA治疗）期间，每日给予以下口服药物：乙酰水杨酸（1 g/动物/24 h）和氯吡格雷（75 mg/动物/24 h）。
  3. 禁食24小时后，肌肉注射氯胺酮（10 mg/kg）。10分钟后，静脉注射1%丙泊酚（3 mg/kg）以诱导麻醉。
  4. 气管插管后，使用吸入式七氟烷维持麻醉（吸气浓度3%-4.5%）。将气管导管连接至半封闭环路麻醉系统，并接入呼吸机，新鲜气体流速设定为0.5-1 L/min。
  5. 通过设定潮气量为8-10 mL/kg来控制通气，以维持正常二氧化碳水平（35-45 mmHg CO2）。术中镇痛通过静脉注射酮咯酸（1 mg/kg）与曲马多（1 mg/kg）的初始剂量组合，并持续输注瑞芬太尼（15-18 µg/kg/h）来保障。
  6. 根据动物是否处于无意识状态（催眠）、对疼痛无反应、肌肉松弛以及无反射反应等指标，确认麻醉深度适当14。
  7. 为防止麻醉期间角膜干燥，手术过程中应在动物眼部涂抹兽用眼膏。
  8. 将麻醉后的动物仰卧位固定于手术台上，剃除颈部毛发，使用聚维酮碘进行皮肤消毒，并在无菌条件下铺巾。
  9. 所有操作均须在无菌条件下进行，使用无菌手套及无菌器械。

2. 手术

  1. 手术入路
    1. 在颈部中线右侧2-3 cm处做一条10 cm长的纵向皮肤切口。
  2. 囊袋修整
    1. 自体囊袋
      1. 为暴露EJV，分离皮下和脂肪组织并进行止血。
      2. 将右侧胸头肌从结缔组织中分离，并用Weitlaner牵开器牵开，以利于暴露EJV。
      3. 暴露并识别EJV，其位置位于CCA外侧且更深（图1A）。
      4. 使用两个血管夹（bulldog血管夹）阻断血管内的血流，以便进行静脉段取材。
      5. 分离一段15-20 mm长的EJV，用于获取自体囊袋。
      6. 结扎EJV的近端和远端。
      7. 用肝素化生理盐水（5,000 IU/L）冲洗取出的静脉段。
      8. 检查切除的EJV内腔，选择一段7-8 mm长且无静脉瓣的节段。
      9. 用7/0聚丙烯连续缝合线闭合该节段的一端，将其制成囊袋（图1B）。
      10. 将囊袋保持浸没在肝素化生理盐水中，直至使用。
      11. 确认结扎后的EJV无出血。
    2. 合成囊袋
      1. 从PTFE假体（直径6-8 mm，根据拟创建的动脉瘤大小而定）上截取一段1 cm长的节段。
      2. 用6/0聚丙烯血管缝合线闭合一端，再用血管胶封闭该闭合部位，防止缝合线处渗血。
      3. 在创建手术性动脉瘤前对这一合成移植物进行灭菌处理。
  3. 动脉瘤成形手术
    1. 为暴露CCA，分离皮下和脂肪组织并进行止血。
    2. 将右侧胸头肌从周围结缔组织中分离，并用Weitlaner牵开器牵开，以利于暴露CCA。
    3. 识别CCA。在暴露的CCA头侧和远端各放置一个硅胶血管环（图2A）。解剖5 cm长的血管段，用解剖器去除其外膜（图2B）。在该手术入路过程中，需注意避免损伤迷走神经，以防引起Horner综合征。
    4. 局部给予血管扩张剂（如1-2 mL的尼莫地平溶液，10 mg/50 mL），以预防血管痉挛。
    5. 在CCA交叉阻断前5分钟，静脉注射肝素（150 IU/kg）。
    6. 在CCA尾侧解剖段放置一个血管夹（bulldog血管夹），在头侧血管段4-5 cm处放置另一个bulldog血管夹（图2C）。
    7. 使用显微剪刀在两个bulldog血管夹之间的CCA上做一个8 mm长的椭圆形动脉切口（图2D）。
    8. 用肝素化生理盐水（5,000 IU/L）对CCA管腔内进行冲洗。
    9. 使用6/0聚丙烯连续缝合线将自体或合成囊袋缝合至椭圆形动脉切口（图3A、B）。在完成囊袋缝合前，冲洗远端和近端的血管夹。
    10. 在显微外科操作过程中，用温热的肝素化生理盐水保护血管及周围结构。
    11. 当假体或自体囊袋缝合至CCA后，检查有无渗血（图3C、D）。首先移除头侧的bulldog血管夹，然后移除尾侧的血管夹。
    12. 若缝合线处有出血，可用湿纱布加压止血。必要时可牵拉血管环，或重新放置bulldog血管夹，并在出血部位加缝止血缝线。如有需要，可在假体周围放置一块止血明胶海绵。
    13. 检查动脉瘤囊头侧CCA的搏动，以确认颈动脉通畅性已恢复正常。
    14. 使用2/0可吸收缝线逐层缝合手术切口，皮肤用0号不可吸收缝线行间断缝合。
    15. 术后最初24小时内，肌肉注射布托啡诺（10 µg/kg/12 h），并在手术后贴敷芬太尼透皮缓释贴剂（25 µg/h），以实现术后镇痛。
    16. 降低吸入的七氟烷浓度，同时增加新鲜气体流速（20 L/min），以促进动物苏醒。当动物恢复自主呼吸且生理参数（如血氧饱和度和心率）恢复正常后，拔除气管插管。
      注：新鲜气体为纯氧（100% O2）与医用空气（21% O2）的混合气体，最终吸入氧浓度为50%至45%（FiO2 = 0.5-0.45）。
    17. 在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。
    18. 将接受手术的动物与其他动物隔离，直至其完全恢复。

3. 血管造影检查与术后阶段

  1. 等待 24–48 小时，以避免损伤缝合线。
  2. 再次按照上述方法麻醉动物，并剃除腹股沟区域毛发。使用聚维酮碘消毒术区，并铺无菌巾。
  3. 采用改良的塞丁格技术，通过 6Fr 导入鞘管进入股动脉。
  4. 经股动脉鞘管，沿 0.035 英寸亲水导丝插入 5Fr 头端导管。在透视引导下，将导管推进至颈总动脉（CCA）起始处，随后撤出导丝。
  5. 通过头端导管注入造影剂（将碘酞酸酰胺用生理盐水稀释至 50%），以显示颈总动脉及其动脉瘤模型的影像。
  6. 当血管造影确认动脉瘤模型构建成功后，即可将动物模型用于科学研究或血管内治疗技术的培训。
  7. 研究或培训课程结束后，在深度麻醉状态下通过静脉注射致死剂量的氯化钾（2 mmol/kg）处死动物。

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结果

该技术已用于多种目的，包括研究弹簧圈栓塞后动脉瘤的愈合过程以及栓塞技术的培训。已使用静脉囊模型测试铂金弹簧圈与生物活性弹簧圈在愈合效果上的差异。静脉囊按上述方法缝合，在模型建立24小时后进行血管造影，以记录动脉瘤的大小和形态。所有猪均成功完成了血管内弹簧圈栓塞术。每例实验中，左侧动脉瘤使用生物活性弹簧圈填塞，对侧则使用纯铂金弹簧圈（图4A）。动物术后随访15天，期间进行血管造影以评估动脉瘤的闭塞情况。除一例显示栓塞不完全外，其余所有病例的动脉瘤均实现完全闭塞。

在培训课程之前，已使用合成囊袋来构建模型。在8只动物中共创建了12个动脉瘤（双侧n=4，单侧颈动脉n=4）。其中4只动物接受了双侧模型构建，所有操作均成功完成，未出现任何并发症。在模型手术期间以及动脉瘤成形后2天的血管内操作过程中，均未观察到死亡或神经血管事件。手术过程中未损伤迷走神经，且未在任何动物中诱发霍纳综合征（Horner´s syndrome）。此外，所有病例均未出现术后缝合假体部位的出血。在模型构建后2天进行颈总动脉（CCA）血管造影，以评估动脉瘤模型的...

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讨论

根据研究目的，有多种技术可用于建立动脉瘤动物模型。一些动脉瘤模型方案包括外科手术联合诱导高血压或血流动力学应激的方法，例如给予血管紧张素II、肾切除术或高盐饮食等，因为这些研究的主要目的是动脉瘤破裂的研究。然而，在本研究中，并未诱导上述条件，因为这些动物模型主要用于神经放射学培训或非破裂性动脉瘤的研究，例如新型血管内器械或操作技术的研究6。

在构建该动物模型的过程中，有两个关键步骤需要特别注意：颈总动脉（CCA）的分离和动脉鞘的缝合。在进行 CCA 分离时，若对该结构操作不够轻柔，常可能导致迷走神经损伤15。此外，该手术步骤还可能引发 CCA 血管痉挛。通过添加温热的生理盐水溶液并等待数分钟，可解决此问题。然而，若动脉鞘与 CCA 的缝合不当，则会导致出血并发症。手术过程中必须格外小心，避免将颈总动脉后壁纳入缝合范围，否则将导致 CCA 狭窄或闭塞。因此，术者必须具备良好的外科及显微外科操作技能，方可成功完成该手术9。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由 ICTS “NANBIOSIS” 完成，具体由 Jesús Usón 微创外科中心（JUMISC）的 U-21（实验手术室）、U-22（动物饲养室）和 U-24（医学影像部）实施。本工作得到 Carlos III 健康研究所（CB16/11/00494）和埃斯特雷马杜拉自治区经济、科学与数字议程部（GR21201）资助，并由欧洲区域发展基金"助力欧洲发展"共同资助。作者感谢动物饲养人员、实验技术人员以及 Joaquín González 在手术过程摄影方面所做的全部工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酰水杨酸Sanofi700693500 mg 片剂
碘羟拉酸Bayer Hispania914614.676% 造影剂
麻醉机Maquet Clinical Care AB6677200Maquet Flow-i C20
血管夹（Bulldog）Dimeda12.092.077.5 cm
丁丙诺啡Richter Pharma Ag5788160.3 mg/mL
氯吡格雷Sandoz70400575 mg 片剂
造影剂Bayer Hispania914614优维显 36%
分离钳Dimeda12.421.0121 cm
芬太尼透皮贴剂Kern Pharma664823透皮缓释贴片 25 µg/h
荧光透视设备Philips Medical SystemsVeradius Unity
止血明胶海绵Takeda Farmaceutica España, SA324459可吸收性止血剂，Espongostan
头猎导管Boston ScientificRF*YB15110M5 Fr 100 cm
肝素Rovi641639肝素 5%
亲水性导丝TerumoRF*GA35153M0.035” 150 cm
导引鞘TerumoRS*B60N10MQ6 Fr 10 cm
氯胺酮Richter Pharma Ag580395100 mg/mL
酮咯酸Laboratorios Normon, S.A.60307930 mg/mL
显微镊S&TJFA-5b (1:1)显微外科用镊
显微持针器S&TCurved C-14 (Art nº 00088)显微外科用持针器
显微剪刀S&TAdventitia SAS-15 R-8 (Art nº 00102)直型显微外科剪刀
持针器Dimeda24.114.1212 cm
尼莫地平Bayer Hispania, S.L64196910 mg/50 mL
聚维酮碘CV Medica193203聚维酮碘溶液（10%）
丙泊酚Orion Corporation58847510 mg/mL
聚四氟乙烯（PTFE）人工血管MaquetM00201501086B0合成人工血管 6 mm
瑞芬太尼Laboratorios Normon, S.A.6922952 mg
手术刀柄Dimeda06.104.0013.5 cm
剪刀（梅奥剪）Dimeda07.164.1414.5 cm
剪刀 （梅岑鲍姆剪）Dimeda07.287.1515 cm
手术刀片Dimeda06.122.0022
缝线：可吸收缝线MedtronicGL-1232/0
缝线：聚丙烯缝线Aragó378036/0 和 7/0
纱布垫Texpol1063.0120 x 20 cm
组织镊Dimeda10.102.11 /10.120.1111.5 cm
血管粘合剂Histoacryl Braun1050060组织粘合剂
血管环BraunB10952181.5 mm 直径
韦特兰牵开器Dimeda18.670.1414 cm

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