从山羊膝关节髌下脂肪垫中分离、扩增及诱导间充质干细胞分化

髌下脂肪垫来源的间充质干细胞，简称 IFP-MSCs，是一种相对研究较少的干细胞类型。本方案是一种简单、可靠且可重复的方法，用于从山羊膝关节中分离 IFP-MSCs。该技术的主要优势在于能够获得大量高质量的 IFP-MSCs。

分离得到的IFP-MSCs可分化为多种谱系，具有强大的再生潜能。由于其解剖学位置，IFP-MSCs在修复软骨缺损及缓解骨关节炎中的软骨退变方面受到广泛关注。该方法在组织工程与再生医学领域的细胞治疗中具有重要意义。

Dr. Sugata Hazra 和 Aman Mahajan 先生将演示IFP-MSCs的分离、扩增和分化步骤。开始分离髌下脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）时，将包含后肢股骨和胫骨区域约15厘米的山羊股胫关节置于无菌采样盒中收集。将样本储存于4°C条件下，运输至实验室以进行后续处理。

将样品置于150毫米的培养皿中，并确保在整个操作过程中于生物安全柜内无菌处理样品。用添加了抗生素的高压灭菌PBS充分冲洗样品。使用PBS保持样品湿润。

仔细检查样本的解剖区域。为便于操作，用一只手握住股骨的末端表面，用锋利的剪刀沿长骨纵向朝关节方向剪切，彻底去除长骨上的多余组织。随后，在不破坏关节囊周围组织的前提下，清除骨骼上的肌肉和脂肪组织。

同样，在样本的胫骨端做另一个切口，并去除胫骨上的肌肉和脂肪组织。确保两根长骨完全暴露，并且关节囊可见。接下来，从滑膜的两侧分别做切口，以打开关节腔。

使用新的无菌剪刀和镊子将髌骨从滑膜和髌韧带中游离出来。立即将分离的髌骨置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用剪刀和镊子从分离的髌骨上完全去除内表面存在的全部脂肪垫。

用手术刀将其收集到另一个干净的培养皿中并进行切碎，同时使用其他外科器械获取约两到三毫米的小脂肪片段。用刮勺将切碎的组织转移至50毫升离心管中，并在室温下用含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）通过试管混合器清洗15分钟，共清洗三次。

进行酶消化时，将约五克剪碎的组织置于含1.5毫克/毫升II型胶原酶和2%胎牛血清的低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，在37摄氏度孵育12至16小时。小心吸出消化后的组织，经70微米细胞滤筛过滤，以去除未消化的组织碎片。将滤液于15毫升离心管中以150 × g离心5分钟。

洗涤细胞沉淀前，先移除上清液，并用低糖DMEM洗涤细胞沉淀两次。将沉淀重悬于完全DMEM（也称为扩增培养基）中。将细胞接种至150毫米培养皿中，并在补充有5纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）和50微克/毫升L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的扩增培养基中进行培养。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育，以促进细胞贴壁和增殖。每天观察细胞的贴附和生长情况。为妥善维持和扩增IFP-MSCs，每三天更换一次培养基。

换液时，直接向培养皿中加入新鲜的5纳克/毫升bFGF和50微克/毫升的2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。当细胞融合度达到80%至90%时，通过移除培养皿中的扩增培养基，并用1×PBS洗涤细胞，进行传代培养。随后向培养皿中加入4毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育细胞。

四分钟后，轻敲培养板侧面以使细胞脱落。在显微镜下确认所有细胞完全脱离。确认后，加入等体积的扩增培养基以中和胰蛋白酶。

使用移液器将这些解离的细胞收集到一个新的15毫升聚丙烯离心管中，在室温下以150 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于所需体积的扩增培养基中。采用标准细胞计数方法对细胞进行计数，并以每平方厘米10,000个细胞的接种密度，将细胞传代至150毫升培养皿中进行进一步扩增。

所有实验均使用第2至第5代（P2至P5）的融合单层细胞。当扩增的细胞达到80%至90%融合度时，使用胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞解离，随后在15毫升离心管中以150 × g离心5分钟收集细胞。然后将细胞沉淀重悬于山羊血浆中，细胞密度为每50微升含200万个细胞。将含有细胞的50微升血浆加入灭菌的90毫米培养皿中，随后加入氯化钙，使其终浓度为0.3%。充分混匀，以制备交联血浆水凝胶。

将制备的水凝胶在37摄氏度下孵育40分钟后，将水凝胶转移至含有软骨诱导培养基的24孔组织培养板中。每三天更换一次培养基，持续14天。在不含TGF-beta 1的完全DMEM培养基中培养的水凝胶作为未诱导对照组。

细胞在血浆水凝胶中进行14天软骨向分化后，用PBS洗涤水凝胶三次，每次五分钟，并将样品置于中性缓冲甲醛中固定三小时。分离得到的IFP-MSCs在体外培养24小时内均匀贴壁并呈现伸长的形态。细胞在扩增六天内高效增殖至80%至90%融合度，并表现出克隆形成能力，表明其具有高效的增殖和自我更新能力。

经诱导向成脂细胞系分化后，分离得到的细胞形成了脂滴，通过第14天和第21天的油红O染色证实了这一点。而在未添加成脂诱导因子的细胞中则未观察到此类脂滴。在诱导组中，包埋于血浆水凝胶中的分离细胞在培养14天后形成了白色且有光泽的新组织，显示出成软骨潜能。

未诱导组的组织呈淡白色，光泽度降低。此外，诱导组的组织经阿利新蓝（Alcian Blue）和番红O（Safranin O）组织学染色呈阳性，表明细胞能够分泌硫酸化糖胺聚糖，这是软骨基质的主要成分之一。相比之下，未诱导组的水凝胶切片在番红O和阿利新蓝染色中均呈阴性，证实间充质干细胞仅在软骨诱导刺激存在时才具有软骨向分化潜能。

经成骨诱导培养基诱导的分离细胞在14天结束时显示出碱性磷酸酶阳性染色，证实了矿化作用的发生。经过28天的成骨诱导后，通过茜素红S染色观察到钙化沉积物。结果强调了诱导细胞向脂肪源性、软骨源性和成骨源性谱系分化的潜能。

必须在无菌条件下处理样本，以避免污染。同时，准确识别髌骨的正确位置也非常重要。该方法为分离多种细胞类型（如关节软骨细胞、韧带成纤维细胞以及滑膜和滑液来源的干细胞）提供了途径，在再生医学领域具有广泛的应用前景。

采用该技术分离获得IFP-MSCs后，特别针对其在软骨、骨和韧带等肌肉骨骼组织再生中的有效性进行了研究，研究采用了支架和无支架两种方法。