Name: 山羊窒息关节髌下脂肪垫间充质干细胞的分离、扩增和分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解从山羊窒息关节分离、扩增和分化髌下脂肪垫间充质干细胞(IFP-MSCs)的可靠方法。该技术可获取大量高质量干细胞，具有多向分化潜能，适用于组织工程和再生医学中的软骨修复研究。

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SH 感谢印度坎普尔理工学院（IIT Kanpur）提供的学院博士后奖学金以及印度科学技术部（DST，种子计划部）SYST 项目（SP/YO/618/2018）的资助。AM 感谢印度坎普尔理工学院（IIT-Kanpur）提供的学院奖学金。DSK 感谢 Gireesh Jankinath 讲席教授职位以及印度生物技术部的资金支持（BT/PR22445/MED/32/571/2016）。AM、SH 和 DSK 感谢印度坎普尔理工学院（IIT-Kanpur）Mehta 家族工程与医学研究中心提供的大力支持。

该方案基于从山羊中分离滑膜脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）。山羊的滑膜脂肪垫和血液样本取自当地屠宰场。由于此类组织采集不属于机构动物伦理委员会的审查范围，因此无需获得伦理批准。
1. 从山羊膝关节的股胫关节中分离IFP-MSCs
<ol>
	<li>采集包含后肢股骨和胫骨区域各约15 cm的山羊股胫关节（样本）。立即将样本放入无菌的样本收集盒中，并在4 °C下保存，运输至实验室进行后续处理。在生物安全柜中使用无菌外科器械对样本进行无菌操作（图1，步骤1）。</li>
	<li>将样本置于150 mm的培养皿中，用添加抗生素的高压灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗（含5 µg/mL两性霉素B、200 U/mL青霉素-链霉素和50 µg/mL环丙沙星），以避免污染。始终确保使用PBS保持样本湿润。</li>
	<li>仔细检查样本的解剖区域。为便于接触关节囊，需完全去除两根长骨上的多余组织（图1，步骤2）。</li>
	<li>为此，首先用一只手固定股骨末端，用锋利的剪刀沿纵向向关节处剪开。在此过程中去除骨骼周围的肌肉和脂肪组织。注意在初始阶段不要扰动紧邻关节囊的组织。</li>
	<li>同样地，在样本的胫骨端做另一切口，并去除胫骨上的肌肉和脂肪组织。确保在此步骤后两根长骨完全暴露，且关节囊清晰可见（图1，步骤3）。</li>
	<li>接下来，从滑膜两侧做切口，打开关节面（图1，步骤4）。使用新的一次性无菌剪刀和镊子将髌骨从滑膜和髌韧带中游离出来。立即将分离的髌骨置于含有PBS的培养皿中（图1，步骤5）。</li>
	<li>使用剪刀和镊子去除髌骨内表面存在的全部脂肪垫，并将脂肪垫收集至另一个新的培养皿中（图1，步骤6）。用手术刀将收集的脂肪垫切碎。根据需要可配合其他外科器械（如剪刀或手术刀片），尽可能将脂肪切成约2–3 mm的小块或片段。 
	注意：充分切碎对获得高细胞得率至关重要。在整个分离过程中务必保持组织湿润，切勿使其干燥。</li>
	<li>用刮勺将切碎的组织转移至50 mL离心管中，加入含抗生素的PBS，在室温（RT）下于试管混合器中洗涤15分钟。重复洗涤3次，每次15分钟。</li>
	<li>进行酶消化时，将切碎的组织（约5 g）与20 mL含1.5 mg/mL II型胶原酶的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM低糖）混合，并添加2%胎牛血清（FBS），在37 °C下孵育12–16小时。 
	注意：在试管混合器中以约每分钟15转（RPM）的速度进行消化。</li>
	<li>小心吸取消化后的组织，通过70 µm细胞筛过滤，以去除未消化的组织。将滤液在15 mL离心管中以150 × g离心5分钟。弃去上清液，并用DMEM低糖培养基至少洗涤沉淀2次。 
	注意：将消化后的组织缓慢倒入筛网中，以防溢出。使用小容量离心管（15 mL）有助于获得良好的沉淀。</li>
	<li>将获得的细胞沉淀重悬于完全DMEM培养基中（DMEM低糖培养基添加10% FBS及抗生素[2.5 µg/mL两性霉素B、100 U/mL青霉素-链霉素和25 µg/mL环丙沙星]），后续步骤中该培养基称为扩增培养基。</li>
	<li>将细胞接种于150 mm培养皿中，在扩增培养基中添加5 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和50 µg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐进行培养。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育，以促进细胞贴壁和增殖。每日监测细胞的贴附和生长情况。</li>
</ol>
2. 分离细胞的维持与扩增
<ol>
	<li>每3天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。每次更换培养基时，直接向培养皿中添加新鲜的5 ng/mL bFGF和50 µg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。当细胞汇合度达到80%-90%时，进行细胞传代。
	 
	注意：每次更换培养基时，去除未贴壁的成分。若在培养3天后观察到油滴，用1× PBS洗涤细胞，然后向培养皿中加入新鲜培养基。在每次更换培养基前均用PBS洗涤，直至油滴完全清除。</li>
	<li>细胞传代：从培养皿中移除扩增培养基，并用1× PBS洗涤细胞一次。向培养皿中加入4 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4分钟。
	 
	注意：通常在7天内达到80%-90%的汇合度。胰蛋白酶消化过程中，应将胰蛋白酶/EDTA溶液均匀覆盖整个培养皿表面。</li>
	<li>轻敲培养皿侧面使细胞脱落，并在显微镜下观察以确认所有细胞均已脱离。加入等体积（4 mL）的扩增培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>用移液器收集解离后的细胞至新的15 mL聚丙烯离心管中，在室温下以150 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于所需体积的扩增培养基中。</li>
	<li>采用标准细胞计数方法对细胞进行计数，并以1 × 104 cells/cm2的接种密度将细胞传代至150 mm培养皿中进行进一步扩增。所有实验均应使用第2至第5代（P2-P5）的汇合单层细胞。
	 
	&#8203;注意：将多余的细胞进行冻存保存。</li>
</ol>
3. 采用集落形成实验（CFU-F）评估IFP-MSCs的克隆形成能力
<ol>
	<li>进行CFU-F实验时，将细胞以50-100个细胞/cm2的接种密度接种于6孔组织培养板中，加入扩增培养基，使终体积为3 mL。 
	注意：根据实验和处理条件优化细胞浓度。</li>
	<li>在标准培养条件下，于37 °C、5% CO2培养箱中培养12天，使细胞形成克隆。每3天更换一次培养基，换液时操作需轻柔。</li>
	<li>培养12天后，用PBS冲洗克隆1次，再于室温下用20%甲醇固定20分钟。随后用结晶紫染料（0.5% [w/v] 溶于20%甲醇）在室温下染色20分钟。使用倒置显微镜计数单个克隆。 
	&#8203;注意：克隆定义为包含超过50个细胞的细胞簇。</li>
</ol>
4. IFP-MSCs 的分化潜能
<ol>
	<li>诱导 IFP-MSCs 的脂肪向分化
	<ol>
		<li>为诱导脂肪生成，将细胞以 25 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于 24 孔组织培养板中。加入培养基使最终体积达到 500 µL。在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养细胞。</li>
		<li>细胞汇合后一天，用 500 µL 脂肪向分化培养基替换扩增培养基。细胞通常需要约 2 天达到汇合状态。</li>
		<li>通过在扩增培养基（DMEM + 10% FBS + 2.5 µg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 µg/mL 环丙沙星）中添加 25 mM D-(+)-葡萄糖、10 µg/mL 胰岛素、1 µM 地塞米松和 100 µM 吲哚美辛，配制脂肪向分化培养基。 
		注意：分化培养基在 4 °C 下保存超过 1 个月后不稳定；因此应根据需要现配现用。</li>
		<li>将使用添加了 25 mM D-(+)-葡萄糖的扩增培养基培养的细胞作为未诱导对照组。每 3 天更换一次培养基，持续 14 天。14 天结束后，用 PBS 洗涤细胞 1 次。使用中性缓冲福尔马林（NBF；PBS 中含 4% 甲醛）在 4 °C 下固定细胞 15 分钟。</li>
		<li>固定后，用蒸馏水洗涤孔板 1 次，然后在室温下用 60% 异丙醇孵育细胞 5 分钟。去除异丙醇后，加入 500 µL 油红 O 工作液，在室温下孵育 5 分钟以染色脂滴。用蒸馏水洗涤孔板 1 次以去除未结合的染料，并使用倒置显微镜观察细胞。 
		注意：油红 O（ORO）储备液的配制方法为将 300 mg ORO 溶解于 100 mL 99% 异丙醇中。工作液的配制方法为取 3 份储备液与 2 份蒸馏水混合，在室温下搅拌 10 分钟。使用 0.2 µm 滤纸过滤混合液，即可使用。储备液可在避光条件下室温保存 1 个月，而工作液需每次使用前新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导 IFP-MSCs 的软骨向分化
	<ol>
		<li>山羊血浆的分离：
		<ol>
			<li>用蒸馏水配制 3.4%（w/v）柠檬酸钠溶液。取 5 mL 配制好的柠檬酸钠溶液加入 50 mL 离心管中。</li>
			<li>将 45 mL 新鲜采集的山羊血液收集至同一离心管中。立即倾斜离心管，充分混匀血液与柠檬酸钠，防止凝固，并在 4 °C 下运送至实验室。</li>
			<li>在 4 °C 下以 1000 × g 离心 20 分钟，收集山羊血液。在生物安全柜内将上清液（血浆）转移至新离心管中。通过 0.2 µm 滤膜过滤血浆，分装后于 -20 °C 保存备用。 
			注意：操作过程中应保持样品温度在 2–8 °C。应尽量减少血浆的冻融次数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将扩增后的细胞培养至 80%–90% 汇合度，用胰蛋白酶/EDTA 溶液消化细胞，并在 15 mL 离心管中以 150 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于山羊血浆中，密度为每 50 µL 血浆溶液含 2 × 106 个细胞。</li>
		<li>将含细胞的血浆液滴（50 µL）加至灭菌的 90 mm 培养皿中，然后加入氯化钙至终浓度为 0.3%（w/v）。充分混匀以制备交联血浆水凝胶。</li>
		<li>将制备好的水凝胶在 37 °C 下孵育 40 分钟。孵育结束后，将水凝胶转移至含有软骨向分化培养基的 24 孔组织培养板中。</li>
		<li>通过在低糖 DMEM 培养基中添加 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1.25 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、1 mM 脯氨酸、50 µg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、100 nM 地塞米松、1× 胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠 + 亚油酸-BSA（ITS+1）、抗生素（2.5 µg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 µg/mL 环丙沙星）以及 10 ng/mL 转化生长因子-β1（TGF-β1），配制软骨向分化培养基。</li>
		<li>将使用完全 DMEM 培养基（低糖 DMEM 加 10% FBS 及抗生素 [2.5 µg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 µg/mL 环丙沙星]）但不含 TGF-β1 的水凝胶作为未诱导对照组。每 3 天更换一次培养基，持续 14 天。</li>
		<li>细胞在血浆水凝胶中进行软骨向分化 14 天后，用 PBS 洗涤水凝胶 3 次，每次 5 分钟，然后用 NBF 固定 3 小时。 
		警告：甲醛为潜在致癌物，吸入后可能引起鼻、喉和肺部刺激。所有涉及甲醛的操作均应在通风橱中进行。</li>
		<li>去除 NBF，用 PBS 洗涤水凝胶 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下用 35%（w/v）蔗糖溶液孵育过夜，使溶液完全渗透入样品。将水凝胶在最佳切片温度（OCT）包埋剂中平衡 3 小时。使用硅胶模具在液氮中将样品包埋于 OCT 包埋剂中。</li>
		<li>使用冷冻切片机在明胶包被的载玻片上将样品切成 10–12 µm 厚的切片，并于 -20 °C 保存以备后续使用。为检测软骨向分化后细胞外基质的存在或沉积情况，使用阿利新蓝（Alcian Blue）和番红 O（Safranin-O）染料对切片进行染色，这两种染料可结合硫酸化糖胺聚糖。 
		注意：阿利新蓝染料的配制方法为将 1 g 阿利新蓝溶解于 100 mL 0.1 N HCl 中，在试管混合器中充分混匀过夜。溶液可在避光条件下室温保存 1 个月。番红 O 染料的配制方法为将 0.1 g 番红 O 溶解于 100 mL 蒸馏水中，在试管混合器中充分混匀过夜。</li>
		<li>进行阿利新蓝染色时，用蒸馏水洗涤水凝胶切片 1 次，每次 5 分钟。为固定切片，向载玻片上加入 4% NBF 并孵育 30 分钟。</li>
		<li>用蒸馏水洗涤切片 1 次，每次 5 分钟，再用 0.1 N HCl 洗涤 2 次，每次 30 秒。去除 HCl 后，用纸巾轻轻吸干载玻片。加入配制好的阿利新蓝染液，在 37 °C 湿润环境中孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 0.1 N HCl 洗去未结合染料，再用蒸馏水洗涤 3 分钟。依次用无水乙醇脱水、二甲苯透明，最后用树脂介质封片以便成像。</li>
		<li>进行番红 O 染色时，用蒸馏水洗涤水凝胶切片 1 次，每次 5 分钟。为固定切片，向载玻片上加入 4% NBF 并孵育 30 分钟。用蒸馏水洗涤切片 1 次，每次 5 分钟，然后将载玻片浸入 1% 乙酸中 10–15 秒。用纸巾轻轻吸干载玻片。</li>
		<li>向切片上加入配制好的番红 O 染液，在室温下孵育 10 分钟。用 100% 乙醇洗去未结合染料。将载玻片浸入 100% 乙醇中 5 分钟。自然晾干后，用二甲苯透明，最后用树脂介质封片以便成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导 IFP-MSCs 的成骨向分化
	<ol>
		<li>为诱导成骨向分化，按前述方法（步骤 2.2）用胰蛋白酶消化细胞。将细胞以 3 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于 24 孔组织培养板中。加入培养基使最终体积达到 500 µL。在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养细胞。接种后 1 天，用 500 µL 成骨向分化培养基替换扩增培养基。</li>
		<li>通过在扩增培养基（DMEM + 10% FBS + 2.5 µg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 µg/mL 环丙沙星）中添加 25 mM D-(+)-葡萄糖、10 nM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠、50 µg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐和 10 nM 维生素 D3，配制成骨向分化培养基。 
		注意：将使用添加了 25 mM D-(+)-葡萄糖的扩增培养基培养的细胞作为未诱导对照组。</li>
		<li>每 3 天更换一次成骨向分化培养基，持续 14 天或 28 天。14 天结束后，通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨程度。 
		注意：ALP 染色底物的配制方法为将一片 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）/硝基蓝四氮唑（NBT）片剂溶解于 10 mL 蒸馏水中，置于 15 mL 离心管中，待其完全溶解后即可使用。由于底物溶液不能长期保存，可根据需要将片剂掰成半片并溶于 5 mL 蒸馏水中。裂解缓冲液的配制方法为向蒸馏水中加入 Tris 缓冲液（100 mM）和氯化镁（5 mM），再加入 Triton X-100（0.1%）并使其溶解，调节溶液 pH 至 9.25–9.75。</li>
		<li>进行 ALP 染色时，在诱导 14 天后去除培养基，用 PBS 洗涤细胞。使用 NBF（4%）固定细胞 1 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞，并用配制好的裂解缓冲液通透 2–3 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入 500 µL 配制好的底物溶液，根据表达水平孵育 15 分钟至 1 小时。期间可观察紫色/蓝色显色情况。</li>
		<li>去除底物溶液，用蒸馏水洗涤。使用倒置显微镜观察染色后的细胞。</li>
		<li>28 天结束后，通过茜素红 S（Alizarin Red-S）染色检测成骨诱导后的钙化程度。 
		注意：茜素红 S 染色液（40 mM）的配制方法为将 2 g 茜素红 S 溶解于 100 mL 蒸馏水中，用 HCl 或 NH4OH 调节 pH 至 4.1–4.3。通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并在避光条件下 4 °C 保存。溶液 pH 至关重要，因此建议使用新鲜配制溶液，或若溶液存放超过 1 个月，应重新测定 pH。</li>
		<li>进行茜素红 S 染色时，在诱导 28 天后去除培养基，用冷 PBS 洗涤细胞 1 次。使用 70% 乙醇在 4 °C 下固定细胞 1 小时。</li>
		<li>去除固定液，用蒸馏水洗涤细胞 2 次。彻底去除水分后，向每孔加入 1 mL 茜素红 S 溶液。</li>
		<li>在室温下孵育 1 小时，使用倒置显微镜观察细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在本实验方案中，提供了一种简单、可靠且可重复的从山羊髌下脂肪垫（IFP）中分离间充质干细胞（MSCs）的方法。利用该方法分离的细胞已在我们先前的研究中成功应用 体外 组织再生。观察到分离的细胞具有增殖能力，对多种生长因子有响应性，并在接种于电纺纤维和支架上时仍保持其生物学活性25,26此外，研究发现，可获得大量高质量的间充质干细胞，并将其与软骨细胞在可注射水凝胶中进行共培养，以构建关节软骨。 体外27,28,29尽管分离和提取细胞的步骤较为简单，但为了成功从髌下脂肪垫（IFP）中分离并扩增间充质干细胞（MSCs），有几个关键步骤必须严格遵循。首先，由于从屠宰场运送样本的过程中无法维持真正的无菌条件，因此建议在开始分离操作前，用70%乙醇擦拭组织外表面，以对组织进行表面消毒。下一步关键操作是从膝关节中分...

间充质干细胞（MSCs）是再生医学中基于细胞治疗的理想候选细胞1,2。它们可从多种组织来源获取，例如骨髓、脐带、胎盘、牙髓和皮下脂肪组织3。然而，由于成体中干细胞的数量有限，且其分离过程常具侵入性（可能导致供体部位并发症），因此亟需一种可克服上述挑战的替代性干细胞来源。
膝关节是多种细胞类型的储存库，例如髌下脂肪垫来源的间充质干细胞（MSCs）、滑膜组织来源的间充质干细胞、滑液来源的间充质干细胞、韧带成纤维细胞、关节软骨细胞等4,5,6。这些细胞在基于肌肉骨骼组织工程的研究中具有广泛的应用潜力。因此，膝关节可能是获取多种类型间充质干细胞的可行且可靠的来源。位于膝关节内的脂肪组织，即髌下脂肪垫（IFP）或称Hoffa脂肪垫，是一种具有前景且可替代的MSC来源。IFP是一种相对易于获取且临床可获得的MSC来源，因为在膝关节镜手术或开放性膝关节手术中，它通常被常规切除并作为手术废弃物丢弃。IFP的切除与较低的供区并发症风险相关，这使其成为一种极具吸引力的组织来源。尽管IFP-MSCs具有与骨髓来源间充质干细胞（BM-MSCs）相似的表型特征，但其克隆形成能力优于BM-MSCs6，增殖能力也强于皮下脂肪来源的干细胞（ADSCs）7。有趣的是，与滑液来源的MSCs（SF-MSCs）相比，IFP-MSCs在后期传代过程中不会丧失其增殖能力，倍增时间也不会随传代增加而延长。这表明，在细胞扩增过程中，IFP-MSCs能够在不牺牲其增殖速率的前提下，获得足够数量的细胞用于体外in vitro组织工程应用8。近期研究还表明，IFP-MSCs的软骨向分化潜能优于骨髓来源的MSCs（BMSCs）和脂肪来源的MSCs（ADSCs），这可能与其解剖位置邻近关节软骨有关，提示其在软骨组织工程中的适用性6,7,9,10。此外，它们还具有与年龄无关的成骨分化潜能11。已有研究表明，向关节内注射IFP-MSCs可减轻骨关节炎（OA）患者的疼痛，并改善膝关节功能12,13。此外，在病理条件下，当存在炎症细胞因子时，IFP-MSCs表现出强烈的免疫抑制反应及增强的免疫调节特性也已有报道6。
IFP-MSCs 是一种具有前景且可替代的间充质干细胞来源；然而，其在组织工程与再生医学中的治疗潜力相对而言研究较少。目前关于 IFP-MSCs 的研究主要使用来自人类供体的细胞。其中，少数近期研究探讨了来自健康人类供体（非关节炎患者，年龄 17–60 岁）的 IFP-MSCs6,14，而大多数研究使用的是接受全膝关节置换手术的老年患者（患有疾病的患者，年龄70-80岁）的关节滑膜间充质干细胞（IFP-MSCs）。由于年龄和疾病均已被证实会影响干细胞的正常功能（细胞数量减少及功能潜力丧失），这可能导致基于间充质干细胞的研究结果出现不一致。7,15,16,17此外，使用来自患有病理生理状况（如关节炎和肥胖）患者的IFP-MSCs，也给理解健康细胞的基本特性带来了困难。 体外，从而成为基于MSCs的治疗策略发展的限制因素。为克服这些问题，使用来自健康供体的IFP-MSCs至关重要。由于获取健康人供体存在困难，动物模型可能是一种更优的替代方案。在这方面，已有少数研究从小鼠中分离出IFP18然而，由于正常小鼠脂肪垫体积较小，需合并多只动物的脂肪组织才能获得足够的样本量以进行复杂的实验操作19因此，需要一种大型动物模型，既能满足对较大量细胞的需求，又能同时符合动物研究中的3R原则（优化、替代和减少）。20大型动物的使用在转化研究中具有重要意义。特别是在肌肉骨骼组织工程领域，已对狗、猪、羊、山羊和马等多种大型动物进行了研究。21. 山羊（Capra aegagrus hircus是一种理想的大型动物模型，因其膝关节（stifle joint）的解剖结构与人类膝关节最为接近22,23,24山羊的软骨下骨小梁结构及软骨下骨厚度与人类相似，且其软骨与骨的比例也被报道与人类相近21此外，山羊在全球范围内已被广泛驯化，骨骼成熟个体易于获取。加之其维护成本低、易于操作，使其成为研究中颇具吸引力的动物模型。22.
本研究中，建立了一种从膝关节分离滑膜脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）的简易方案 Capra aegagrus hircus （山羊）和 体外 展示了这些细胞扩增与分化的培养条件。分离得到的细胞具有贴壁生长特性，形态类似间充质干细胞（MSC），可形成成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）集落，并具备向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化的潜能。因此，髌下脂肪垫来源的间充质干细胞（IFP-MSCs）在生物医学应用中具有作为MSC替代来源的潜力。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-10G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA</td><td>Hi-Media</td><td>TCL049</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 离心管</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)</td><td>HiMedia</td><td>TCL021-50ml</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>50-mL 离心管</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿利新蓝</td><td>Hi-Media</td><td>RM471</td><td>用于硫酸化糖胺聚糖染色</td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>26048-25G</td><td>用于钙沉积检测</td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>HiMedia</td><td>A011</td><td>2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)</td><td>Sino Biologicals</td><td>10014-HNAE</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>BCIP/NBT ALP 显色底物</td><td>Sigma</td><td>B5655-5TAB</td><td>用于 ALP 染色</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>HiMedia</td><td>MB-083</td><td>全称：牛血清白蛋白 (1.25 mg/mL)</td></tr><tr><td>细胞滤器</td><td>HiMedia</td><td>TCP-182</td><td>70 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>离心机</td><td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>RANBAXY LAB. Limited</td><td>B17407T1</td><td>2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>42555</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>1.94925.0521</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>DMEM LG</td><td>SIGMA</td><td>D5523</td><td>全称：低糖杜尔贝cco改良伊格尔培养基 (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Media Low Glucose)</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>全称：胎牛血清 (Fetal Bovine Serum)</td></tr><tr><td>甲醛溶液 37%-41%</td><td>Merck</td><td>61780805001730</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS + 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2521-5mL</td><td>全称：胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠 + 亚油酸-BSA</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>HiMedia</td><td>TO-109-25G</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>61751605001730</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Meck</td><td>1.07018.2521</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器及无菌吸头 (20 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 1000 &amp;micro;L)</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUSE 细胞分析仪</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>全称：最佳切割温度 (Optimal Cutting Temperature)</td></tr><tr><td>油红 O 染料</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>54304</td><td>用于脂滴染色</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>HiMedia</td><td>A007</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>培养皿 (150 mm 和 90 mm)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>番红 O</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>50240</td><td>用于硫酸化糖胺聚糖染色</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3434</td><td>3.4 % (w/v)</td></tr><tr><td>无菌剪刀、镊子和手术刀</td><td></td><td></td><td>用于 IFP-MSC 的分离</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>1.94953.0521</td><td>35 % (w/v)</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>Sino Biologicals</td><td></td><td>全称：转化生长因子-&amp;beta;1 (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>组织培养箱 37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>Merck</td><td>61771405001730</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>40632</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td>1.5 mg/mL</td></tr><tr><td>维生素 D3</td><td>Sigma</td><td>C9756-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>孔板 (6 孔板和 24 孔板)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从山羊膝关节髌下脂肪垫中分离、扩增及诱导间充质干细胞分化

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

膝关节内的髌下脂肪垫（IFP）是间充质干细胞（MSCs）的一个有前景的来源。IFP是一种易于获取的组织，因为在关节镜手术和膝关节置换术中 routinely 被切除并丢弃。此外，其切除与较低的供区并发症发生率相关。近期研究表明，IFP来源的MSCs在培养过程中不会丧失其增殖能力 体外 扩增能力，并具有与年龄无关的成骨分化潜能。与骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）和脂肪来源干细胞（ADSCs）相比，IFP-MSCs表现出更优越的软骨分化潜能。尽管这些细胞易于从老年及患病患者中获取，但其功能效果有限。因此，使用健康供体来源的IFP-MSCs对于评估其在生物医学应用中的有效性至关重要。由于获取健康人源供体存在困难，动物模型可能是更理想的替代方案，有助于深入理解其生物学特性。犬、马、绵羊和山羊等大型动物在转化医学研究中发挥着关键作用。其中，山羊可能是更优选的模型，因为山羊的膝关节（stifle joint）在解剖结构上最接近人类膝关节。此外，山羊关节内脂肪垫（goat-IFP）能够提供组织再生应用所需的较高数量的间充质干细胞。再加上成本较低、易于获得以及符合动物实验的3R原则，使其成为一种极具吸引力的实验模型。本研究展示了一种从山羊膝关节中分离IFP-MSCs的简便方案 体外 用于扩增和分化的培养条件。无菌分离山羊的IFP组织，经洗涤、剪碎并进行酶消化处理。经过滤和离心后，收集细胞进行培养。这些细胞具有贴壁生长特性，形态类似间充质干细胞（MSCs），并表现出显著的克隆形成能力。此外，它们可向脂肪、软骨和成骨细胞谱系分化，证实其多向分化潜能。综上所述，本研究证明了MSCs的分离与扩增，这些细胞在组织工程和再生医学应用中具有潜在价值。

从山羊股胫关节分离滑膜脂肪垫间充质干细胞 
从山羊膝关节中分离IFP-MSCs的步骤如图所示 图1去除髌骨内侧非关节面存在的脂肪垫，将其切碎并进行酶消化处理。成功分离并培养了髌下脂肪垫来源的间充质干细胞（IFP-MSCs）。 体外 (图2A).
IFP-MSCs的扩增与克隆形成能力 
分离的细胞进行培养 体外 在扩增培养基中，细胞在接种后12小时内开始贴附于组织培养板，第0天时多呈圆形。24小时内细胞均匀贴壁，并伸展为长梭形形态，该形态在后续培养过程中保持稳定。细胞在体外培养中增殖能力良好，扩增6天后达到80%–90%汇合度。图 2A）。此外，通过成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）实验评估，分离获得的细胞表现出集落形成能力（图2B...

髌下脂肪垫间充质&#160;干细胞（IFP-MSCs）可从膝关节髌下脂肪垫中轻松分离，且具有良好的增殖能力 体外，形成CFU-F集落，并可分化为脂肪源性、软骨源性和成骨源性谱系。本文提供了从山羊膝关节内脂肪垫分离、扩增及诱导分化IFP-MSCs的方法学。

膝关节内的髌下脂肪垫（IFP）是间充质干细胞（MSCs）的一个理想来源。IFP是一种易于获取的组织，因其在常规手术中常被切除并丢弃……

髌下脂肪垫来源的间充质干细胞，简称 IFP-MSCs，是一种相对研究较少的干细胞类型。本方案是一种简单、可靠且可重复的方法，用于从山羊膝关节中分离 IFP-MSCs。该技术的主要优势在于能够获得大量高质量的 IFP-MSCs。分离得到的IFP-MSCs可分化为多种谱系，具有强大的再生潜能。由于其解剖学位置，IFP-MSCs在修复软骨缺损及缓解骨关节炎中的软骨退变方面受到广泛关注。该方法在组织工程与再生医学领域的细胞治疗中具有重要意义。Dr. Sugata Hazra 和 Aman Mahajan 先生将演示IFP-MSCs的分离、扩增和分化步骤。开始分离髌下脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）时，将包含后肢股骨和胫骨区域约15厘米的山羊股胫关节置于无菌采样盒中收集。将样本储存于4°C条件下，运输至实验室以进行后续处理。将样品置于150毫米的培养皿中，并确保在整个操作过程中于生物安全柜内无菌处理样品。用添加了抗生素的高压灭菌PBS充分冲洗样品。使用PBS保持样品湿润。仔细检查样本的解剖区域。为便于操作，用一只手握住股骨的末端表面，用锋利的剪刀沿长骨纵向朝关节方向剪切，彻底去除长骨上的多余组织。随后，在不破坏关节囊周围组织的前提下，清除骨骼上的肌肉和脂肪组织。同样，在样本的胫骨端做另一个切口，并去除胫骨上的肌肉和脂肪组织。确保两根长骨完全暴露，并且关节囊可见。接下来，从滑膜的两侧分别做切口，以打开关节腔。使用新的无菌剪刀和镊子将髌骨从滑膜和髌韧带中游离出来。立即将分离的髌骨置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用剪刀和镊子从分离的髌骨上完全去除内表面存在的全部脂肪垫。用手术刀将其收集到另一个干净的培养皿中并进行切碎，同时使用其他外科器械获取约两到三毫米的小脂肪片段。用刮勺将切碎的组织转移至50毫升离心管中，并在室温下用含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）通过试管混合器清洗15分钟，共清洗三次。进行酶消化时，将约五克剪碎的组织置于含1.5毫克/毫升II型胶原酶和2%胎牛血清的低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，在37摄氏度孵育12至16小时。小心吸出消化后的组织，经70微米细胞滤筛过滤，以去除未消化的组织碎片。将滤液于15毫升离心管中以150 × g离心5分钟。洗涤细胞沉淀前，先移除上清液，并用低糖DMEM洗涤细胞沉淀两次。将沉淀重悬于完全DMEM（也称为扩增培养基）中。将细胞接种至150毫米培养皿中，并在补充有5纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）和50微克/毫升L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的扩增培养基中进行培养。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育，以促进细胞贴壁和增殖。每天观察细胞的贴附和生长情况。为妥善维持和扩增IFP-MSCs，每三天更换一次培养基。换液时，直接向培养皿中加入新鲜的5纳克/毫升bFGF和50微克/毫升的2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。当细胞融合度达到80%至90%时，通过移除培养皿中的扩增培养基，并用1×PBS洗涤细胞，进行传代培养。随后向培养皿中加入4毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育细胞。四分钟后，轻敲培养板侧面以使细胞脱落。在显微镜下确认所有细胞完全脱离。确认后，加入等体积的扩增培养基以中和胰蛋白酶。使用移液器将这些解离的细胞收集到一个新的15毫升聚丙烯离心管中，在室温下以150 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于所需体积的扩增培养基中。采用标准细胞计数方法对细胞进行计数，并以每平方厘米10,000个细胞的接种密度，将细胞传代至150毫升培养皿中进行进一步扩增。所有实验均使用第2至第5代（P2至P5）的融合单层细胞。当扩增的细胞达到80%至90%融合度时，使用胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞解离，随后在15毫升离心管中以150 × g离心5分钟收集细胞。然后将细胞沉淀重悬于山羊血浆中，细胞密度为每50微升含200万个细胞。将含有细胞的50微升血浆加入灭菌的90毫米培养皿中，随后加入氯化钙，使其终浓度为0.3%。充分混匀，以制备交联血浆水凝胶。将制备的水凝胶在37摄氏度下孵育40分钟后，将水凝胶转移至含有软骨诱导培养基的24孔组织培养板中。每三天更换一次培养基，持续14天。在不含TGF-beta 1的完全DMEM培养基中培养的水凝胶作为未诱导对照组。细胞在血浆水凝胶中进行14天软骨向分化后，用PBS洗涤水凝胶三次，每次五分钟，并将样品置于中性缓冲甲醛中固定三小时。分离得到的IFP-MSCs在体外培养24小时内均匀贴壁并呈现伸长的形态。细胞在扩增六天内高效增殖至80%至90%融合度，并表现出克隆形成能力，表明其具有高效的增殖和自我更新能力。经诱导向成脂细胞系分化后，分离得到的细胞形成了脂滴，通过第14天和第21天的油红O染色证实了这一点。而在未添加成脂诱导因子的细胞中则未观察到此类脂滴。在诱导组中，包埋于血浆水凝胶中的分离细胞在培养14天后形成了白色且有光泽的新组织，显示出成软骨潜能。未诱导组的组织呈淡白色，光泽度降低。此外，诱导组的组织经阿利新蓝（Alcian Blue）和番红O（Safranin O）组织学染色呈阳性，表明细胞能够分泌硫酸化糖胺聚糖，这是软骨基质的主要成分之一。相比之下，未诱导组的水凝胶切片在番红O和阿利新蓝染色中均呈阴性，证实间充质干细胞仅在软骨诱导刺激存在时才具有软骨向分化潜能。经成骨诱导培养基诱导的分离细胞在14天结束时显示出碱性磷酸酶阳性染色，证实了矿化作用的发生。经过28天的成骨诱导后，通过茜素红S染色观察到钙化沉积物。结果强调了诱导细胞向脂肪源性、软骨源性和成骨源性谱系分化的潜能。必须在无菌条件下处理样本，以避免污染。同时，准确识别髌骨的正确位置也非常重要。该方法为分离多种细胞类型（如关节软骨细胞、韧带成纤维细胞以及滑膜和滑液来源的干细胞）提供了途径，在再生医学领域具有广泛的应用前景。采用该技术分离获得IFP-MSCs后，特别针对其在软骨、骨和韧带等肌肉骨骼组织再生中的有效性进行了研究，研究采用了支架和无支架两种方法。

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Research

科研

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Bioengineering

生物工程

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