基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

干细胞系统受其重要组分的影响。若无其微环境的存在，干细胞的维持与分化是不可想象的。这一微环境被称为干细胞生态位，由细胞和支架构成。

周围神经病变可能由多种因素引起，偶尔也可能由臂丛神经损伤、各种创伤、肿瘤、自主神经异常、免疫性疾病以及代谢性疾病等导致。目前已开发出多种三维培养方法，以期为干细胞提供更佳且更接近自然的微环境。类球体形成和三维生物打印是近年来出现且颇具前景的三维培养技术。

3D 生物打印也可用于神经工程学研究。因此，在本研究中，开发并研究了基于石墨烯以及基于海藻酸钠/明胶的生物墨水，以评估其再生特性。首先，在室温下的无菌层流环境中，将华通氏胶间充质干细胞（WJMSCs）培养于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（pen/strep）和1% L-谷氨酰胺的DMEM F12培养基中。

当培养瓶中的细胞融合度达到80%时，倒出培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。然后加入5毫升含0.25%胰蛋白酶和2.21毫摩尔/升EDTA钠盐的溶液，在37摄氏度下孵育。5分钟后，向细胞中加入10毫升含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。

悬浮细胞，收集培养基并转移至离心管中。随后离心细胞，弃去上清液，并将细胞重新接种至含有10% FBS新鲜营养培养基的新培养瓶中。为制备不含石墨烯的对照组生物墨水，称取4.5毫克海藻酸钠和1.5毫克明胶，转移至离心管中。

然后向离心管中加入50毫升含10%FBS的DMEM F12培养基。再次称取4.5毫克海藻酸钠和1.5毫克明胶，转移至另一离心管中。接着向该管中加入50微升0.1%石墨烯溶液，并用含10%FBS的DMEM F12培养基定容至50毫升。

在121摄氏度、1.5个大气压下高压灭菌20分钟之前，通过移液和涡旋混合生物墨水。灭菌后，离心溶液以去除形成的气泡，并将生物墨水置于37摄氏度环境中，直至细胞准备就绪。

对于细胞与生物墨水的相互作用，建立生物墨水分组。第一组包括用于生物打印的3D-B和3D-G生物墨水打印结构。第二组包括生物打印后用于形成类球体的3D-BS和3D-GS生物墨水。

对于第一组，将细胞计数至每0.5毫升培养基中含有10的7次方个细胞。然后加入4.5毫升的生物墨水。在超净工作台中，使用注射器将混合液转移至打印 cartridges 中。

将墨盒安装至生物打印机相应的挤出单元部分。对于第二组，使用注射器从每组生物墨中各取出5 mL，并转移至无菌墨盒中。使用配备两个同轴打印头和气动驱动挤出技术的生物打印机。

将每微步的 XYZ 分辨率设为 1.25 微米，挤出宽度设为 400 微米，挤出高度设为 200 微米。使用 20 × 20 × 5 毫米的网格创建三维模型。使用开源的基于网页的 CAD 程序创建三维模型。

进行3D生物打印时，将打印机的平均压力设置为7.5 psi。然后将打印 cartridge 和打印床温度设置为37摄氏度，打印速度设置为60%。在书写阶段，将系统置于原点位置。自动定位各轴，并在开始生物打印前选择并设置挤出机。

打印完成后，取出样品并置于超净工作台中。随后，用0.1 N的氯化钙溶液喷洒生物墨水，或在室温下用移液器加入1毫升该溶液，静置10至20秒。然后用含有钙和镁的PBS缓冲液将打印图案洗涤两次。

在每组含有生物墨水的细胞上加入2 mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。随后，向每组加入2 mL悬浮培养基，其中含有1×10⁶个细胞，并继续孵育培养板。24小时后，除对照组外，使用倒置显微镜观察并拍照记录所有批次生物墨水中球形体的形成情况，以评估WJMSCs向神经元样细胞的分化。

每孔加入 2 毫升神经分化培养基，每两天更换一次。连续培养七天以观察神经分化情况。接下来，利用延时成像技术，检测石墨烯对干细胞的影响，并监测生物墨水内细胞间的相互作用。

此处展示了石墨烯浓度对细胞增殖的影响。与对照组相比，0.001% 石墨烯浓度组显示出显著降低的细胞增殖。其他各组与对照组之间无显著差异。

细胞与石墨烯的相互作用表明，石墨烯在二维系统中具有良好的生物相容性，并可通过内吞作用被细胞摄取。延时成像显示，在三维石墨烯培养基中存活的细胞在整个孵育期间通过GFP荧光强度维持其活性。此处展示了3D-B和3D-G生物墨水组的扫描电镜（SEM）图像和傅里叶变换红外光谱（FIIR）分析结果。

生物墨水与细胞的相互作用在材料表面和内部均得到证实。细胞呈圆形形态，并附着于材料上。在三维神经分化过程中，两组类球体细胞的边界均呈现透明且活跃的特征，而石墨烯组的类球体相对更大，并将石墨烯包裹在细胞内部。

此处展示了二维和三维细胞的免疫染色结果。绿色图像代表神经元样结构。二维阳性对照样本表达的神经元样结构标志物少于三维样本。

我们发现，基于石墨烯的生物墨水在诱导干细胞分化为类神经元细胞方面更为成功。我们提出，在后续研究中，基于石墨烯的生物墨水将成为治疗周围神经疾病的理想工具。目前，干细胞体系可通过天然与合成生物材料的组织工程技术构建。组织工程技术能够制造可替代活体组织的人工组织，用于组织再生、损伤修复并恢复其功能。