Name: 用于外周神经工程的石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征方法，用于外周神经工程研究。该技术可促进干细胞神经分化，为周围神经损伤修复提供新型生物材料解决方案。

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本研究中使用的石墨烯由克尔克拉雷利大学机械工程系研发，由Karabeyoğlu博士捐赠。石墨烯毒性测试的资金来源于土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）2209-B产业导向型本科毕业论文支持计划资助的项目，项目名称为&#34;含石墨烯生物墨水在3D生物打印机上打印间充质干细胞及其分化研究&#34;（申请编号：1139B411802273）。研究的其他部分由伊斯坦布尔耶尔德兹技术大学科学基金研究项目（TSA-2021-4713）提供支持。用于延时成像阶段的表达GFP的间充质干细胞由Virostem生物技术公司捐赠。作者感谢Darıcı实验室以及耶尔德兹技术大学细胞培养与组织工程实验室团队提供的有益讨论。

1. 华通氏胶间充质干细胞的培养
<ol>
	<li>从 −80 °C 冰箱中取出华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs，来自 ATCC）。按照 Yurie 等人20所述方法，在室温下的无菌层流环境中，将 WJ-MSCs 培养于含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen-Strep）和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基中。</li>
	<li>用含有 35% FBS、55% DMEM-F12 和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的冻存液，以 1 × 106 个细胞/mL 的密度对部分细胞进行冷冻保存。操作时，在 Thoma 细胞计数板上计数 1 × 106 个细胞，并逐滴加入冻存液。迅速将细胞转移至液氮容器中。</li>
	<li>当培养瓶中的细胞融合度达到 80% 时，倒出培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。加入 5 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 2.21 mM EDTA-4Na 的溶液，在 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>向从培养箱中取出的细胞中加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM-F12 培养基。充分重悬细胞，收集培养基，并将细胞悬液转移至离心管中。</li>
	<li>在室温下以 101 ×g 的转速离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重新接种至新的培养瓶中，使用含 10% FBS 的新鲜营养培养基进行培养。 
	注意：可通过转导方法标记 GFP 基因的商用 WJ-MSCs，以便更清晰地观察即将形成的生物材料-细胞相互作用21。本方法中所使用的实验分组可如表 1所示进行设置。</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">创建的组别</td>
			<td colspan="2">创建原因</td>
			<td>重复次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2D WJ-MSCs (2D-C)</td>
			<td colspan="2">2D 对照组</td>
			<td>x 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2D WJ-MSCs 与石墨烯 (2D-G)</td>
			<td colspan="2">确定石墨烯在2D条件下的毒性剂量</td>
			<td>每种不同浓度均设 x 5 次重复</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">WJ-MSCs 包含于生物墨水中的组别 (3D-B)</td>
			<td colspan="2">3D 对照组</td>
			<td>x 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">WJ-MSCs 与 0.1% 石墨烯共同包含于生物墨水中的组别 (3D-G)</td>
			<td colspan="2">3D 石墨烯-生物墨水杂化组</td>
			<td>x 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">WJ-MSCs 以球状体形式存在于生物墨水表面的组别 (3D-BS)</td>
			<td colspan="2">球状体形态的3D对照组</td>
			<td>x 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">WJ-MSCs 与 0.1% 石墨烯以球状体形式存在于生物墨水表面的组别 (3D-GS组)</td>
			<td colspan="2">球状体形态的3D石墨烯-生物墨水杂化组</td>
			<td>x3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3D 生物墨水液滴</td>
			<td colspan="2">用于进行扫描电镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征分析</td>
			<td>x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3D 石墨烯液滴</td>
			<td colspan="2">用于进行扫描电镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征分析</td>
			<td>x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">含GFP标记的WJ-MSCs与0.1%石墨烯的3D生物墨水</td>
			<td colspan="2">观察在含有适宜剂量石墨烯的生物墨水中WJ-MSCs的运动情况</td>
			<td>x3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 方法中的分组。包含方法中所有的二维和三维分组。
2. 石墨烯毒性与二维成像
<ol>
	<li>石墨烯浓度的制备及其对细胞的应用 
	注意：原始石墨烯纳米颗粒为商业购买（工业级石墨烯纳米片类型），部分由他人捐赠。颗粒尺寸为厚度5–8 nm，直径5 µm，比表面积120–150 m2/g。
	<ol>
		<li>称取石墨烯以配制1%溶液（mg/mL）。通过向称量好的100 µg石墨烯纳米颗粒中加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEMF-12培养基，配制储备液，并标记为储备液。在121 °C、1.5 atm压力下高压灭菌20分钟进行灭菌。 
		注意：灭菌后的石墨烯混合物应储存于4 °C冰箱中，直至使用。该溶液不宜长期保存（最长1个月）。若超过此期限，必须重新配制并灭菌。</li>
		<li>配制不同浓度的含石墨烯培养基混合物，以确定无毒剂量。初始稀释浓度设为1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.0001%（石墨烯/培养基）。</li>
		<li>从1%储备液开始，依次从每一浓度中取1 mL转移至新离心管中，每管加入9 mL含10% FBS的DMEMF-12培养基，共制备五个梯度稀释样品，并充分振荡混匀以确保均匀分布。对照组仅使用10 mL含10% FBS的DMEMF-12培养基。 
		注意：石墨烯大片层易发生沉淀，因此需重新混匀分散。</li>
		<li>将WJ-MSCs细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL含10% FBS的新鲜培养基。于37 °C培养1天。随后将孔板分为若干组，每组设置相同且重复的孔。每个浓度设五个重复孔。</li>
		<li>弃去原培养基，更换为含不同浓度石墨烯的培养基，每孔2 mL。对照组仅加入普通培养基。将孔板置于37 °C培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过MTT法测定石墨烯的无毒浓度
	<ol>
		<li>24小时后弃去含石墨烯的培养基，用PBS洗涤每个孔。 
		注意：在石墨烯处理细胞后使用PBS洗涤至关重要，因为未通过内吞作用进入细胞的石墨烯纳米颗粒可由此从环境中清除，从而提高MTT检测的准确性。</li>
		<li>采用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）检测法测定IC50值（表示50%细胞存活率），具体步骤参照Kose等22的研究及本方案第2.2.3–2.2.6步。</li>
		<li>首先称取5 mg/mL的MTT盐，溶于PBS中。使用0.45 µm滤器过滤灭菌。将配制于15 mL离心管中的MTT溶液用铝箔包裹，避光保存于4 °C。</li>
		<li>向所有孔中加入10 µL MTT溶液，于37 °C孵育4小时。孵育结束后，在显微镜下以10倍放大观察甲臜晶体的形成。</li>
		<li>为溶解细胞内形成的晶体，向每孔加入100 µL DMSO，并用移液器吹打混匀。将孔板置于室温避光环境中30分钟。随后将孔板放入酶标仪中，设置程序波长为570 nm进行吸光度读数22。 
		注意：虽然石墨烯颗粒本身在270 nm处有吸收23，但此处570 nm的读数范围仅用于检测细胞活力24。</li>
		<li>使用统计分析软件，对所得结果进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Tukey检验进行多重比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拼接成像
	<ol>
		<li>为观察不同浓度石墨烯与细胞的相互作用，采用“拼接成像”（stitch imaging）方法对细胞进行延时成像。该方法通过显微镜下定期采集图像样本，生成延时图像序列。</li>
		<li>操作时，首先打开计算机，启动延时成像培养箱并设置温度为37 °C，将MTT孔板放入延时培养箱的插槽中。</li>
		<li>在计算机上打开Stitch程序，设定系统需读取的孔位。将读取头移至第一个孔，在白光下以10倍放大倍数定位并聚焦目标区域，然后启动程序。 
		注意：该程序用于生成高质量的4行×5列多图像拼接图。程序可连续采集高清图像并自动拼接。按下系统启动按钮后，仪器将自动读取各孔，并拍摄并拼接4行×5列的多幅图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 石墨烯-生物墨水杂化水凝胶的制备及WJ-MSCs的分化
<ol>
	<li>生物墨水的制备 
	注意：以市售的冻干海藻酸盐-明胶（3:5）粉末作为生物墨水的基础。石墨烯生物墨水组（3D-G；3D-GS）与无石墨烯对照生物墨水组（3D-B；3D-BS）均采用相同方法制备表1).
	<ol>
		<li>使用50 mL离心管进行配制。首先称取4.5 mg海藻酸钠和1.5 mg明胶，转移至离心管中。加入含10% FBS的DMEM/F-12培养基至总体积为50 mL。此为不含石墨烯的对照（C）组。</li>
		<li>重复称取4.5 mg海藻酸钠和1.5 mg明胶，转移至离心管中。然后，取 50 µL 取步骤2.1.3中制备的0.1%石墨烯，并将其加入离心管中。加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，定容至50 mL。</li>
		<li>先用移液器吹打混合生物墨水，再进行涡旋振荡。在高压灭菌器中灭菌 121 °C 在1.5 atm压力下灭菌20分钟。或者，通过微波加热至沸腾进行灭菌。</li>
		<li>混合物灭菌后，以 280 x g 室温下静置2分钟以去除形成的气泡。保持生物墨水处于 37 °C 直到细胞准备好为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加WJ-MSCs与3D生物打印
	<ol>
		<li>计数时，当细胞融合度达到80%时，用约5 mL PBS洗涤细胞，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶和2.21 mM EDTA 4Na，在37℃孵育5分钟 37 °C.</li>
		<li>从培养箱中取出后，向细胞中加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。充分悬浮后，收集培养基并转移至离心管中，在101 × g 室温下离心5分钟，然后弃去上清液。</li>
		<li>留下约 250 µL 将沉淀物重悬于1 mL新鲜培养基中。 48 µL 加入适量培养基 2 µL 细胞悬液 50 µL 0.4 g 台盼蓝/100 mL 的锥形管（1.5 mL）中用于计数4用移液器充分吹打混匀。</li>
		<li>将约10 mL制备好的染色细胞悬液加入血球计数板。在光学显微镜下计算两侧计数室方格内细胞的平均数量。 
		活力百分比（%）=（计数的活细胞数 / 总计数细胞数）× 100 
		注意：细胞与生物墨水的相互作用通过两种方式研究：（1）将细胞加入生物墨水中进行打印（3D-B；3D-G）；（2）将细胞接种于压制成型后的生物墨水上，细胞形成球状体（3D-BS；3D-GS）。</li>
		<li>对于细胞与生物墨水的相互作用，首先创建生物墨水组（表1第1组包括用于生物打印的含生物墨水的3D-B和3D-G打印物。第2组包括生物打印后形成类球体的3D-BS和3D-GS生物墨水。</li>
		<li>计数第1组细胞，使其数量约为1 x 107 将细胞加入0.5 mL培养基中，再加入4.5 mL生物墨水，使总体积达到5 mL。在超净工作台中借助注射器将混合液转移至打印 cartridges 中。将 cartridges 安装至生物打印机相应的挤出单元。</li>
		<li>对于第二组，使用注射器从每种生物墨水组中取出5 mL，并转移至无菌卡盒中。</li>
		<li>使用配备两个同轴打印头和气动驱动挤出技术的生物打印机。将X/Y/Z轴每微步分辨率设置为 1.25 µm，挤出宽度至 400 µm，以及挤出高度至 200 µm20 mm × 20 mm × 5 mm 的网格是三维生物打印研究中最常用的三维模型之一。</li>
		<li>使用开源的基于网页的 CAD 程序创建 3D 模型。在生物打印前，使用其中一个开源平台（例如 infill）创建简单的 3D 模型。模型可以是线性的（如本研究中使用的模型）、蜂窝状或网格状。创建一个 5 mm × 20 mm × 20 mm 的方块后，以 .stl 格式导出并下载。</li>
		<li>生物打印机软件使用 .stl 文件，并通过切片模块将其转换为可打印的 .gcode 格式。为获得可打印的网格形状，需在切片模块中关闭外壁。操作前先用 70% 乙醇擦拭设备，然后进行紫外灭菌。</li>
		<li>在生物打印过程中，借助注射器将生物墨水转移至打印 cartridges 中。将 cartridges 安装至生物打印机相应的挤出单元部分。</li>
		<li>将3D打印机的平均压力设置为7.5 psi，墨盒和打印床温度设置为 37 °C将速度设置为60%，并执行标准的3D打印过程。 
		注意：在设计制备模型时预留空间（如线性模型），可在生物打印后于这些空间内进行细胞培养。</li>
		<li>在打印阶段，将系统置于初始位置。自动定位各轴（X、Y、Z），选择挤出头并设置。启动打印过程。生物打印完成后，取出样品并置于超净工作台内。</li>
		<li>用 0.1 N CaCl₂ 喷洒生物墨水2 打印后立即加入溶液，或用移液枪在室温下加入1 mL该溶液。静置约10–20秒，随后用含Ca的PBS洗涤打印图案2次2+ 和 Mg2+.</li>
		<li>向每组含细胞的生物墨水上方加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F-12 培养基。将培养板置于 37 °C 含5% CO2随后，加入2 mL含有1 × 10⁶6 每个组分配细胞以形成球状体。</li>
		<li>将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2孵育24小时后，在倒置显微镜下观察球状体的形成情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>WJ-MSCs 向神经元样细胞的分化
	<ol>
		<li>孵育24小时后，观察并拍照记录所有批次的生物墨水。除对照组外，每孔加入2 mL神经分化培养基，每2天更换一次。持续培养7天，观察神经分化情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 石墨烯-生物墨水杂化水凝胶的表征
注意：对石墨烯-生物墨水杂化水凝胶的表征采用延时成像、傅里叶变换红外光谱（FT/IR）和扫描电子显微镜（SEM）分析。用于FT/IR和SEM分析的样品通过滴加法由3D-B和3D-G生物墨水组制备。
<ol>
	<li>傅里叶变换红外光谱（FT/IR）分析 
	注意：FT/IR 是一种基于数学傅里叶变换的化学分析方法，对于材料表征至关重要。使用基于 28 °C 迈克尔逊干涉仪原理的 FT/IR 仪器，配备卤素灯、水冷式汞灯光源，信号信噪比为 4 cm−1，在 2,200 cm−1 处测量 1 分钟。
	<ol>
		<li>准备 FT/IR 显微镜，并确保仪器光学系统已对准。校准设备。</li>
		<li>由于样品呈液滴状，取一块 1–2 mm 厚的水凝胶，用镊子将其放置在样品区域。对样品进行聚焦，并将其抬升至与检测面紧密接触。通过系统启动检测程序，采集样品的光谱数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）分析 
	注意：可通过 SEM 分析在不同维度下观察表面形貌、内部结构、细胞分布以及生物墨水与细胞之间的相互作用。
	<ol>
		<li>使用移液枪头滴加法，将水凝胶滴入含有 1 mL CaCl2 交联剂的 6 孔板中（见 图 1）。</li>
		<li>用约 1 mL PBS 洗涤孔板两次，以去除盐分。然后用镊子将这些凝胶滴转移至含有 5 mL 5% 多聚甲醛的离心管中。</li>
		<li>借助手术刀对凝胶滴状生物墨水进行切片，制备薄片。将样品粘附在金属载片的粘性面上。放入镀膜仪中，通过用氩气取代空气使金钯进入等离子态，从而在样品表面形成覆盖层。</li>
		<li>将样品放入扫描电子显微镜（SEM）中。打开与 SEM 连接的显微镜程序，进行放大调节，并拍摄样品不同区域的图像。本实验方案采用 5 µm、10 µm 和 200 µm 的标尺。对 3D-B 和 3D-G 组共采集了 40 张图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时成像 
	注意：在延时成像过程中，不仅使用含有转染 GFP 基因细胞的生物墨水样品，还对含有类球体的生物墨水进行 16 小时的成像。延时成像用于研究石墨烯对干细胞的影响，并监测细胞在生物墨水内的相互作用。
	<ol>
		<li>将市售的 1 × 107 个 GFP 标记的间充质干细胞（MSCs）加入 5 mL 生物墨水中，按照步骤 3.2.11 进行生物打印。加入 1 mL 交联剂，静置 20–30 秒，然后用 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>开启延时成像监测系统，并在计算机上打开相应程序。将延时模式设置为约 16 小时，温度设为 37 °C，点击 开始 按钮。系统将自动记录时长为 40 秒的延时视频片段。</li>
		<li>每隔 2 小时在 10 倍放大倍数下对显微镜进行一次聚焦。同时，按照相同步骤对形成的类球体进行可视化观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="培养皿中的水凝胶形成、微球形状、镊子操作示意，科学实验场景。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63622/63622fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：用于表征的3D-B和3D-G生物墨水组以液滴形式制备。（A）含有交联剂的培养板上的生物墨水样品（表征前图像）。（B）3D-B生物墨水液滴图像。（C）3D-G生物墨水液滴图像。待表征的生物材料及其所含细胞可更方便地进行如镀金、取样等后续处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63622/63622fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 采用免疫染色法检测神经元分化
<ol>
	<li>收集类球体，保持其球形结构不被破坏，并重新接种至新培养板中，以便采用更简便的方法进行染色，而无需将其包埋于石蜡中进行组织切片。</li>
	<li>向48孔板中加入约20 mL经预灭菌的0.1%明胶溶液，置于培养箱中孵育至少1小时。用移液器将约500 µL配制好的0.1%明胶加入48孔板中，随后将包被明胶的培养板在培养箱中静置10分钟。 
	注意：此步骤可使明胶轻微膨胀，覆盖孔板表面，为收集的类球体提供更利于贴附的环境。</li>
	<li>用移液器收集类球体，将来自培养箱的类球体分配至48孔板的各孔中，并加入新鲜培养基，随后继续培养12–24小时。 
	注意：通过计数方式分配类球体较为困难。建议将所有类球体收集至同一离心管中，并将总体积均匀分配至各孔。本研究中，每孔约含4–6个类球体。 
	注意：对于二维（2D）样本，仅需进行染色前的洗涤处理，无需更换培养基。</li>
	<li>吸除培养基，用PBS缓慢洗涤细胞，注意类球体将漂浮于液面上方。随后使用4%多聚甲醛固定2小时。</li>
	<li>再次用PBS洗涤样本，并加入约10 mL含2% BSA和0.1% TritonX的封闭液，室温封闭30分钟，然后用PBS洗涤3次。</li>
	<li>用抗体稀释液将所选的一抗（N-cadherin-rabbit 和 β-III tubulin-mouse）按1:100比例稀释。每份样本加入100 µL抗体溶液，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBS洗涤样本3次。室温下避光孵育30分钟，分别加入稀释为1:200的二抗：针对β-III tubulin使用anti-mouse IgG-FTIC-rabbit，针对N-Cadherin使用anti-mouse IgG-SC2781-goat。 
	注意：在双重染色实验中，若一抗来源于某一物种（如小鼠），则二抗应选用不同物种来源（如山羊或兔）的抗体。</li>
	<li>用PBS洗涤二抗3次，随后向每份样本中滴加1:1稀释的DAPI溶液，避光孵育15–20分钟，最后进行免疫荧光成像。</li>
</ol>

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<li>Zorba Yildiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+therapeutic+approaches+for+peripheral+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%229th+International+Molecular+Biology+and+Biotechnology+Congress+Abstract+Book%22%5BJournal%5D)">3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage.</a> 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).</li>
<li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).</li>
<li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmented+peripheral+nerve+regeneration+through+elastic+nerve+guidance+conduits+prepared+using+a+porous+PLCL+membrane+with+a+3D+printed+collagen+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel.</a> Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).</li>
<li>Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+regeneration+of+the+rat+sciatic+nerve+through+a+biodegradable+poly+%28DL-lactide-%C6%90-caprolactone%29+nerve+guide%3A+Tissue+reactions+with+a+focus+on+collagen+III%2FIV+reformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).</li>
<li>Pathre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTP1B+regulates+neurite+extension+mediated+by+cell-cell+and+cell-matrix+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules.</a> Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).</li>
<li>Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+their+microRNA+cargo%3A+New+players+in+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabilitation+and+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration.</a> Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。本项目是与3D生物打印技术开发商HD Bioink合作完成的。

与传统二维方法相比，采用工程化三维支架进行治疗的优势正日益凸显。在周围神经再生中，单独使用干细胞或将其与生物相容性和可降解性较低的各种生物材料制成的支架联合使用，通常效果有限。华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）似乎是一种合适的候选细胞系，尤其考虑到其获取方案的优化潜力、增殖能力以及分化潜能29。在本研究中，我们考察了干细胞在二维和三维培养条件下与石墨烯的相互作用，并比较了所构建的生物杂化水凝胶组与二维环境中的成神经分化情况。我们通过免疫荧光染色证实了生物墨水中神经球的形成。在后续研究中，我们利用扫描电镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FT/IR）方法对候选原型进行了表征，该原型可作为神经导管进行注射或植入。本研究表征了所制备生物材料的特性、细胞与生物材料之间的相互作用，以及干细胞在该生物材料存在下的神经分化行为。在后续阶段，将进一步考察其对细胞迁移的影响。
通过结合两种或多种生物相容性材料形成的生物杂化材料，其结构性能相较于均质材料展现出越来越多的优势30。在之前的一项研究中，将基于...

神经系统是连接生物体内部结构与外界环境的机制，分为中枢神经系统和周围神经系统两部分。周围神经损伤是一个全球性问题，占急诊科就诊患者的1.5%–5%，常由多种创伤引起，可导致严重的劳动力丧失1,2,3。
目前，细胞方法在周围神经工程领域备受关注。在这些方法中，干细胞居于首位。在正常情况下，干细胞是机体的再生细胞，其数量和功能不会随着时间推移而减少，以维持其种群的稳定性；这些细胞具有特化性，但在受到适当刺激时可响应损伤而发生分化4,5。根据干细胞假说，干细胞系统受其微环境（称为干细胞生态位）的影响。若缺乏其微环境，干细胞的维持和分化将无法实现6，而通过组织工程结合细胞与支架材料可重建该微环境7。组织工程是一门多学科交叉领域，融合了工程学与生物学原理。组织工程为人工组织的构建提供了工具，可用于替代活体组织，并通过移除受损组织、提供功能性组织来实现组织再生8。组织支架是组织工程的三大支柱之一，可通过天然和合成材料以不同方法制备9。三维（3D）打印是一种新兴的增材制造技术，因其能够通过多种方法简便而灵活地制造复杂结构，被广泛用于替代或修复缺陷组织。生物打印是一种增材制造方法，可实现细胞与生物材料（称为生物墨水）的共存10。鉴于神经细胞之间的相互作用，研究已转向如石墨烯等导电性生物材料候选物。石墨烯纳米片因其在柔性电子、超级电容器、电池、光学、电化学传感器及能量存储等方面的特性，已成为组织工程领域中备受青睐的生物材料11。石墨烯已被应用于多种研究中，以促进受损组织和器官的增殖与再生12,13。
组织工程包含三个基本要素：支架、细胞和生物信号分子。在周围神经损伤的研究中，完全提供这三个结构方面仍存在不足。已开展的研究中所制备和使用的生物材料存在多种问题，例如仅含有干细胞或生物信号分子、缺乏能够促进干细胞分化的生物活性分子、所用生物材料缺乏生物相容性、对组织微环境中细胞增殖的促进作用较弱，从而导致神经传导功能未能充分实现2,13,14,15,16。&#160;因此，有必要优化神经再生过程，减轻肌肉萎缩17,18，并通过生长因子建立必要的归巢效应19，以应对上述问题。在此背景下，对一种拟进入临床应用的外科用生物材料原型进行神经活性的表征与分析显得尤为重要。
因此，本方法学研究探讨了由3D生物打印机形成的含石墨烯纳米片的生物墨水水凝胶图案化，及其对所含干细胞神经元向分化的影响。同时，还研究了石墨烯对神经球形成和分化的作用。

<table><tbody><tr><td>&lt;br/&gt; 离心</td><td>日立</td><td></td><td>用于细胞培养和生物材料步骤</td></tr><tr><td>0.1N CaCl₂</td><td>HD 生物墨水</td><td></td><td>用作交联剂</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 膜滤器</td><td>A&amp;iota;s&amp;iota;mo</td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>A&amp;iota;s&amp;iota;mo</td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>1.5 mL 圆底离心管</td><td>Eppendorfa</td><td></td><td>用于生物墨水液滴</td></tr><tr><td>15 mL Falcon管</td><td>Nest</td><td></td><td>用于细胞培养步骤</td></tr><tr><td>25 cm² 细胞培养瓶（Falcon，TPP 组织培养瓶）</td><td>Nest</td><td></td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>3D生物打印</td><td>Axolotl Biosystems Bio A2（土耳其）</td><td></td><td>生物打印步骤</td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>Nest</td><td></td><td>用于细胞培养步骤</td></tr><tr><td>6/24/48/96 孔板（Falcon，TPP 微孔板）</td><td>默克密理博</td><td></td><td>用于细胞培养步骤</td></tr><tr><td>75 cm² 细胞培养瓶（Falcon，TPP 细胞培养瓶）</td><td>Nest</td><td></td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>抗小鼠IgG-FITC-兔</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>J1514</td><td>二抗，用于染色</td></tr><tr><td>抗小鼠IgG-SC2781-山羊</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>C3109</td><td>二抗，用于染色</td></tr><tr><td>Au 涂层设备 EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>用于 SEM 成像前生物材料部分的镀金处理</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>用于灭菌过程。</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>用于灭菌过程。</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Hera Safe KS</td><td></td><td>用于细胞培养过程</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12</td><td>Sigma</td><td>RNBJ7249</td><td>用作细胞培养基</td></tr><tr><td>FEI QUANTA 450 FEG ESEM 扫描电镜</td><td>Quanta</td><td>FEG 450</td><td>用于 SEM</td></tr><tr><td>胎牛血清-FBS</td><td>山羊座</td><td>FBS-16A</td><td>通过添加至细胞培养基中使用。</td></tr><tr><td>-80 冰箱&amp;deg;C</td><td>Panasonic</td><td>MDF-U5386S-PE</td><td>我们曾用于储存细胞及所产生的外泌体</td></tr><tr><td>明胶-海藻酸钠生物墨水粉末</td><td>HD 生物墨水</td><td></td><td>用于制备生物墨水的步骤</td></tr><tr><td>GFP标记的WJ-MSCs</td><td>Virostem</td><td></td><td>用于成像细胞-生物墨水相互作用</td></tr><tr><td>石墨烯纳米片（Graphene-IGP2）</td><td>Grafen Chemical Industries Co.</td><td></td><td>用于制备3D-G生物墨水</td></tr><tr><td>免疫荧光抗体（N-CAD； &amp;beta;-III 微管蛋白)</td><td>细胞信号传导与圣克鲁斯</td><td></td><td>用于染色</td></tr><tr><td>JASCO 6600</td><td>四面体</td><td></td><td>用于FTIR</td></tr><tr><td>MTT 检测</td><td>Sigma</td><td></td><td>活力检测</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>山羊座</td><td>PB-S</td><td>添加至培养基中以防止细胞培养污染。</td></tr><tr><td>托马载玻片</td><td>Isolab</td><td></td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>延时成像系统</td><td>Zeiss Axio.Observer.Z1</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>多细胞</td><td></td><td>使用烧瓶去除覆盖在表面的细胞。</td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>生物基地</td><td></td><td>对于所制备的生物墨水步骤</td></tr><tr><td>WJ-MSCs</td><td>ATCC</td><td></td><td>用于细胞培养过程</td></tr></tbody></table>

基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

周围神经病变可能由轴突损伤引起，偶尔也由脱髓鞘疾病导致。周围神经损伤是一个全球性问题，在急诊患者中的发生率为1.5%至5%，可能导致严重的劳动力丧失。如今，随着三维（3D）生物打印技术的发展，基于组织工程的方法——包括支架材料、合适的细胞系以及生物信号分子——已变得更加可行。目前常通过将多种水凝胶生物材料与干细胞、外泌体或生物信号分子相结合，以克服周围神经再生中存在的现有难题。因此，通过各种生物打印方法制备的可注射系统（如水凝胶）或可植入导管结构，在周围神经工程领域日益受到重视。正常情况下，干细胞是机体的再生细胞，其数量和功能不会随时间推移而显著下降，以维持其种群稳定；这类细胞本身未分化，但在损伤发生时，可在适当刺激下分化为特定细胞类型。干细胞系统受其微环境——即干细胞生态位（stem cell niche）——的调控。在周围神经损伤中，尤其是神经断伤（neurotmesis）情况下，即使通过手术将断裂的神经末端重新连接，该微环境仍难以完全恢复。复合生物材料与联合细胞治疗策略可提升材料在生物可降解性、生物相容性和可加工性等方面的性能与适用性。因此，本研究旨在展示基于石墨烯的生物杂化水凝胶图案化的制备与应用，并评估干细胞向神经细胞分化的效率，以期为神经再生提供一种有效解决方案。

石墨烯毒性与二维成像 
采用统计分析软件对获得的 MTT 结果进行单因素方差分析（ANOVA），并结合 Tukey 检验进行统计学分析，所得图表如图2所示。与对照组相比，仅在 0.001% 石墨烯浓度下观察到细胞活力显著下降（**p &lt; 0.01）。其余各组与对照组之间均无显著性差异（p &gt; 0.05）。因此，根据 MTT 检测结果及拼接图像分析，确定最佳石墨烯浓度为 0.1%，因为该浓度处理后的细胞存活率最高。
<img alt="显示不同石墨烯浓度下细胞增殖情况的图表，显著性 p&lt;0.01。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63622/63622fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2</stron...

在本论文中，我们展示了含有石墨烯的生物杂化水凝胶生物墨水的制备方法，用于外周组织工程。利用这种3D生物杂化材料，实施干细胞的神经分化方案。这可能是将类似生物材料推向临床应用的重要一步。

周围神经病变可能由轴突损伤引起，偶尔也由脱髓鞘疾病导致。周围神经损伤是一种全球性……

干细胞系统受其重要组分的影响。若无其微环境的存在，干细胞的维持与分化是不可想象的。这一微环境被称为干细胞生态位，由细胞和支架构成。周围神经病变可能由多种因素引起，偶尔也可能由臂丛神经损伤、各种创伤、肿瘤、自主神经异常、免疫性疾病以及代谢性疾病等导致。目前已开发出多种三维培养方法，以期为干细胞提供更佳且更接近自然的微环境。类球体形成和三维生物打印是近年来出现且颇具前景的三维培养技术。3D 生物打印也可用于神经工程学研究。因此，在本研究中，开发并研究了基于石墨烯以及基于海藻酸钠/明胶的生物墨水，以评估其再生特性。首先，在室温下的无菌层流环境中，将华通氏胶间充质干细胞（WJMSCs）培养于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（pen/strep）和1% L-谷氨酰胺的DMEM F12培养基中。当培养瓶中的细胞融合度达到80%时，倒出培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。然后加入5毫升含0.25%胰蛋白酶和2.21毫摩尔/升EDTA钠盐的溶液，在37摄氏度下孵育。5分钟后，向细胞中加入10毫升含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。悬浮细胞，收集培养基并转移至离心管中。随后离心细胞，弃去上清液，并将细胞重新接种至含有10% FBS新鲜营养培养基的新培养瓶中。为制备不含石墨烯的对照组生物墨水，称取4.5毫克海藻酸钠和1.5毫克明胶，转移至离心管中。然后向离心管中加入50毫升含10%FBS的DMEM F12培养基。再次称取4.5毫克海藻酸钠和1.5毫克明胶，转移至另一离心管中。接着向该管中加入50微升0.1%石墨烯溶液，并用含10%FBS的DMEM F12培养基定容至50毫升。在121摄氏度、1.5个大气压下高压灭菌20分钟之前，通过移液和涡旋混合生物墨水。灭菌后，离心溶液以去除形成的气泡，并将生物墨水置于37摄氏度环境中，直至细胞准备就绪。对于细胞与生物墨水的相互作用，建立生物墨水分组。第一组包括用于生物打印的3D-B和3D-G生物墨水打印结构。第二组包括生物打印后用于形成类球体的3D-BS和3D-GS生物墨水。对于第一组，将细胞计数至每0.5毫升培养基中含有10的7次方个细胞。然后加入4.5毫升的生物墨水。在超净工作台中，使用注射器将混合液转移至打印 cartridges 中。将墨盒安装至生物打印机相应的挤出单元部分。对于第二组，使用注射器从每组生物墨中各取出5 mL，并转移至无菌墨盒中。使用配备两个同轴打印头和气动驱动挤出技术的生物打印机。将每微步的 XYZ 分辨率设为 1.25 微米，挤出宽度设为 400 微米，挤出高度设为 200 微米。使用 20 × 20 × 5 毫米的网格创建三维模型。使用开源的基于网页的 CAD 程序创建三维模型。进行3D生物打印时，将打印机的平均压力设置为7.5 psi。然后将打印 cartridge 和打印床温度设置为37摄氏度，打印速度设置为60%。在书写阶段，将系统置于原点位置。自动定位各轴，并在开始生物打印前选择并设置挤出机。打印完成后，取出样品并置于超净工作台中。随后，用0.1 N的氯化钙溶液喷洒生物墨水，或在室温下用移液器加入1毫升该溶液，静置10至20秒。然后用含有钙和镁的PBS缓冲液将打印图案洗涤两次。在每组含有生物墨水的细胞上加入2 mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。随后，向每组加入2 mL悬浮培养基，其中含有1×10⁶个细胞，并继续孵育培养板。24小时后，除对照组外，使用倒置显微镜观察并拍照记录所有批次生物墨水中球形体的形成情况，以评估WJMSCs向神经元样细胞的分化。每孔加入 2 毫升神经分化培养基，每两天更换一次。连续培养七天以观察神经分化情况。接下来，利用延时成像技术，检测石墨烯对干细胞的影响，并监测生物墨水内细胞间的相互作用。此处展示了石墨烯浓度对细胞增殖的影响。与对照组相比，0.001% 石墨烯浓度组显示出显著降低的细胞增殖。其他各组与对照组之间无显著差异。细胞与石墨烯的相互作用表明，石墨烯在二维系统中具有良好的生物相容性，并可通过内吞作用被细胞摄取。延时成像显示，在三维石墨烯培养基中存活的细胞在整个孵育期间通过GFP荧光强度维持其活性。此处展示了3D-B和3D-G生物墨水组的扫描电镜（SEM）图像和傅里叶变换红外光谱（FIIR）分析结果。生物墨水与细胞的相互作用在材料表面和内部均得到证实。细胞呈圆形形态，并附着于材料上。在三维神经分化过程中，两组类球体细胞的边界均呈现透明且活跃的特征，而石墨烯组的类球体相对更大，并将石墨烯包裹在细胞内部。此处展示了二维和三维细胞的免疫染色结果。绿色图像代表神经元样结构。二维阳性对照样本表达的神经元样结构标志物少于三维样本。我们发现，基于石墨烯的生物墨水在诱导干细胞分化为类神经元细胞方面更为成功。我们提出，在后续研究中，基于石墨烯的生物墨水将成为治疗周围神经疾病的理想工具。目前，干细胞体系可通过天然与合成生物材料的组织工程技术构建。组织工程技术能够制造可替代活体组织的人工组织，用于组织再生、损伤修复并恢复其功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于外周神经工程的石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征

该视频展示了利用悬浮于生物墨水溶液中的星形胶质细胞构建三维生物打印结构的过程。生物打印结构在交联后可促进星形胶质细胞的黏附与铺展，形成类似神经组织的结构。...

一种用于3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞发生沉降。...

使用多层水凝胶生物墨水进行三维生物打印以实现均匀的细胞分布

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。...

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

本文描述了利用微流控装置进行高通量明胶甲基丙烯酰基微凝胶制备的实验方案，将微凝胶转化为可再悬浮粉末（微气凝胶），通过化学组装微凝胶形成颗粒状水凝胶支架，以及开发具有保留微孔结构的颗粒状水凝胶生物墨水用于3D生物打印。...

明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

本研究描述了一种在自愈性可退火颗粒-细胞外基质复合材料内进行神经干细胞自由成型嵌入式3D打印的实验方案。该方案能够高保真地程序化构建相互连接的人类神经组织结构。...

微凝胶-细胞外基质复合支撑材料用于人源神经组织嵌入式三维打印

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

了解石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征方法，用于外周神经工程研究。该技术可促进干细胞神经分化，为周围神经损伤修复提供新型生物材料解决方案。

基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

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