利用一种简单且经济高效的DNA提取方法分析易感狼疮小鼠肠道微生物群动态变化
2022年5月2日
本方案提供了一种简单且经济高效的DNA提取方法，用于分析自身免疫性疾病发展过程中小鼠肠道微生物群的变化。
所提出的DNA提取方法可用于研究自身免疫性疾病小鼠模型中肠道微生物群的动态变化。本文提出了一种更具通用性、成本效益更高且效率更高的方法，用于从粪便样本中提取DNA，其质量可与商业化试剂盒相媲美。首先，将每只小鼠单独从笼中取出，直接从肛门采集粪便颗粒，并于-80°C保存，直至后续处理。
使用无菌且洁净的镊子、离心管和手套处理样品。将一个冷冻的粪便颗粒加入预先称重的2毫升螺口管中，并记录粪便重量（以克为单位），每粒粪便的重量应在0.02至0.05克之间。向粪便颗粒中加入一层薄薄的0.1毫米玻璃珠、500 µL裂解缓冲液以及200 µL 20%十二烷基硫酸钠（SDS）。
在均质器中对离心管进行珠击破碎4分钟，随后涡旋振荡3至5分钟。短时间离心以消除气泡和泡沫。为从微生物组样本中提取DNA，将350 µL样本上清液（不含任何碎片）转移至新的1.5 mL扣盖离心管中。
加入500微升苯酚:氯仿:异戊醇（体积比为25:24:1），涡旋振荡1分钟。离心后，将上层水相的180微升转移至新的1.5毫升旋盖管中。加入180微升氯仿，颠倒混匀。
从此溶液中转移 180 微升水相至新的旋盖管中。在生物安全柜中，加入 180 微升预冷的异丙醇和 36 微升 5 摩尔的醋酸铵。轻轻颠倒混匀数次，将管子置于冰上静置 20 分钟。
弃去上清液，随后用500微升冷的70%乙醇清洗沉淀数次。弃去上清液，将离心管倒置在纸巾上空气干燥20分钟，直至沉淀变得透明。将沉淀溶于50微升分子生物学级水中，于37摄氏度加热10分钟，以充分溶解较大的DNA沉淀。
加热后，将这些离心管在3,400 ×g条件下离心1分钟，以回收管盖上的冷凝液滴。使用分光光度计测定浓度并获得260/280比值。高质量DNA的比值通常介于1.8至2.0之间。
将制备好的样品在室温下以 600 × g 离心 1 分钟，随后在 -80 摄氏度冷冻 24 小时。然后，将浓度范围为 1 至 50 纳克/微升的 20 微升样品送至阿贡国家实验室进行测序。缺乏受体 CX3CR1 的小鼠品系与野生型 MRL/lpr 相比，其肠道微生物群组成存在差异，MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP 小鼠在某些菌属上表现出显著差异，这些菌属与变形菌门（Proteobacteria）中的潜在致病菌相关。
注意避免样本污染，样本必须保持无菌。此外，在将上清液转移至新离心管时，准确移液至关重要。
该方法适用于PCR、限制性酶切或基因组文库构建等分子分析。在狼疮研究中，我们证实了肠道微生物群与狼疮进展之间存在显著关联。
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概述
本方案提供了一种简单且经济高效的DNA提取方法，用于分析自身免疫性疾病发展过程中小鼠肠道微生物群的变化。该方法旨在研究自身免疫性疾病小鼠模型中肠道微生物群的动态变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 自身免疫
背景
- 了解肠道微生物群在自身免疫疾病研究中至关重要。
- 目前的DNA提取方法可能成本高昂且操作复杂。
- 本研究提出了一种更高效且经济的替代方案。
- 利用粪便样本分析微生物群的变化。
研究目的
- 提供一种从粪便样本中提取DNA的可靠方法。
- 促进对自身免疫疾病模型中肠道微生物群的研究。
- 将新方法的提取效率与 commercially available kits 进行比较。
使用的方法
- 从小鼠个体收集粪便颗粒。
- 样品在 -80 摄氏度下保存。
- 使用无菌工具进行样品处理。
- 用裂解缓冲液和玻璃珠制备样品。
主要结果
- 该方法获得的DNA质量可与商业试剂盒相媲美。
- 在微生物群分析中具有成本效益且高效。
- 有助于进一步研究自身免疫性疾病的发病机制。
结论
- 这种DNA提取方法是研究人员的一种重要工具。
- 它支持在疾病背景下对肠道微生物群进行研究。
- 促进了自身免疫领域更广泛可及的研究。
常见问题
行业重要性概述
在自身免疫疾病模型中，对肠道微生物群动态进行可靠分析，对于理解疾病进展中环境与遗传因素的贡献至关重要。该经济高效的DNA提取方案可实现从小鼠粪便样本中大规模、可重复地提取微生物DNA，支持临床前研究中的高通量微生物组研究。该方法增强了将微生物群变化与自身免疫表型关联的预测可信度，有助于早期发现及转化策略的制定。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在与疾病相关的鼠类模型中探究微生物群与免疫系统之间的相互作用。
- 支持对受肠道微生物组成影响的候选通路进行功能验证。
- 通过将微生物变化与自身免疫进展相联系，促进机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为下游测序和分子检测提供标准化、可重复的DNA样本。
- 确保获得适用于PCR和新一代测序流程的定量、高质量DNA。
- 支持在不同实验队列的比较微生物组研究中进行可扩展的样本处理。
转化与临床前研究
- 将临床前微生物组分析与疾病进展及生物标志物发现研究相结合。
- 支持从发现阶段的研究成果向自身免疫模型中的转化验证连续推进。
- 降低将环境诱因与疾病表型关联时的生物学不确定性。
流程与工作流整合
该DNA提取方案适用于从早期发现到临床前研究的连续过程，能够在易感狼疮的小鼠模型中实现稳健的微生物组分析，并支持先导化合物的鉴定及机制研究。
- Discovery Biology：促进在自身免疫中对微生物群驱动的免疫调节进行假设验证。
- Screening：提供可重复、定量的DNA输出，用于基于测序的微生物组分析。
- Analytics：为不同基因型或处理间微生物群落变化的统计比较提供高质量输入数据。
- Translational Research：将临床前微生物组研究发现与自身免疫疾病中潜在生物标志物的开发相衔接。
- Enterprise Reuse：提供一种可扩展、成本效益高的实验方案，可适应多种小鼠模型和实验设计。
运营与企业影响
- 科学价值：提高微生物群-疾病关联性及靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化DNA提取流程，提升不同研究间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过阐明微生物组在疾病机制中的作用，支持科学的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：支持在自身免疫疾病研发管线中，对调节微生物组的干预措施进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备无菌样本操作和分子生物学实验流程方面的专业技术知识。
- 需要使用匀浆器、离心机和分光光度计等设备进行质量控制。
- 要求跨团队严格标准化操作，以最大限度减少污染和实验变异性。
- 可适用于多种小鼠模型，但可能需要针对不同样本类型进行优化。
- 依赖精确的移液操作和无菌技术，以确保数据的完整性。
