基于外泌体的多巴胺载体系统的配方和表征
2022年4月4日
在这里，我们旨在通过从沃顿果冻间充质干细胞中分离的干细胞外泌体的多巴胺负载来获得一种制剂。外泌体分离和表征，药物加载到所得外泌体中，以及所开发制剂的细胞毒性活性在本方案中描述。
外泌体可能对大小在 14 到 200 纳米之间的细胞分泌的囊泡产生反应，并从细胞内货物和通讯中分裂出来，这是细胞外囊泡的最小亚群。由于内体分化而形成的外泌体起源于细胞膜。干细胞可以从不同的来源（如骨髓或脂肪组织）中分离出来。
但成体组织干燥干细胞具有更高的免疫原性潜力，外泌体的大小，据说它在中枢神经系统疾病中发挥着重要作用，因为它可以穿过血脑屏障。首先，用五毫升PBS洗涤接种的沃顿氏果冻间充质干细胞。然后加入 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液，然后将烧瓶放入培养箱中。
孵育后，收集细胞并以 1， 500 G 离心 5 分钟。然后除去上清液，向试管中加入一毫升含有10%FBS的DMEM-F12。用PBS洗涤培养的细胞。
洗涤后，向细胞中加入无血清的DMEM-F12培养基，并将其置于培养箱中。要分离外泌体，收集无血清培养基，并在 4 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟。将上清液转移到另一个试管中，并通过以更高的速度连续离心进行处理。
最终离心后，缓慢除去上清液，将沉淀溶解在一毫升PBS中。涡旋混合，在4摄氏度下以110， 000 G进行超速离心70分钟。将3毫升PBS加入先前通过超速离心收集的外泌体悬浮液中，并使用0.22微米过滤器过滤对稀释的悬浮液进行灭菌。
然后将 500 微升灭菌的外泌体悬浮液转移到另一个管中。接下来，依次将 500 微升每毫升 0.5 毫克的多巴胺溶液和皂苷加入灭菌的悬浮液中。孵育后超速离心悬浮液。
该样品可用于 NTA 和 DLS 分析以表征多巴胺负载的外泌体，或储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。在NTA分析中，沃顿果冻衍生的外泌体的平均大小被确定为98纳米，多巴胺负载的外泌体为110纳米。NTA和DLS分析揭示的纳米颗粒数量彼此一致。
沃顿果冻衍生外泌体的 zeta 电位测量为负 15.7，多巴胺负载外泌体为负 17.6 毫伏。负载多巴胺外泌体的HPLC分析在6.45 min处检测到多巴胺的峰值。累积药物释放曲线显示，74.8%的包封多巴胺在前8小时内从外泌体释放。
研究了多巴胺负载和游离外泌体对成纤维细胞的细胞毒性。尽管负载多巴胺的外泌体没有表现出任何细胞毒性作用，但皂苷降低了成纤维细胞的活力。MTT 测定显示，当用负载多巴胺的外泌体处理成纤维细胞时，细胞活力增加。
通过单因素方差分析评估结果的统计学意义。此外，还研究了不同浓度的游离外泌体对成纤维细胞的细胞毒性作用。成纤维细胞活力更高，游离外泌体浓度为每毫升 25 微升。
对于中枢神经系统来说，患者的大小、在可塑性、神经反应、左右交流和大脑神经发生等过程中的作用非常重要。此外，由于外泌体的表面，它说，已经观察到它们可以与靶细胞药物相互作用，并且在药物递送过程中的活性是完成的。在这项研究中，我们首次通过将多巴胺封装到干细胞衍生的外泌体中来开发一种新的药物制剂。
他提出，这种制剂在治疗帕金森病方面将非常有希望。
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概览
本研究聚焦于源自沃顿氏凝胶间充质干细胞的多巴胺载体外泌体的制备。该协议详细描述了外泌体的分离和表征、药物装载以及细胞毒性活性的评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞研究
- 药物递送系统
背景
- 外泌体是参与细胞通讯的小型细胞外囊泡。
- 它们在多种生物过程中扮演重要角色，包括中枢神经系统中的过程。
- 沃顿氏凝胶间充质干细胞是分离外泌体的有前景的来源。
- 外泌体可以穿越血脑屏障，使其在治疗应用中具有价值。
研究目的
- 开发使用多巴胺载体外泌体的配方。
- 研究所开发配方的细胞毒性效应。
- 增进对基于外泌体的药物递送系统的理解。
使用的方法
- 沃顿氏凝胶间充质干细胞的分离。
- 分离的外泌体的表征。
- 多巴胺装载到外泌体中。
- 配方细胞毒性活性的评估。
主要结果
- 外泌体的成功分离和表征。
- 多巴胺有效装载到外泌体中。
- 细胞毒性效应的评估显示了配方的潜力。
- 研究结果支持外泌体在药物递送应用中的使用。
结论
- 多巴胺载体外泌体显示出用于治疗的潜力。
- 该研究提供了基于外泌体的药物递送研究协议。
- 需要进一步研究以探索这种方法的全部潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Exosome-based nanocarriers offer a promising platform for delivering small molecules across the blood-brain barrier, addressing a critical challenge in CNS drug development. The encapsulation and characterization of dopamine within stem cell-derived exosomes demonstrates a reproducible workflow for evaluating drug delivery vehicles in early discovery. This approach supports predictive confidence in translational neuroscience portfolios by enabling quantitative assessment of carrier efficacy and cytotoxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated delivery mechanisms for CNS-targeted therapeutics.
- Supports biological de-risking by quantifying encapsulation efficiency and release kinetics.
- Facilitates functional validation of carrier systems using cytotoxicity and viability assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for exosome isolation, drug loading, and nanoparticle characterization.
- Delivers quantitative outputs via NTA, DLS, zeta potential, and HPLC analyses.
- Enables reproducible assessment of drug release profiles and cytotoxicity in vitro.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by leveraging exosomes' ability to cross the blood-brain barrier.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through quantitative release and viability data.
- Reduces mechanistic ambiguity in CNS drug delivery strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This exosome-based carrier system fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling iterative optimization before lead identification.
- Discovery Biology: Quantitative encapsulation and release data inform hypothesis testing for CNS delivery.
- Screening: Standardized nanoparticle and cytotoxicity assays support assay readiness and reproducibility.
- Analytics: HPLC and particle analysis provide robust comparative metrics for formulation assessment.
- Translational Research: Exosome-mediated delivery supports biomarker alignment and preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other small molecule or biologic payloads in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS-targeted delivery systems.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation, loading, and characterization for scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel carrier platforms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS delivery strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle isolation, characterization, and analytical chemistry.
- Needs access to ultracentrifugation, NTA, DLS, and HPLC instrumentation.
- Demands cross-team standardization of exosome preparation and assay protocols.
- Adaptable to various stem cell sources and small molecule payloads.
- Release kinetics and cytotoxicity must be validated for each new formulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Culturing and Cryopreservation of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
1:30
Production of Exosomes from Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
2:20
Dopamine Loading into Exosomes and Characterization of Dopamine Loaded Exosomes
3:15
Results: Development of a Nanocarrier System by Encapsulation of Dopamine into Exosomes Isolated from WJ‐MSCs
5:07
Conclusion
