Name: 使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性特性，表征其在生理和病理条件下的软玻璃态行为。该方法为研究红细胞力学性质提供了可靠的实验方案。

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作者谨向CENABIO高级显微镜中心的所有成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的关键帮助。本研究工作得到了巴西科研机构国家科学技术发展委员会（CNPq）、高等教育人员进修协调委员会（CAPES）—资助代码001、里约热内卢州科研支持基金会（FAPERJ）以及国家复杂流体科学与技术研究所（INCT-FCx）与圣保罗州科研支持基金会（FAPESP）的资助。B.P. 获得了FAPERJ提供的JCNE项目资助。

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<li>Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+ultrastructure+of+the+red+cell+cytoskeleton+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography.</a> Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).</li>
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<li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li>
</ol>

作者对本文所述产品无任何财务利益，亦无其他事项需要披露。

本方案介绍了一种基于光镊与离焦显微镜的集成方法，用于定量绘制红细胞（RBC）的黏弹性特性。该方法可测定储能剪切模量和损耗剪切模量，以及表征红细胞软玻璃态流变特性的标度指数。该方案已应用于不同的实验条件，例如生理状态8下，或恶性疟原虫（P. falciparum）红细胞内发育周期的各个阶段9。
文献中的参考文献指出，红细胞（RBC）流变学存在差异，部分原因在于测量过程中未充分考虑细胞形态的变化6,7。利用动态光散射技术，在1–100 Hz频率范围内测得红细胞的储能模量和损耗模量值介于0.01–1 Pa之间6。在另一项研究中，采用光学磁扭转细胞力学技术测定了表观复数弹性模量7，但其结果与动态光散射所得数值存在差异；因此，为便于比较，引入了一个84倍的乘法因子。通过...

成熟的红细胞（RBCs），也称为红血球，能够在通过人体最狭窄的毛细血管时伸展至其原始大小的两倍以上1。这种能力归因于其在受到外力作用时发生形变的独特特性。
近年来，已有不同的研究对红细胞（RBC）表面的这一特性进行了表征2,3。描述材料在外力作用下弹性与黏性响应的物理学领域称为流变学。通常情况下，当施加外部作用力时，所产生的形变取决于材料本身的性质，可分为储存能量的弹性形变和耗散能量的黏性形变4。所有细胞（包括红细胞）均表现出黏弹性行为；换句话说，能量既被储存也被耗散。因此，细胞的黏弹性响应可通过其复数剪切模量 G*(ω) = G'(ω) + iG&#34;(ω) 来表征，其中 G'(ω) 为储能模量，反映弹性行为，而 G&#34;(ω)&#160;为损耗模量，反映其黏性4。此外，已有研究采用唯象模型来描述细胞的响应，其中应用最广泛的一种称为软玻璃态流变模型5，其特征是复数剪切模量与载荷频率之间呈幂律关系。
基于单细胞的方法已被用于表征红细胞（RBC）的黏弹性特性，其通过施加力并测量在给定载荷下的位移来实现2,3。然而，关于复数剪切模量，文献中相关结果较少。利用动态光散射技术，报道了红细胞储能模量和损耗模量的数值，在1–100 Hz频率范围内变化于0.01–1 Pa之间6。通过使用光学磁扭细胞仪，获得了表观复数弹性模量；为便于比较，有研究提出使用乘性因子可能有助于解释这些差异7。
最近，建立了一种基于光镊（OT）与散焦显微技术（DM）的新方法，作为一种集成工具，用于定量绘制人红细胞在时间依赖性载荷下的剪切储能模量与损耗模量的变化。8,9此外，采用软玻璃态流变学模型对结果进行拟合，以获得表征红细胞的幂律系数8,9.
总体而言，本研究建立的方法8,9（其具体实验方案如下文详述）通过采用实测的形态因子 Ff 值，解决了以往研究中的不一致问题。该因子用于关联红细胞（RBC）表面的力与形变同应力与应变之间的关系，并可作为一种新型诊断方法，用于定量测定来自不同血液疾病患者的红细胞的黏弹性参数及其软玻璃态特性。利用下文所述的实验方案进行此类表征，有望从力学生物学角度为理解红细胞行为开辟新的研究途径。

<table><tbody><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>康宁</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>克尼特尔玻璃</td><td>VD12460Y1A.01 和 VD12432Y1A.01</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek Life Sciences</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>尼康</td><td>MXA22165</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy 软件</td><td>https://www.synergy.com/</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>滨松</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805-1EA</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>尼康</td><td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H；PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H 和 Plan APO 10x XXNA PH2</td><td></td></tr><tr><td>光学平台</td><td>Thorlabs</td><td>T1020CK</td><td></td></tr><tr><td>OT 激光器</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-5-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>橡胶环</td><td>永久封片剂</td><td>NBR O型密封圈</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>道康宁</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>阶段定位</td><td>PI</td><td>P-545.3R8S</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr></tbody></table>

利用光镊与离焦显微技术对红细胞黏弹性性质的定量分析

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

红细胞的黏弹性特性已通过多种技术进行了研究。然而，已报道的实验数据存在差异。这不仅归因于细胞本身的正常变异性，还与细胞响应的方法和模型差异有关。本文采用一种结合光镊与离焦显微镜的集成化实验方案，用于获取红细胞在1 Hz至35 Hz频率范围内的流变学特征。光镊用于测量红细胞的复弹性常数，而离焦显微镜则可获得细胞的高度轮廓、体积及其形态因子——该参数可用于将复弹性常数转换为复剪切模量。此外，通过应用软玻璃态流变学模型，可获得两个模量的标度指数。该方法学能够在明确的实验条件下，针对多种生理与病理状态，系统地研究红细胞的力学行为，并表征其黏弹性参数。

图1 表示用于流变学测量的光镊系统的示意图。图2 展示了微流变学实验的示意图，其中包含两个微球以及一个典型的红细胞（RBC）。图3 显示了当压电平台产生正弦运动时，两个微球振幅随时间变化的典型曲线。参考微球（图3 - 红色曲线）随平台运动而振荡，而与红细胞连接的微球（图3 - 蓝色曲线）则以不同的振幅和相位振荡。通过测量这些参数，可以确定样品中不同红细胞的复数弹性常数 K* (ω)。图4 显示了储能弹性常数 K' (ω) 与损耗弹性常数 K" (ω) 之间的典型关系图。所观察到的线性关系表明，红细胞表面可被视为一种软玻璃态材料。接下来，为了获得细胞的整体形态因子 F<s...

本文介绍了一种基于光镊和离焦显微镜的集成化实验方案，用于测量细胞的流变学特性。该方案在研究红细胞在不同生理-病理条件下的黏弹性特性方面具有广泛的应用价值。

红细胞的黏弹性特性已通过多种技术进行了研究。然而，所报道的实验数据存在差异。这并非……

该方法可用于研究红细胞在多种生理和病理条件下的力学行为，表征其黏弹性参数及软玻璃态特性。我们基于单细胞的方法通过使用形态因子的金属值来验证视频参考，该形态因子关联了作用力与位移，以及红细胞表面的应力与剪切力。首先将硅脂均匀涂抹在橡胶环表面，确保覆盖整个周长。接下来，将橡胶环放置在盖玻片上，涂有润滑脂的一面朝向盖玻片。静置五分钟以确保牢固粘附，此时样品支架即可用于接种细胞培养。随后，取按照书面实验方案预先配制好的细胞悬液，将细胞接种至样品支架中。向样品中加入 0.2 µL 的 10%（体积比）聚苯乙烯微球溶液。将第二块盖玻片置于橡胶圈上方。封闭装置，完成样品制备。最后，将整个样品转移至显微镜下。开始实验时，使用光镊系统，用光镊激光捕获微球，并将其固定在盖玻片上，靠近细胞的位置。然后捕获另一个微球，重复相同的固定步骤，将微球压向细胞表面，位置靠近细胞顶部表面且接近细胞边缘处。添加一个具有特定振幅和不同频率的正弦函数。接着，按下“开始”按钮，利用压电位移台实现压电位移。将红细胞微球固定在光镊中，并使用先前设定的正弦函数对样品施加一个运动循环。进行分析时，打开 ImageJ 软件并导入正弦运动期间获得的整段视频。点击调整，然后选择阈值选项。通过两个滚动条调节阈值，并通过点击文件，随后选择矩形，来选定参考球体。然后在“分析”选项卡中，点击“设置测量”并选择“质心”选项。再次点击“分析”选项卡并选择“分析颗粒”。此时将出现一个新窗口，其中包含质心 xy 坐标的表格。对红细胞表面附着的另一个球体重复上述操作。打开分析软件并导入先前获得的 txt 文件。生成一幅以质心为纵轴（y 轴）、时间为横轴（x 轴）的图表。使用横轴表示损耗常数（记为 K''），纵轴表示储能常数（记为 K'），将结果绘制成图。首先，进行视频采集时，通过软件控制压电平台在 xy 方向移动，寻找附着在盖玻片上的孤立细胞。捕获并附着一个已知直径的聚苯乙烯微球至红细胞表面。接下来，使用压电载物台移动附着在红细胞表面的被捕获微珠，以使细胞发生形变，然后将微珠固定在盖玻片上。现在，调整 z 轴位置以找到清晰对焦的图像。固定位置后，使用相机软件拍摄整个细胞的视频。然后，将 z 轴位置向下或向上移动两微米，以获取所选细胞的离焦图像。最后，在不改变 z 轴位置的情况下，寻找一个无细胞的区域，重复相同操作，并创建图像背景的视频。对于对比度图像的采集，首先找到 N 零的值，点击多边形选择图标，然后点击分析选项卡并选择测量。接下来，使用对比度公式计算 N 图像 减去 N 零值，并通过在“处理”下选择“数学”功能，然后执行减法操作来完成该步骤。随后，将结果除以 N 零值 减去 B。最后，求出聚焦图像和离焦图像的对比度。现在，使用哈特利变换来获得红细胞厚度。在 ImageJ 中，依次点击 process（处理）、FFT 和 FFT options（FFT 选项），然后选择 FHT。接着通过依次选择 process（处理）、FFT 和 FFT，执行逆变换 FHT。使用得到的图像获取高度轮廓。找到包含红细胞高度轮廓的图像后，利用两个微米级离焦对比度在 ImageJ 中生成一组两幅图像。为获得形态因子，使用 ImageJ 自定义宏来分析该图像栈。该宏将输出一个表格，其中包含边缘位置、周长、周长的倒数，以及被分析细胞的图像。检查该图像的边缘是否与参考图的边缘相似。否则，重复该步骤，并利用周长倒数之和计算形态因子。首先将实验数据整理成表格。在分析软件中，单击文件选项卡以创建一个新表格。为参数确定10个不同的列。要在分析软件中绘制G′和G″曲线，请使用上一个表格中的数据，然后单击绘图按钮。为获得参数 Gamma 和 GM，单击曲线拟合选项卡并选择 fit1 以打开新窗口。选中方框，单击 define 按钮，然后输入方程。依次单击两个窗口中的 okay 按钮，拟合结果即会显示。接下来，创建另外两个图，即 G′ 和 G″ 随 ω 变化的函数图。仅在 y 轴上添加误差棒，方法与之前所示相同。重复曲线拟合过程，选择 G″ 选项。在“常规拟合”下点击曲线定义，然后写出相关方程。最后点击确定，将出现一条拟合曲线以及 Alpha 和 G zero 的数值。再次执行另一条曲线拟合步骤。选择 G"选项，点击“常规拟合”下的曲线定义，然后输入相关方程。最后点击确定，即可显示曲线拟合结果。该图显示了储能弹性常数随损耗弹性常数的变化关系。观察到的线性依赖关系表明，红细胞表面可被视为一种软玻璃态材料。通过应用整体细胞形状因子和红细胞表面厚度的数值，可确定指数Alpha的数值。该技术可能为新型诊断方法提供基础，将红细胞黏弹性性质的变化与患有不同病理个体的血流改变相关联。

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生物学

使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性

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用于动态研究红细胞聚集的可控微流控环境

本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。...

通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性

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用于研究B淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

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生物样本制备与测定晶状体悬韧带纤维黏弹性特性的力学技术

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

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捕获无核红细胞中蛋白质活化过程的动态变化存在方法学上的挑战，例如如何保存急性刺激引起的动态变化以供后续分析。本方案描述了样本制备和染色技术，可实现相关蛋白质变化的保存与分析，并支持后续检测。...

基于免疫染色的红细胞蛋白质动态变化检测

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