微图案牵引力显微镜的图案生成

本方案可稳定地制备任意所需形状的高保真度蛋白质微图案，尤其适用于细胞簇研究中的孤立图案岛。该技术仅需一步即可制备任意形状和尺寸的孤立岛屿状微图案，而此前制备此类图案需要两个独立步骤。首先，按照制造商说明书中的建议比例，将PDMS与其固化剂充分混合。

在室温和常压下孵育15分钟，然后在真空条件下脱气15分钟。将PDMS倒入主模具中，并转移至设定为37摄氏度的培养箱中过夜固化。从培养箱中取出主模具，使其冷却至室温。

在母模冷却的同时，将25毫米的盖玻片在乙醇中进行10分钟的超声处理。盖玻片的数量应与所制备的印章数量相同。用去离子水彻底冲洗盖玻片，并使用过滤空气枪将其吹干。

使用等离子清洗仪在高真空条件下对盖玻片进行等离子处理1分钟。处理后缓慢释放真空，以防止盖玻片在腔室内移动。在无直射阳光或顶灯照明的环境中，向每张盖玻片加入100 µL荧光标记蛋白溶液进行孵育。

用盖片覆盖样品，以提供额外的避光保护，并在室温下孵育 20 分钟。用去离子水彻底冲洗每个盖玻片。将盖玻片侧面轻轻接触纸巾或类似的吸水材料，以去除表面多余的水分。

将盖玻片置于黑暗环境中，不加盖，使其完全干燥至少30分钟。在蛋白质包被的盖玻片干燥的同时，使用解剖刀或任何锋利的刀片将PDMS印章从主模具上切割下来。在高真空条件下，对PDMS印章进行两分钟的等离子体处理。

将印章置于带盖容器中，放入通风橱内，然后用10% 3-APTMS（溶于100%乙醇）的稀溶液在每个印章表面均匀涂覆一层薄层。盖上装有印章的容器，在室温下孵育五分钟。用去离子水彻底冲洗每个印章的两面。

将印章置于洁净的容器中，并用去离子水中配制的2.5%戊二醛溶液覆盖。盖好容器，在室温下孵育30分钟。用去离子水充分冲洗印章。

按照前述方法去除表面多余的水分，将印模在无遮盖条件下干燥30分钟。若30分钟后蛋白包被的盖玻片或印模仍未完全干燥，可使用过滤空气枪彻底吹干。将印模带有图案的一面朝向盖玻片，施加适当压力，使其充分接触。

静置15分钟。然后小心地将PDMS印章从盖玻片上剥离。使用配备适当滤光片的荧光显微镜，检查图案化盖玻片的复制保真度。

立即使用图案化盖玻片，或在避光条件下保存以备后续使用。在制备PAA水凝胶前体之前，将丙烯酸NHS酯从冰箱中取出，待其恢复至室温后再打开。使用前，先用70%乙醇对可更换盖玻片培养皿套装进行灭菌处理，然后在生物安全柜中用紫外光照射孵育至少30分钟。

在通风橱中，将1.25毫升溶于去离子水中的40%丙烯酰胺加入15毫升锥形管中。向同一管中加入175微升溶于去离子水中的双丙烯酰胺溶液。然后加入500微升10×磷酸盐缓冲液（PBS），随后加入2.915毫升去离子水。

将969微升该前体溶液用移液器转移至1.5毫升微量离心管中，并将剩余部分于4摄氏度保存，可保存长达两周。在新的微量离心管中称取50至100毫克APS，并用去离子水稀释至100毫克/毫升。在通风橱中打开NHS酯，小心地在微量离心管中称取最多3毫克NHS。

用1X PBS将NHS酯稀释至每毫升含1毫克。在通风橱内，向含有969微升PAA前体溶液的微量离心管中加入2微升TEMED。加入15微升1摩尔盐酸以降低水凝胶溶液的pH值，防止NHS酯发生水解。

向离心管中加入10 µL的NHS酯溶液。以下步骤均需在生物安全柜中进行。小心地将30 mm盖玻片放置于盖玻片培养皿组的中央位置，确保经3-APTMS和戊二醛处理的一面朝上，并将塑料环旋紧在顶部。

将图案化盖玻片置于避光条件下，为下一步操作做好准备。取5微升APS溶液加入PAA前体分装管中，立即倒置混匀。随后迅速将35微升该溶液滴加到30毫米盖玻片上。

将带有图案的盖玻片蛋白面朝下放入溶液中。注意避免在水凝胶中产生气泡。避光保护水凝胶，并使其聚合90分钟。

水凝胶聚合后，使用剃刀刀片或手术刀去除上层盖玻片，确保移除后盖玻片不会回落或滑落至凝胶表面，以免破坏凝胶表面的图案。为钝化水凝胶中残留的NHS酯，向凝胶中加入2 mL无菌PBS，于37摄氏度孵育45分钟。随后立即进行实验所需的凝胶准备，或将其置于4摄氏度的无菌PBS中过夜保存，直至后续使用。

水凝胶通过间接图案化荧光纤维连接蛋白，以可视化并测量细胞簇内的细胞牵引力，并形成预定大小和形状的岛状图案。图案质量直接取决于用于浇铸PDMS印章的母模的保真度。该方法可制备孤立且边界清晰、形状预设的岛状图案。

纤维连接蛋白黏附点仅存在于岛状区域的预定范围内。这些孤立的黏附点岛状结构进一步实现了对簇状形态的更好控制。用少量3-APTMS对PDMS印章进行包被至关重要，因为用量过少会降低去除方法的有效性，而用量过多则会在印章表面产生橙色残留物。

此处创建的图案可用于确定单个细胞和细胞簇的细胞牵引力，从而深入了解它们维持力学稳态的能力。