Name: 微图案牵引显微镜的图案生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用微接触印刷技术在软水凝胶上制备高精度蛋白质微图案的方法。该一步法工艺可创建各种形状和尺寸的孤立岛状图案，用于研究细胞簇的牵引力，为细胞力学研究提供可靠的技术支持。

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作者谨此感谢波士顿大学机械工程系的 Paul Barbone 博士在数据处理和分析方面的有益讨论与帮助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）CMMI-1910401 项目资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了一种改进的间接图案化聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶的方法。该方法在先前已使用的技术基础上进行了优化20,35,36,37,38,39,40,41,42。主要改进之处在于，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章去除蛋白质，从而在中间基底上留下所需的图案，而不是将图案直接印制到基底上。这种方法能够更一致地生成高保真度的微图案，并可一步形成孤立的微图案化岛状结构，而此前这类结构的制备需要两个独立步骤。与之前的两步法相比，本方法所制备的岛状图案在...

大多数细胞表型会对周围环境施加牵引力。这些牵引力由细胞的收缩性细胞骨架产生，细胞骨架是由肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白构成的网络1,2,3,4。细胞内产生的力主要通过跨膜蛋白传递到细胞外环境或相邻细胞，例如分别通过整合素和钙黏蛋白5,6。细胞的铺展或收缩行为以及与这些运动相关的牵引力大小，是细胞与其环境之间密切相互作用的结果，这种相互作用在很大程度上取决于细胞外基质（ECM）中蛋白质的类型和数量7,8以及ECM的刚度。事实上，牵引力显微镜技术已成为理解细胞对局部刺激（如基底刚度、施加的机械应力和应变，或与其他细胞的接触）响应能力的重要工具。这些信息对于理解癌症和哮喘等疾病具有直接相关性9,10,11,12。
为了计算牵引力，需要使用一种能够测量已知材料特性基底在受力时发生形变的系统。这些形变必须随时间进行追踪，因此需要结合成像技术与图像处理方法。最早用于测定细胞牵引力的方法之一是观察并分析接种了细胞的胶原蛋白水凝胶的收缩情况，但该方法仅为半定量13。另一种更为精细的方法是通过测定单个细胞作用下薄层硅胶发生形变所产生的力，从而测量其牵引力14。随后，更定量化的测量技术被开发出来，这些方法还允许使用聚丙烯酰胺（PAA）等柔软水凝胶12,15,16。在使用这类软材料时，可通过测量嵌入水凝胶中随机分布的微珠在受力作用下的位移以及凝胶的力学特性，来确定牵引力16,17。另一项技术进步是开发出由柔软聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微柱阵列，通过测量微柱的弯曲程度，并利用梁理论将其转换为作用力18。
最后，研究人员开发了用于软性水凝胶微图形化的技术，这些方法能够控制细胞黏附的接触区域。通过测量细胞接触区域内微图形的形变，可以方便地计算牵引力，因为该方法无需力场自由的参考图像19。该技术已被广泛采用，因为它能够将规则排列的、微米尺度的、离散的荧光蛋白黏附点间接图形化至PAA凝胶上，用于细胞牵引力的测量20。为了计算这些力，已开发出一种图像处理算法，该算法可自动追踪每个微图形化点的位移，无需人工干预21。
尽管该方法在创建完整的点阵图案时较为简便，但在需要制备孤立点状区域（或称“岛状”）图案时则更为复杂。当需要控制细胞簇的形状以及在一定程度上控制其大小时，微米级图案化的岛状结构具有重要用途。为了制备这些岛状结构，前述的微接触印刷技术需要两个独立的步骤：i）使用一个PDMS印章在盖玻片上创建高保真度的点阵图案，然后ii）使用另一个不同的PDMS印章去除大部分点，仅留下孤立的点状岛21。原始方法在制备岛状结构时的难点在于，第一步中要稳定地制备一致的网格图案本身就具有挑战性。微打印印章由一系列圆形微柱阵列构成，其直径对应于所需点的大小。这些印章随后被涂覆一层均匀的蛋白质，并在精确控制的压力下压印到经过处理的盖玻片上，以形成所需的图案。一方面，对印章施加过大的压力可能导致蛋白质转移不均，由于柱体屈曲或柱间下垂而与玻璃表面发生非预期接触，从而降低图案保真度；另一方面，施加压力过小则会导致蛋白质转移量极少甚至无转移，同样造成图案保真度差。基于上述原因，人们期望开发一种仅需单步操作即可稳定、高质量地制备孤立点状岛微米图案的转移工艺。
本文介绍了一种在聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上间接微图形化微米级荧光蛋白黏附点岛状结构的方法，该方法比先前开发的方法更具一致性和通用性。以往的间接微图形化技术依赖于将蛋白质图案从聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章转移到中间基底上，而本文所提出的方法则相反，利用PDMS印章作为去除蛋白质的工具，而非用于添加蛋白质。该方法首先从根本上改变了所用PDMS印章的结构：不同于制备由均匀分布的圆形柱状结构组成的印章，本方法中的印章由均匀分布的圆形孔洞图案构成。
采用这种新结构后，可如先前所述20,29,30，用戊二醛处理这些PDMS印章的表面，使其能够与蛋白质发生共价键合。当将经戊二醛处理的PDMS印章用于均匀涂覆了荧光蛋白的玻璃盖玻片时，可去除盖玻片表面大部分的蛋白质，仅留下由印章上微米级小孔位置预先确定的所需点阵图案。这一改进提高了仅通过一步操作即可成功生成由近乎连续的点阵网格构成图案，以及形成孤立点岛结构的效率。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#281778</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>4 英寸 × 4 英寸 0.060 英寸低电阻铬光刻掩模</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>N/A</td><td>定制设计的掩模</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>#07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>#A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液，40%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A4058</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>#A20000</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>#PR-V3141</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Greenfield Global</td><td>#111000200C1GL</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，25 mm 圆形</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，30 mm 圆形</td><td>Warner</td><td>#64-1499</td><td></td></tr><tr><td>滨松 ORCA-R2 相机</td><td>滨松</td><td>#C10600-10B</td><td></td></tr><tr><td>人血浆</td><td>Valley Biomedical</td><td>#HP1051P</td><td>用于分离纤连蛋白</td></tr><tr><td>盐酸，1.0 N</td><td>Millipore Sigma</td><td>#1.09057</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband</td><td>#1.53n</td><td></td></tr><tr><td>可更换盖玻片培养皿套装</td><td>Bioptechs</td><td>#190310-35</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes 擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>#06-666-11C</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准仪</td><td>Karl Suss</td><td>#MA6</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2021</td><td>Mathworks</td><td>#R2021a</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Basic</td><td>Molecular Devices</td><td>#v7.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 活细胞染色剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>#R37605</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 IX2-ZDC 倒置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>#IX81</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>#52-1308-00</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶旋转涂布通风罩</td><td>Headway Research</td><td>#PWM32</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick</td><td>#PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>等离子刻蚀仪</td><td>TePla</td><td>#M4L</td><td></td></tr><tr><td>Prior Lumen 200Pro 光源</td><td>Prior Scientific</td><td>#L200</td><td></td></tr><tr><td>硅片，100 mm</td><td>University Wafer</td><td>#809</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2005</td><td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td><td>#NC9463827</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td><td>#NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体</td><td>Essex Brownell</td><td>#DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#448931</td><td></td></tr><tr><td>UAPON-40XW340 物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>#N2709300</td><td></td></tr><tr><td>紫外泛光曝光系统</td><td>Newport</td><td>#69910</td><td></td></tr><tr><td>晶圆载片托盘，110 × 11 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>#19395-40</td><td></td></tr></tbody></table>

微图案牵引力显微镜的图案生成

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

微图案牵引力显微技术可实现对单个细胞及细胞簇形态的控制。此外，由于该技术能够在微米尺度上进行图案化，因此可利用这些微图案化的接触区域来测量牵引力，每个微图案点可形成一个单独的黏着斑，进而使下方柔软的水凝胶发生形变。该方法已广泛应用于多种细胞类型，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板以及上皮细胞。
本文综述了将细胞外基质蛋白以预设大小和间距的规则点阵形式打印到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术发展历程。由于微米级图案难以直接打印在柔软的基底上，因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案，随后在凝胶形成过程中将该图案转移至水凝胶上。本文首先描述了在盖玻片上通过微接触印刷技术生成小点阵列的原始方法。为了在图案化点阵上控制细胞及细胞簇的形态，还需进行第二步操作，即去除大部分图案，仅保留小点组成的孤立区域。
接下来，介绍一种该方法的改进方案，该方案可通过单次减法图案化步骤实现点状岛结构的制备。这种方法大大简化了用户的操作流程，但其缺点是用于制造图案的主模板寿命有所缩短。最后，本文描述了用于分析位移点图像及细胞产生的牵引力场的计算方法，并提供了这些分析软件包的更新版本。

采用减法微图案化方法制备了具有 3.6 kPa 杨氏模量（E）和 0.445 泊松比（ν）的 PAA 水凝胶。水凝胶的厚度约为 100 µm，该厚度既允许使用本文所用成像装置进行观察，又能防止细胞感知凝胶下方刚性盖玻片的存在，从而避免对细胞刚性感知研究造成干扰23,33。已有多种不同刚度（最高达 30 kPa）的凝胶成功通过间接微图案化方法制备并成像34，因此该方法并不局限于仅使用 3.6 kPa 的水凝胶。盖玻片在使用前经戊二醛预处理，以确保在移除上层图案化盖玻片时，凝胶仍能牢固固定在下层盖玻片上（图 2C、D）。
为了可视化并测量细胞簇内的细胞牵引力，将3.6 kPa的水凝胶通过间接方式用荧光标记的纤连蛋白进行图案化（图2A<s...

我们介绍了一种对标准细胞牵引力测量方法的改进，该方法基于微接触印刷技术，通过在软性水凝胶上对细胞外基质蛋白点阵进行单步减法图案化，实现更简单且更一致的微岛图案制备，这对于控制细胞簇形态至关重要。

微图案牵引力显微技术可实现对单个细胞及细胞簇形态的控制。此外，该技术具备在微米尺度进行图案化的能力……

本方案可稳定地制备任意所需形状的高保真度蛋白质微图案，尤其适用于细胞簇研究中的孤立图案岛。该技术仅需一步即可制备任意形状和尺寸的孤立岛屿状微图案，而此前制备此类图案需要两个独立步骤。首先，按照制造商说明书中的建议比例，将PDMS与其固化剂充分混合。在室温和常压下孵育15分钟，然后在真空条件下脱气15分钟。将PDMS倒入主模具中，并转移至设定为37摄氏度的培养箱中过夜固化。从培养箱中取出主模具，使其冷却至室温。在母模冷却的同时，将25毫米的盖玻片在乙醇中进行10分钟的超声处理。盖玻片的数量应与所制备的印章数量相同。用去离子水彻底冲洗盖玻片，并使用过滤空气枪将其吹干。使用等离子清洗仪在高真空条件下对盖玻片进行等离子处理1分钟。处理后缓慢释放真空，以防止盖玻片在腔室内移动。在无直射阳光或顶灯照明的环境中，向每张盖玻片加入100 µL荧光标记蛋白溶液进行孵育。用盖片覆盖样品，以提供额外的避光保护，并在室温下孵育 20 分钟。用去离子水彻底冲洗每个盖玻片。将盖玻片侧面轻轻接触纸巾或类似的吸水材料，以去除表面多余的水分。将盖玻片置于黑暗环境中，不加盖，使其完全干燥至少30分钟。在蛋白质包被的盖玻片干燥的同时，使用解剖刀或任何锋利的刀片将PDMS印章从主模具上切割下来。在高真空条件下，对PDMS印章进行两分钟的等离子体处理。将印章置于带盖容器中，放入通风橱内，然后用10% 3-APTMS（溶于100%乙醇）的稀溶液在每个印章表面均匀涂覆一层薄层。盖上装有印章的容器，在室温下孵育五分钟。用去离子水彻底冲洗每个印章的两面。将印章置于洁净的容器中，并用去离子水中配制的2.5%戊二醛溶液覆盖。盖好容器，在室温下孵育30分钟。用去离子水充分冲洗印章。按照前述方法去除表面多余的水分，将印模在无遮盖条件下干燥30分钟。若30分钟后蛋白包被的盖玻片或印模仍未完全干燥，可使用过滤空气枪彻底吹干。将印模带有图案的一面朝向盖玻片，施加适当压力，使其充分接触。静置15分钟。然后小心地将PDMS印章从盖玻片上剥离。使用配备适当滤光片的荧光显微镜，检查图案化盖玻片的复制保真度。立即使用图案化盖玻片，或在避光条件下保存以备后续使用。在制备PAA水凝胶前体之前，将丙烯酸NHS酯从冰箱中取出，待其恢复至室温后再打开。使用前，先用70%乙醇对可更换盖玻片培养皿套装进行灭菌处理，然后在生物安全柜中用紫外光照射孵育至少30分钟。在通风橱中，将1.25毫升溶于去离子水中的40%丙烯酰胺加入15毫升锥形管中。向同一管中加入175微升溶于去离子水中的双丙烯酰胺溶液。然后加入500微升10×磷酸盐缓冲液（PBS），随后加入2.915毫升去离子水。将969微升该前体溶液用移液器转移至1.5毫升微量离心管中，并将剩余部分于4摄氏度保存，可保存长达两周。在新的微量离心管中称取50至100毫克APS，并用去离子水稀释至100毫克/毫升。在通风橱中打开NHS酯，小心地在微量离心管中称取最多3毫克NHS。用1X PBS将NHS酯稀释至每毫升含1毫克。在通风橱内，向含有969微升PAA前体溶液的微量离心管中加入2微升TEMED。加入15微升1摩尔盐酸以降低水凝胶溶液的pH值，防止NHS酯发生水解。向离心管中加入10 µL的NHS酯溶液。以下步骤均需在生物安全柜中进行。小心地将30 mm盖玻片放置于盖玻片培养皿组的中央位置，确保经3-APTMS和戊二醛处理的一面朝上，并将塑料环旋紧在顶部。将图案化盖玻片置于避光条件下，为下一步操作做好准备。取5微升APS溶液加入PAA前体分装管中，立即倒置混匀。随后迅速将35微升该溶液滴加到30毫米盖玻片上。将带有图案的盖玻片蛋白面朝下放入溶液中。注意避免在水凝胶中产生气泡。避光保护水凝胶，并使其聚合90分钟。水凝胶聚合后，使用剃刀刀片或手术刀去除上层盖玻片，确保移除后盖玻片不会回落或滑落至凝胶表面，以免破坏凝胶表面的图案。为钝化水凝胶中残留的NHS酯，向凝胶中加入2 mL无菌PBS，于37摄氏度孵育45分钟。随后立即进行实验所需的凝胶准备，或将其置于4摄氏度的无菌PBS中过夜保存，直至后续使用。水凝胶通过间接图案化荧光纤维连接蛋白，以可视化并测量细胞簇内的细胞牵引力，并形成预定大小和形状的岛状图案。图案质量直接取决于用于浇铸PDMS印章的母模的保真度。该方法可制备孤立且边界清晰、形状预设的岛状图案。纤维连接蛋白黏附点仅存在于岛状区域的预定范围内。这些孤立的黏附点岛状结构进一步实现了对簇状形态的更好控制。用少量3-APTMS对PDMS印章进行包被至关重要，因为用量过少会降低去除方法的有效性，而用量过多则会在印章表面产生橙色残留物。此处创建的图案可用于确定单个细胞和细胞簇的细胞牵引力，从而深入了解它们维持力学稳态的能力。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微图案牵引显微镜的图案生成

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

开发了一种微冲压光刻技术，用于在聚合物基底的顶面、侧壁和底面生成微米及亚微米级图案。该方法克服了导电聚合物图案化以及侧壁图案制备的难题，可实现多种结构的快速制造，且无需使用强腐蚀性化学试剂。...

用于在聚合物基底上生成微米及亚微米级图案的微孔冲压光刻技术

该视频介绍了用于研究细胞表型特化的微图形基底的制备方法。使用蛋白质包被的微图形PDMS印章，将微图形转移至PDMS包被的盖玻片上。随后用表面活性剂处理盖玻片，以抑制细胞在非目标区域的黏附。然后加入细胞，使其沉降并附着于图形区域，再进行培养以供后续分析。...

制备微图形化基底以研究施万细胞表型

本手稿介绍了一种利用单向拉伸对贴壁细胞或组织施加或释放力的技术。...

在PDMS膜上拉伸微图案化细胞

本方案提供了实施多光子光刻技术的详细步骤，用于在基于聚乙二醇的水凝胶中制备三维荧光基准标记阵列，作为无需参考物的牵引力显微镜检测平台。通过本方案，可简化三维材料应变的测量及细胞牵引力的计算，从而实现高通量牵引力测量。...

无参考牵引力显微镜平台的构建与应用

在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。...

通过红外激光辅助微图形化技术控制细胞几何形态

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。...

微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。...

通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境...

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

学习使用微接触印刷技术在软水凝胶上制备高精度蛋白质微图案的方法。该一步法工艺可创建各种形状和尺寸的孤立岛状图案，用于研究细胞簇的牵引力，为细胞力学研究提供可靠的技术支持。

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