利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

飞蝗是一种重要的农业害虫。本方法提供了一种高效且易于操作的基因编辑实验方案，系统而详细地介绍了利用CRISPR/CAS9技术构建纯合飞蝗突变体的方法，包括卵的收集、突变体筛选以及纯合品系的维持。首先，使用显微拉针仪拉制玻璃毛细管，制备显微注射针。

按照文稿中所述设置参数，然后使用微型研磨器研磨注射针尖。通过将一微升Cas9蛋白与一微升经验证的单导向RNA混合，制备用于注射的核糖核蛋白复合物。随后加入八微升无RNA酶的无菌水，使混合物终体积为10微升。

充分混匀溶液后置于冰上。接着，从产卵位置收集新产的卵荚，并等待卵子鞣化。30分钟后，用细刷在水中将卵从卵荚中分离，并用无菌水清洗卵子三次。

然后将卵放入培养皿中，并加入无菌水以保持湿润。用制备好的核糖核蛋白溶液填充注射针，将注射针装入显微操作仪。设置显微注射参数为：注射压力300 Hectopascals，注射时间0.5秒，补偿压力25 Hectopascals。

参数设置完成后，踩下脚踏板以评估注入溶液的体积。调节注射压力和注射时间，确保注射体积约为 50 至 100 纳升。将无菌卵在注射垫上规则排列后，将垫置于显微镜的载物台上，并调节显微镜的放大倍数，直至观察到卵。

然后在显微镜下调节显微注射针，直至可见注射尖端，并将针尖置于待注射卵的附近。选择合适的高度，以30至45度的角度开始注射。将针尖插入卵内靠近卵的微绒毛处，踩下脚踏板完成注射。

接下来，迅速拔出针头，并移动注射垫以注射下一个卵。将注射后的卵转移到含有湿润滤纸的培养皿中，置于30摄氏度的培养箱内。

注射后，每天观察注射卵的发育情况。在注射后的前五天内，每24小时将注射的卵转移至新的培养皿中。注射后第六天，随机挑选10枚卵转移至离心管中，加入两个钢珠，使用研磨仪在60赫兹频率下充分研磨6分钟。

研磨后，将残渣重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后取五微升重悬液加入45微升50毫摩尔氢氧化钠溶液中，在95摄氏度下裂解五分钟。为终止碱性裂解反应，向裂解体系中加入五微升一摩尔盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris hydrochloride）溶液。

取1 µL裂解产物作为PCR模板，扩增目的基因片段。PCR扩增并测序后，将测序结果与野生型序列进行比对，以评估CRISPR/Cas9系统是否在体内切割了目的基因。若在胚胎阶段检测到插入缺失突变（indels），则将剩余的卵继续培养以进行后续发育。

发育完成后，将孵化的若虫转移并培养至饲养笼中，具体操作如文中所述。当若虫发育至五龄若虫阶段时，使用塑料培养杯将其分隔。利用G0代突变体与野生型蝗虫进行杂交繁殖。

收集卵母细胞后，每个卵母细胞中使用三到六个已发育的卵子，按照之前所述方法检测突变。保留检测出突变阳性的卵母细胞用于后续发育，弃去突变阴性的卵母细胞。对于冷冻保存，用无菌水清洗卵子，并按照之前所述方法将其置于培养皿中孵育。

培养5至6天后，将卵收集到培养皿中，并用滤纸碎片覆盖。然后用石蜡膜包裹整个培养皿，在25摄氏度下放置2天，随后在13至16摄氏度的较低温度下再放置2天。

然后将培养皿转移至6°C的冰箱中。每两周向培养皿中添加水，以提供适合卵存活的湿润环境。最后，为复苏冻存的卵，将培养皿置于25°C条件下两天。

随后，将卵置于30摄氏度的培养箱中，直至若虫孵化。本研究中，CRISPR/Cas9系统的靶位点位于第一外显子。在Cas9切割实验中，CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物能够切割含有靶位点的PCR片段，切割效率约为55%。胚胎阶段突变率评估的测序结果表明，靶位点处发生了高效的基因组编辑。

编辑效率导致若虫孵化率达到52.73%，且66.67%的G0代成虫为嵌合突变体。此处展示了突变品系的传代策略。过量的纯合子卵被冷冻保存，以提高纯合子的利用率。

尽管冷冻保存时间的延长会导致冷冻卵的孵化率下降，但采取一些补救措施，例如使用滤纸碎片以及通过逐步升高的温度梯度对保存的卵进行复苏，有助于提高复苏效果。最重要的是尽量减少显微注射过程中造成的机械损伤。该方法可为获取其他昆虫提供参考。

某些细节部分，例如卵的收集方法、注射方式以及作物处理等，需要进行修改。该技术还可用于研究昆虫的变态发育及其环境适应性，而纯合型蝗虫突变体的构建则加速了该领域的研究进展。