通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血活性与磷脂酶活性

海葵毒素的研究必须采用最少数量的生物体和高效的实验方案，以获得丰富多样的毒素并快速鉴定特定毒素。我们结合了两种高效技术制备含有高浓度蛋白质的粗提物，并描述了可重复、特异、快速且经济的检测方法，用于鉴定海葵毒液中的溶血活性和磷脂酶活性。该方法几乎可应用于任何需要鉴定一种或两种类型细胞溶解毒素的研究实例。

该方法的高效性在于制备粗提物时严格控制每一步的时间。溶血的关键在于小心处理红细胞，避免机械性裂解；而在磷脂酶活性测定中，则需注意培养板制备过程中的温度控制。本次实验操作将由我实验室的 Santos Ramirez-Carreto 博士、生物学家 Sandra Salazar Garcia 以及生物学家 Giovanni Macias Martinez 进行示范。

首先用手取收集的海葵 A.doi，用蒸馏水清洗，以去除附着在身体上的大颗粒基质。立即将样本置于超低温冰箱中，在零下80摄氏度下冷冻72小时。随后，将样本放入专用玻璃容器中，在冻干条件下进行冷冻干燥，持续48小时。

组织水化时，将20克干重的冻干生物体与60毫升50毫摩尔磷酸钠缓冲液及一片蛋白酶抑制剂混合片剂重新悬浮。在磁力搅拌器中，以约800转/分钟的速度，在4°C条件下持续搅拌样品12小时。将样品在-20°C下冷冻12小时，以诱导细胞裂解和刺丝囊释放，随后将容器置于室温水中，直至样品解冻至90%。重复此步骤三次。

为澄清提取物，将样品在4 °C条件下以25,400 ×g离心40分钟。收集上清液并再次离心。重复该步骤三至四次，最终收集上清液。

回收的上清液或粗提物含有毒液成分以及其他细胞分子，如脂质、碳水化合物和核酸。使用商用Bradford比色法试剂盒测定粗提物的蛋白质浓度。将样品在室温下孵育5分钟，不振荡。

然后，在 595 纳米处测定吸光度。绘制样品 BSA 吸光度的平均值，并确定曲线方程，其中 y 为吸光度，m 为直线斜率，x 为蛋白质浓度，b 为截距。为分析粗提物，向 30 微克粗提物中加入 5 微升蛋白质上样缓冲液，以使蛋白质变性。

最终体积必须小于 50 µL。以 25 mA 恒定电流电泳运行 1 小时 30 分钟。为避免凝胶蛋白扩散，向蛋白中加入固定液，并在室温下以 80 RPM 振荡孵育 40 分钟。

然后，倾去溶液并加入蛋白质交联溶液。在室温下以 80 RPM 振荡孵育 30 分钟。移除溶液后，用 100 毫升蒸馏水洗涤凝胶 5 分钟。

随后，吸去水分，并重复此步骤四次。在室温下，使用50毫升考马斯亮蓝R-250过滤溶液，在实验室旋转振荡器上以60 RPM的速度搅拌15分钟，进行蛋白质染色。从绵羊颈静脉抽取1毫升血液，并将针头从注射器上取下。

立即将血液注入含有50毫升Alsever溶液的试管中，在4°C条件下以804 × g离心5分钟。弃去上清液，沿试管内壁缓慢加入30毫升Alsever溶液。使用巴斯德塑料移液管缓慢重悬沉淀，然后在4°C条件下再次以804 × g离心5分钟。

重复此步骤直至上清液澄清。保持阿尔塞弗溶液的最终体积，使细胞浓度约为每毫升200万个。然后使用血细胞计数板或血球计数板对细胞进行计数。

将溶液混合物在37摄氏度下孵育一小时，期间不振荡，然后在4摄氏度下以804 ×g离心五分钟。将上清液转移至另一块平底96孔板中。如果粗提物中含有细胞溶素，红细胞将会裂解并释放血红蛋白。

在 415 纳米处读取吸光度，并计算引起 50% 红细胞溶血的提取物量。增加海葵粗提物的用量，并使用适当的软件进行S形曲线拟合绘制图表。用含 1% SDS 的蒸馏水清洗一个鸡蛋，在无菌条件下将蛋黄与蛋清分离。

配制溶液 A、B、C 和 D。将 500 微升的溶液 A 和 C 加入溶液 B 中，并加入 100 微升的溶液 D。混合均匀后，将 25 毫升混合液倒入每个培养皿中。在无菌条件下等待溶液凝固，并用细管打出直径约 2 至 3 毫米的孔。在一个孔中加入 20 微升磷酸盐缓冲液作为阴性对照，在另一孔中加入 20 微升已知的磷脂酶作为阳性对照。

在其余孔中分别加入不同量的粗提蛋白，即 5、15、25、35 和 45 微克，每孔最终体积为 20 微升。在 37 摄氏度下孵育 20 小时。用于制备海葵粗提物的实验方案的代表性结果表明，结合使用振荡和反复冻融循环两种技术，可有效释放刺丝囊。

此处展示了刺激前后刺细胞的形态。图中可见刺丝囊小管已伸出，表明毒素已被释放。此处展示了海葵粗提物的电泳图谱。

通过15%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE分析海葵粗提物，结果显示其蛋白质分子量范围为10千道尔顿至250千道尔顿。其中，第1道为蛋白质ladder，第2道为海葵毒液。在15千道尔顿和20千道尔顿的分子量区域检测到细胞溶解素。

图中显示的是来自绵羊红细胞的溶血试验。在冻融循环之前和期间，提取物的溶血活性逐渐增加，至最后两个循环时，总粗提蛋白含量为 50 µg 时达到 100% 溶血。裂解 50% 绵羊红细胞所需的提取物量为 11.1 ± 0.3 µg/mL。

通过在琼脂平板上涂抹粗提物样品后形成透明晕圈的现象，可检测到磷脂酶活性。结果表明，当总蛋白量为15微克时，即可检测到磷脂酶活性。晕圈直径呈剂量依赖性增加，即粗提物用量增加时，晕圈直径也随之增大。

在进行该实验操作时，需确保诱导刺丝囊释放，定量总蛋白含量，通过SDS-PAGE电泳分析粗提物，计算引起50%溶血所需的粗提物蛋白量，并在磷脂酶活性检测中使用不同浓度的蛋白。我们可通过蛋白质组学技术分析粗提物，以鉴定在生物技术和生物医学中具有重要意义的多肽，甚至对某一独特分子进行谱型分析和表征，随后在实验室中对其进行制备以用于实际应用。我们已获得一种具有抗人难治性肺腺癌上皮细胞肿瘤活性的功能蛋白的部分序列。

同样，我们鉴定了具有生物技术意义的磷脂酶序列。