Name: 阴道成形术中的腹腔镜卵母细胞提取和冷冻保存治疗Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 了解腹腔镜阴道成形术联合卵母细胞提取与冷冻保存技术治疗Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征的方法。该技术通过单次麻醉完成手术，减少侵入性操作，为未来生育保留可能性。

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本研究未获得任何专项资助。

在2017年7月实施前，已通知并获得MRKHS三级转诊中心（意大利米兰圣拉斐尔科学研究医院大学医院）的当地伦理委员会批准该研究方案。所有患者或其监护人均签署了知情同意书，同意在阴道成形术期间进行腹腔镜取卵及卵母细胞冷冻保存，并同意将匿名化的临床和实验室数据用于科研目的。
1. 团队组成
<ol>
	<li>组建一个专门团队，成员包括一名经验丰富的腹腔镜外科医生、一名经验丰富的阴道外科医生、一名不孕症专家、一名专职心理学家和一名专职护士。</li>
	<li>在整个手术准备和实施过程中，团队共同协助患者。</li>
</ol>
2. 诊断性检查与咨询
<ol>
	<li>对患者进行经腹盆腔和腹部超声检查，以观察卵巢并评估窦卵泡计数（AFC）。检测抗苗勒管激素（AMH）的血液水平，以优化控制性卵巢刺激的促性腺激素起始剂量。根据国家/地区关于组织/配子冷冻保存的相关方案，进行传染病血清学检测（HIV-Ab、HCV-Ab、HBV-Ab、RPR-TPHA）。</li>
	<li>向患者提供关于MRKHS在性生活和生育方面的咨询，包括非手术和手术阴道成形术、与代孕相关的费用和法律法规、在实验项目背景下子宫移植的前景、可用于取卵的不同方法，以及卵子冷冻保存在活产率方面的表现。</li>
	<li>为患者提供心理评估，以支持其完成整个过程，并评估其情绪稳定性、承诺程度以及对未来成为母亲的意愿。获取患者签署的知情同意书，用于同时进行腹腔镜取卵、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术。对于未成年患者，应在父母在场的情况下进行临床评估，且由父母签署相应的知情同意书。</li>
</ol>
3. 手术流程与控制性卵巢刺激的时间安排
<ol>
	<li>根据临床团队（见上文）以及执行卵母细胞玻璃化冷冻的实验室人员的可安排时间，统筹规划腹腔镜取卵术、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术的联合手术流程。</li>
	<li>在手术日前第-14天开始进行控制性卵巢刺激（COS），预计COS持续时间为12天，并预留36小时从触发排卵到完成卵母细胞采集及玻璃化冷冻。</li>
	<li>若控制性卵巢刺激所需时间与预期不同，应相应调整手术时间。</li>
</ol>
4. 控制性卵巢刺激：起始剂量、剂量调整与监测、最终卵母细胞成熟触发
<ol>
	<li>在卵巢周期的任何阶段开始COS，这在临床实践中较为常见 &#34;随机起始&#34; 生育力保存方案</li>
	<li>根据患者的窦卵泡计数（AFC）和抗苗勒管激素（AMH）水平选择促卵泡生成素（FSH）/人绝经期促性腺激素（hMG）的起始剂量，并指导患者继续每日自行皮下注射。随后根据卵巢反应进行个体化的剂量调整。</li>
	<li>通过连续经腹超声检查及同步测定雌二醇水平监测卵巢反应2 以及P（第1天、第6天、第8天、第10天和第12天）。</li>
	<li>通过皮下注射0.2 mL促性腺激素释放激素类似物（曲普瑞林）以触发卵母细胞的最终成熟。</li>
</ol>
5. 临床操作（腹腔镜）：卵母细胞采集
<ol>
	<li>将患者置于改良的截石位，以便同时良好地接触腹部和会阴区域。实施全身麻醉，并按照常规术中抗生素预防方案静脉注射2 g头孢唑林。放置经膀胱的弗利导尿管。</li>
	<li>使用脐周气腹针建立气腹，在脐部置入一个10 mm套管针用于插入腹腔镜，在右上腹和左上腹各置入一个5 mm套管针。在腹腔镜视野下，通过右侧和左侧套管针分别穿刺右侧和左侧卵巢，使用一根17 G单腔针连接抽吸泵，该针通常用于经阴道取卵操作。</li>
	<li>使用腹腔镜钳提起并固定卵巢，以利于卵泡的暴露。当抽吸多个相邻卵泡时，保持针尖位于卵巢内，以减少卵巢皮质穿刺次数及相应的出血风险。</li>
</ol>
6. 临床操作（腹腔镜）：阴道成形术
注意：与 Davydov 腹腔镜改良术式相比，阴道成形术的步骤保持不变12。
<ol>
	<li>在两侧始基子宫角之间的腹膜索横向切开并提起，横向切开腹膜，然后将切口向前、向侧方和后方延伸。</li>
	<li>在每个半骨盆中，从膀胱上方游离的腹膜开始，使用2-0单丝聚对二氧环己酮可吸收缝线（PDS）作荷包缝合，依次贯穿缝合圆韧带、输卵管峡部、子宫卵巢韧带和侧方腹膜叶；随后将两根缝线分别包含直肠系膜的外侧部分以及直肠浆膜的前部，位置紧邻直肠乙状结肠交界处下方。</li>
	<li>经会阴途径显露阴道凹陷，行H形切口，通过锐性与钝性分离膀胱直肠间隙来创建人工阴道腔隙。然后将游离的腹膜边缘下拉至阴道前庭边缘。使用3-0 PDS缝线行间断缝合，完成腹膜-前庭吻合。最后，在腹膜覆盖的人工阴道内放置一层石蜡涂层纱布。</li>
</ol>
7. 体外受精实验室：取卵前一日
<ol>
	<li>根据预期卵泡数量，准备2至5个圆底试管，每管加入9 mL含HEPES的Quinn's Advantage培养基（添加5%人血清白蛋白[HSA]），并在37 °C下孵育过夜。</li>
	<li>准备一至两个4孔培养皿，每孔加入0.5 mL受精培养基（添加5% HSA），并在其上覆盖0.5 mL矿物油用于胚胎培养，在控制气体环境（6% CO2、5% O2）中37 °C孵育过夜。</li>
	<li>准备一个培养皿，内含9滴（每滴30 µL）连续单细胞培养（CSCM）培养基（添加10%血清替代补充剂[SSS]），并在其上覆盖6 mL矿物油。在控制气体环境（6% CO2、5% O2）中37 °C孵育过夜。</li>
</ol>
8. 体外受精实验室：卵母细胞采集步骤
<ol>
	<li>配制含肝素的Quinn's Advantage HEPES培养液（添加5% HSA），使肝素终浓度为10 IU/mL，用于收集卵泡液。</li>
	<li>与常规经阴道取卵术类似13，将卵泡液收集至10 mL圆底试管中，置于便携式培养箱内保温（37 °C），并立即转运至胚胎实验室，转运时间约为10分钟。</li>
	<li>在预热的无菌90 mm培养皿中检查卵泡液，以识别卵丘-卵母细胞复合体（COC）。一旦发现COC，立即将其转移至中心井培养皿中，用1 mL预热的Quinn's Advantage HEPES培养液（添加5% HSA）冲洗。</li>
	<li>待所有COC收集完毕后，将其转移至含受精培养液的4孔培养皿中，并在培养皿盖子和底部标记患者身份信息。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、可控气体环境（6% CO2、5% O2）中培养。</li>
	<li>确保由实验室另一名工作人员对操作过程进行双重核对。</li>
</ol>
9. 卵母细胞去丘化
<ol>
	<li>在排卵触发后38小时内完成卵丘细胞/放射冠细胞的去除。</li>
	<li>配制含HEPES的Quinn's Advantage培养基（添加5%人血清白蛋白[HSA]），并加入透明质酸酶，使其终浓度为10 IU/mL。</li>
	<li>准备中心井培养皿，其中加入1 mL预热的含透明质酸酶的Quinn's Advantage HEPES培养基（添加5% HSA），另准备一个加入1 mL预热的HEPES缓冲培养基（添加5% HSA）。</li>
	<li>在卵母细胞去核培养皿上标注患者身份信息。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）放入含酶的中心井中，轻轻吹打溶液中的COCs上下移动，持续最多30秒，以分散卵丘细胞。</li>
	<li>将卵母细胞转移至第二个仅含HEPES缓冲培养基的中心井培养皿中，注意尽量减少酶的带入。</li>
	<li>使用内径逐渐减小（170–140 µm）的去核吸管去除残留的放射冠细胞。</li>
	<li>评估卵母细胞成熟阶段，根据第一极体排出的特征，将处于第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞与第一次减数分裂中期（MI）卵母细胞及生发泡期（GV）卵母细胞区分开来。</li>
	<li>将MII期卵母细胞转移至含有九滴（每滴30 µL）连续单细胞培养基（CSCM）（添加10%血清替代补充物[SSS]）的IVF培养用60 mm培养皿中，并覆盖6 mL矿物油。</li>
	<li>在37 °C、控制气体环境（6% CO2，5% O2）中进行培养。</li>
</ol>
10. 卵母细胞玻璃化冷冻
<ol>
	<li>在卵母细胞去颗粒后立即按照玻璃化冷冻试剂盒制造商提供的方案对MII期卵母细胞进行玻璃化冷冻。</li>
	<li>在操作前约30分钟，将平衡液（ES）、玻璃化冷冻液（VS）和洗涤液（WS）置于室温（25–27 °C）下平衡。 
	注意：根据制造商说明，ES含有7.5%二甲基亚砜（DMSO）、7.5%乙二醇、20%右旋糖酐血清补充剂（DSS）、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液；VS含有15% DMSO、15%乙二醇、0.5 M蔗糖、20% DSS、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液；WS含有20% DSS、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液。</li>
	<li>使用Cryotop作为冷冻装置，其由附着在塑料手柄上的透明薄膜细条构成。</li>
	<li>在冷冻装置上标注患者姓名、出生日期、编号、冷冻日期以及单个装置上装载的卵母细胞数量。</li>
	<li>在玻璃化冷冻培养皿上标注患者姓名和编号。</li>
	<li>确保有见证操作人员核对冷冻装置和培养皿上的患者信息是否正确。</li>
	<li>用新鲜液氮将冷却盒灌满至顶部，并在使用前盖好，以尽量减少液氮的扩散和蒸发。</li>
	<li>使用内径为170 µm的吹打移液管，以避免在操作过程中损伤卵母细胞。</li>
	<li>使用前轻轻摇动ES、VS和WS的每个小瓶，以充分混匀内容物。</li>
	<li>在60 mm培养皿的盖子上准备一滴50 µL的WS1（图1A）。</li>
	<li>在即将使用前放置液滴，以减少培养基蒸发。</li>
	<li>从培养箱中取出卵母细胞培养皿，将MII期卵母细胞（每次最多3个）连同极少量培养基从培养皿转移至50 µL的WS中。</li>
	<li>在邻近位置分别加入50 µL的WS2、ES1和ES2液滴，并将卵母细胞从WS1液滴转移至WS2液滴（图1B）。</li>
	<li>将ES1液滴与WS2合并，并静置2分钟，使两种溶液自然混合。</li>
	<li>随后将ES2液滴与先前合并的液滴合并，继续静置2分钟。</li>
	<li>最后，将一个新的100 µL ES3液滴与先前合并的液滴合并，再静置1分钟。</li>
	<li>将卵母细胞放入100 µL的ES4液滴中，孵育10分钟（图1C）。</li>
	<li>分别准备两个50 µL的VS液滴和一个100 µL的VS液滴（图1D）。</li>
	<li>将卵母细胞依次移入三个VS液滴中，共孵育60秒，每个液滴中停留约20秒。</li>
	<li>当60秒孵育时间还剩约10秒时，将冷冻装置置于显微镜下。</li>
	<li>用移液管尖端携带卵母细胞，并以最少的VS液体量将其放置在冷冻装置上。</li>
	<li>吸除多余的VS，仅保留一层薄薄的VS覆盖卵母细胞。</li>
	<li>立即将冷冻装置直接浸入液氮中并快速移动。将装置保持在液氮中，并盖上保护盖。</li>
	<li>将冷冻装置存入储存系统（例如visiotube），并放入液氮罐中。在实验室数据库和记录表中登记冷冻保存信息。</li>
</ol>
11. 住院术后护理
<ol>
	<li>术后48小时移除导尿管和阴道内石蜡纱布。</li>
	<li>移除后对患者的新阴道进行指检，并指导患者如何自行进行指检。随后，将雌激素凝胶涂抹于阴道模具（长9 cm，直径2 cm）表面（以促进上皮化），并指导患者如何插入并维持模具位置。</li>
	<li>从术后第3天开始，每日指导患者正确放置模具，并确保其每日至少维持在位2小时。</li>
	<li>若无并发症发生，于术后第5至6天安排患者出院。</li>
</ol>
12. 门诊术后护理
<ol>
	<li>指导患者在住院期间使用的相同模具（长9 cm，直径2 cm）进行阴道扩张，持续2个月，之后更换较大的模具（长11 cm，直径2.5 cm）。</li>
	<li>在术后3个月复诊后，允许患者开始性生活，并告知其在未进行性交的日期仍需继续使用模具。</li>
</ol>
13. 随访
<ol>
	<li>在术后1、3、6和12个月安排随访。</li>
	<li>每次随访时，评估患者对扩张训练的依从性，并询问其是否存在日常生活活动受限、疼痛、泌尿系统症状或性功能障碍（自术后第三个月随访起）。每次随访均应进行妇科检查，测量阴道宽度、长度、悬吊情况以及附件的活动度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案通过结合阴道成形术与卵母细胞采集术，降低了MRKHS治疗的侵入性。为此，必须指定一个专门的团队，以确保促排卵周期控制（COS）、手术操作以及卵母细胞玻璃化冷冻的时间安排高效协调。
预计从这种联合腹腔镜方法中获益最多的MRKHS患者，是那些由于卵巢位于骨盆壁侧方14，或靠近肝脏、胆囊9等器官，或存在盆腔肾，而导致经阴道取卵在技术上具有挑战性或不可行的患者。对于这些患者，理论上可采用经腹取卵方式，文献中已有相关报道：然而，平均仅获得4.92 ± 1.7个卵母细胞15，提示由于技术限制导致取卵效果不理想。此外，在某些情况下，经腹途径可能困难甚至无法实施，例如腹壁明显增厚，或因肠管覆盖导致卵巢可视性差的患者16。
安全性是该方法的一个显著优势。除了上述最佳可视化和操作通路的优势外，将两种手术合并为一种可降低...

MRKHS 的发病率约为每 4-10,000 名女性中有 1 例，占原发性闭经病例的 15%。MRKHS 的特征是先天性缺失阴道上段和子宫，而泌尿系统及骨骼异常则存在不同程度的伴随表现。更具体而言，通常可见深度为 1-2 cm 的阴道残端，且可能发现两个退化的子宫角1。
过去，医学界对MRKHS的主要关注在于实现正常的性交功能，这通常需要通过非手术或手术方法构建人工阴道2然而，随着生殖医学的进步，目前可通过代孕方式使MRKHS患者实现遗传学意义上的母亲身份3,4 或更近来的子宫移植5尽管子宫移植仍属于实验性手术，但代孕在世界许多国家已有提供6，且报告的产科和心理社会结局与标准方法相当 体外 受精与卵子捐赠7.
代孕和子宫移植均需要进行卵母细胞采集 体外 受精，但对于苗勒管发育不全综合征（MRKHS）患者如何实施取卵操作尚无共识。由于阴道弹性不足，经阴道途径可能难以实施8 即使在阴道成形术后，卵巢位置仍不典型9或卵巢与阴道残端之间的距离过大4,10在这些情况下，腹腔镜取卵在手术入路方面是最佳方法。然而，由于目前大多数MRKHS患者接受腹腔镜下人工阴道成形术，我们建议在进行阴道成形术的同时施行腹腔镜取卵11，随后对卵母细胞进行冷冻保存以备将来使用，从而在最小化侵入性的同时，结合治疗MRKHS患者的性功能与生殖功能。
患者的 demographic 数据 
截至目前，共有23名MRKH患者接受了本方案的治疗。患者的病史、仪器检查和实验室检查结果总结于表1中。除非在表1中另有说明，否则未发现其他相关的先天性异常。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;卵母细胞采集程序&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;设备&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Cooper Surgical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>便携式培养箱</td><td>Cooper Surgical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;耗材&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>4孔培养皿</td><td>Nunc</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Nunc</td><td>FA9150270</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 培养皿</td><td>Nunc</td><td>FA9150360</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（5%）中含人血清白蛋白 100 mg/mL</td><td>Origio</td><td>3001</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养用矿物油</td><td>Origio</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>单孔培养皿</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05</td><td></td></tr><tr><td>Quinn&amp;rsquo;s Advantage 受精培养基 SAGE</td><td>Origio</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>含 HEPES 的 Quinn&amp;rsquo;s Advantage 培养基</td><td>Origio</td><td>1024</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;卵母细胞去颗粒细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;设备&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 可调节手柄套装</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Cooper Surgical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;耗材&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4孔培养皿</td><td>Nunc</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>CSCM（连续单细胞培养）培养基</td><td>Fujifilm irvine Scientific</td><td>90165</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（5%）中含人血清白蛋白 100 mg/mL</td><td>Origio</td><td>3001</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90101</td><td></td></tr><tr><td>IVF 培养用 60 mm 培养皿</td><td>Nunc</td><td>FA9150270</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养用矿物油</td><td>Origio</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>单孔培养皿</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05</td><td></td></tr><tr><td>含 HEPES 的 Quinn&amp;rsquo;s Advantage 培养基</td><td>Origio</td><td>1024</td><td></td></tr><tr><td>血清替代补充剂</td><td>Fujifilm irvine Scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去卵丘细胞移液吸头（140 &amp;mu;m）</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1140-10BS-5</td><td></td></tr><tr><td>去卵丘细胞移液吸头（170 &amp;mu;m）</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;卵母细胞玻璃化冷冻&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>NUNC</td><td>150255</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>NUNC</td><td>150270</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 培养皿</td><td>NUNC</td><td>150360</td><td></td></tr><tr><td>冷却架容器</td><td>Kitazato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻装置/冷冻载杆（Cryotop）</td><td>Kitazato</td><td>81111</td><td></td></tr><tr><td>电子计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet</td><td>COOK</td><td>K- 1000</td><td></td></tr><tr><td>Gilson 移液器</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>LabXpert 实验室打印机</td><td>Brady</td><td>XSL-86-461</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td>2160G</td><td></td></tr><tr><td>2-20 &amp;micro;L 吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td>2139-HR</td><td></td></tr><tr><td>Visotubes</td><td>Cryo Bio System</td><td>20</td><td></td></tr><tr><td>玻璃化冷冻试剂盒</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90133-SO</td><td></td></tr><tr><td>玻璃化解冻试剂盒</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90137-SO</td><td></td></tr></tbody></table>

腹腔镜取卵与卵子冷冻保存在 mayer-rokitansky-küster-hauser 综合征阴道成形术中的应用

Laparoscopic Oocyte Retrieval and Cryopreservation during Vaginoplasty for Treatment of Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser Syndrome

对于计划接受腹腔镜阴道成形术且有生育意愿的梅耶-罗基坦斯基-屈斯特-豪泽综合征（MRKHS）患者，我们建议同时进行腹腔镜取卵并行卵母细胞冷冻保存。取卵操作在腹腔镜手术开始时进行。分别于右侧和左侧置入5 mm穿刺套管，通过套管使用17 G取卵针穿刺右侧和左侧卵巢。为便于卵泡暴露，使用腹腔镜抓钳游离并固定卵巢。
当抽吸多个相邻卵泡时，针尖保留在卵巢内，以减少穿刺卵巢皮质的次数，并降低固有的出血风险。后续步骤与Davydov腹腔镜改良式阴道成形术相同。手术前，采用促性腺激素释放激素（Gn-RH）拮抗剂方案进行控制性卵巢刺激，并在最终卵泡成熟触发后36小时安排同期进行取卵术与阴道成形术。卵泡液收集于与经阴道取卵术中相同的10 mL无菌试管中，置于加热块（37 °C）内转运至辅助生殖实验室，在该处将成熟（第二次减数分裂中期）卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。
在本病例系列中，23例MRKH综合征女性患者均成功获取并冷冻保存了卵母细胞；随后按原计划实施了阴道成形术，未作任何修改，住院及门诊术后护理（导尿管拔除时间、出院时间、扩张器使用情况及随访时的舒适度）均未受影响。1例患者出现术后并发症（术后第5天发热及经腹超声检测到腹腔积液），经保守治疗后痊愈。该方法避免了先进行手术阴道成形术而延迟卵母细胞获取的传统做法，而是将两项操作整合于一次腹腔镜手术中完成，从而最大限度地减少了手术创伤及麻醉相关风险。

表2 包含患者的卵巢刺激数据，而主要的手术和功能结局见表3。所有患者均成功联合实施了取卵术与阴道成形术的同期腹腔镜手术。平均获取卵母细胞11.4 ± 5.4（均值 ± 标准差）枚，其中平均冷冻保存成熟卵母细胞（MII期）9.6 ± 4.3枚（表3）。根据我们在接受辅助生殖技术（ART）患者中进行卵母细胞冷冻保存的经验，采用本玻璃化冷冻方案后，解冻后卵母细胞存活率——定义为卵胞浆内单精子注射时形态完整的卵母细胞所占比例——为84.5 ± 19.3%。手术总平均时间为114 ± 17分钟，所有患者的术中出血量均极少（&lt;50 mL），且未发生术中不良事件。所有患者术后第2天拔除导尿管和阴道纱布。术后第3天开始每日使用扩张器，平均于术后第6.0 ± 1.0天出院。1例患者出现术后并发症（术后第5天发热，并经腹部超声检查发现腹腔积液），经口服抗生素治疗后痊愈，并于术后第9天出院。术后随访证实手术在解剖结构和功能上均获得成功。所有患者均未报告日常生活活动受限、疼痛或泌尿系统症状。
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一个专业的团队可以为苗勒管发育不全（Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser）患者提供在腹腔镜阴道成形术的同时进行控制性卵巢刺激和卵母细胞冷冻保存的选择。

腹腔镜取卵与卵子冷冻保存在 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser 综合征阴道成形术中的应用

在计划接受腹腔镜阴道成形术且有生育意愿的梅耶-罗基坦斯基-屈斯特-豪泽综合征（MRKHS）患者中，……

本方法通过结合腹腔镜阴道成形术与卵母细胞采集，用于未来生育治疗，从而减少Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser综合征治疗过程中的侵入性损伤。本方法的主要优势在于仅需一次麻醉，同时解决了年轻Rokitansky患者无法经阴道取卵的技术难题。该手术将由本不孕症科室资深妇科医生Diana Delprato，以及本辅助生殖实验室的两位资深临床胚胎学家Alessandra Alteri和Greta Cermisoni共同演示。从手术当天起第14天开始进行控制性卵巢刺激。通过连续经腹超声检查以及同时测定雌二醇和孕酮水平来监测卵巢反应。采用开放式技术建立气腹。在脐部置入一个10毫米的套管针用于插入腹腔镜，另在中央、右下和左下象限各置入三个5毫米的套管针。在腹腔镜视野下，使用一根连接于负压吸引泵的17号单腔针，通常经中央和左侧套管针分别穿刺右侧和左侧卵巢，用于经阴道取卵。使用腹腔镜钳提起并固定卵巢，以利于卵泡的暴露。当抽吸多个相邻的卵泡时，应保持穿刺针尖位于卵巢内，以减少卵巢皮质被穿透的次数，从而降低出血风险。通过提起并横向切开两个始基子宫角之间的腹膜条索来分离腹膜，随后将切口向侧方、前方和后方延伸。经会阴途径显露阴道凹陷处，行H形切口，并通过锐性与钝性分离膀胱直肠间隙，创建人工阴道腔隙。然后，将游离的腹膜边缘向下牵拉至阴道前庭边缘。使用聚对二氧环己酮合成可吸收3-0缝线进行腹膜与前庭的间断缝合。在每一侧半骨盆，自膀胱上方游离的腹膜处开始，采用聚对二氧环己酮合成可吸收2-0单丝线做荷包缝合，贯穿缝合圆韧带、输卵管峡部、子宫卵巢韧带以及侧方腹膜皱襞。然后，将两针缝线分别穿过直肠系膜的侧方以及直肠乙状结肠交界处下方的直肠浆膜前壁。最后，在腹膜覆盖的新阴道内放置一块石蜡涂层纱布。将卵泡抽吸液收集至预热的10毫米圆底试管中，试管置于便携式培养箱内保温，并立即转运至胚胎实验室，转运时间约为10分钟。收集完所有卵丘-卵母细胞复合体后，将其放入含有受精培养液的四孔培养皿中，并在皿盖和皿底标记与患者身份相关的信息。将培养皿置于含6%二氧化碳和5%氧气的控制气氛中，于37摄氏度孵育。确保由实验室另一名工作人员对操作过程进行双重核对。在诱发排卵后38小时内进行卵丘-放射冠细胞去除。将卵丘-卵母细胞复合体置于中央孔中，孔内含有用于分散卵丘细胞的酶，用玻璃巴斯德吸管轻轻吹打含有卵丘-卵母细胞复合体的溶液，上下吹打时间不超过30秒。将卵母细胞转移至第二个中央孔培养皿中，该孔仅含HEPES缓冲培养基，并确保带入的酶量最少。使用内径逐渐减小的去丘 pipette 去除残留的冠状细胞。评估卵母细胞成熟阶段，并分离出处于第二次减数分裂中期（metaphase II）的卵母细胞。将 metaphase II 卵母细胞转移至一个含有九滴连续单细胞培养液并覆盖六毫米矿物油的 60 毫米 IVF 培养培养皿中。在含有6%二氧化碳和5%氧气的控制气氛中，于37摄氏度下孵育。用新鲜的液氮将冷冻盒完全填满，并在使用前盖好，以尽量减少扩散和蒸发。使用内径为170微米的吹打移液管，以避免在操作过程中损伤卵母细胞。使用前轻轻振荡平衡液、玻璃化冷冻液和洗涤液的每个小瓶，以混匀内容物。在60毫升培养皿的盖子上，用微量移液器加入一滴50微升的洗涤液一。请在使用前立即放置液滴，以减少培养基蒸发。从培养箱中取出卵母细胞培养皿，用最小体积的培养基将中期 II 卵母细胞从培养皿转移到 50 微升洗涤液中。在相近位置分别加入 50 微升的洗涤液二、平衡液一和平衡液二。将卵母细胞从洗涤液一液滴转移至洗涤液二液滴。将平衡液一液滴与洗涤液二液滴合并，静置 2 分钟，使两种溶液自然混合。然后，将第二份平衡液液滴与之前合并的液滴融合，并静置额外两分钟。最后，将一份新的100微升平衡液三与之前合并的液滴融合，并再静置一分钟。将卵母细胞放入100微升的平衡液四中，持续10分钟。加入两滴50微升的玻璃化冷冻液和一滴100微升的玻璃化冷冻液。将卵母细胞依次放入这三滴玻璃化冷冻液中，每滴停留约20秒，总共孵育60秒。在60秒孵育结束前约10秒时，将冷冻载具置于显微镜下。将卵母细胞携带在移液管尖端，用最少的玻璃化冷冻液将其放置在冷冻装置上。吸除多余的玻璃化冷冻液，使卵母细胞仅覆盖一层薄薄的玻璃化冷冻液。立即将冷冻装置直接浸入液氮中，并迅速移动。将装置置于液氮中，并用保护盖覆盖。所有患者均成功联合实施了腹腔镜取卵术和阴道成形术。平均获取11.4 ± 5.4个卵母细胞，其中平均9.6 ± 4.3个M2期卵母细胞被冷冻保存。总平均手术时间为114±17分钟。所有患者的术中出血量均不显著，且未观察到术中不良事件。术后第3天，患者开始每日使用扩张器，并于第6.0±1.0天出院。建议谨慎抽吸卵巢内的卵泡，同时密切注意卵巢的自动移动，以确保最佳的进入和取卵效果。

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医学

阴道成形术中的腹腔镜卵母细胞提取和冷冻保存治疗Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征

在妇科手术前进行的体外成熟（IVM）（OP-IVM）将取卵后的体外成熟技术与常规妇科手术相结合，是传统IVM技术在生育力保存领域应用的延伸。...

OP-IVM：取卵后卵母细胞体外成熟与妇科手术的结合

多个国际科学学会已将卵母细胞冷冻保存技术认定为青春期后女性生育力保存的金标准。恰当的临床与实验室策略可确保生育力保存治疗的最大有效性、效率和安全性。...

通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

我们介绍了针对卵巢功能严重障碍患者进行无药物体外激活（IVA）卵巢卵泡的实验室操作步骤。该方法可增加每次卵巢超促排卵中可获取的卵母细胞数量，有助于此类患者的生育力保存。...

严重卵巢功能障碍患者的生育力保存

本方案描述了一种用于评估25岁以下需要通过卵巢组织冷冻保存来实现生育力保存的患者卵巢储备功能的方法。该方法包括：（1）对皮质样本进行卵巢储备功能的组织学评估，（2）与参考数据集进行比较，以及（3）计算Z评分。...

评估年轻生育力保存患者卵巢储备功能的Z评分

介绍了一种用于卵巢组织玻璃化冷冻的方案，该方案可作为广泛使用的慢速冷冻法的一种替代性冷冻保存方法。...

卵巢皮质组织玻璃化以实现聚集的玻璃态

本文介绍了一种在取卵后快速去除部分卵丘-卵母细胞复合体的优化方法，可加速体外受精（IVF）的观察过程，缩短颗粒细胞去除所需时间，减少卵母细胞对外界环境的暴露，且不影响胚胎发育，从而提高IVF实验室操作的效率。...

卵丘-卵母细胞复合体的即时部分去除：一种用于快速观察体外受精的优化方法

我们介绍一种在现行药品生产质量管理规范（cGMP）指导下，使用无动物源性试剂分离和培养人羊膜上皮细胞（hAECs）的实验方案。...

用于临床应用的人羊膜上皮细胞的分离、冷冻保存与培养

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耐药性颞叶癫痫患者卵圆孔电极记录的网络分析

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经腋窝入路第一肋骨切除术治疗胸廓出口综合征

本文介绍了一种通过在处理输尿管末端之前预先切开脐韧带，以扩大手术视野并降低经腹腔腹腔镜全输尿管肾切除术难度的操作方案。...

上尿路尿路上皮癌腹腔镜根治性肾输尿管切除术中输尿管远端的手术改良

了解腹腔镜阴道成形术联合卵母细胞提取与冷冻保存技术治疗Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征的方法。该技术通过单次麻醉完成手术，减少侵入性操作，为未来生育保留可能性。

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