研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

这些实验方案可用于研究对微孢子虫的遗传性免疫。本文介绍的技术有助于我们理解免疫特性如何跨代传递，以及决定子代对微孢子虫免疫能力的分子机制。C.elegans 是一种遗传操作简便、世代周期短的简单模式生物，适用于遗传研究。

可利用多种适用于线虫的研究工具来揭示跨代免疫的分子机制。在感染 P0 代动物时，应使用较低的孢子剂量，以避免显著影响亲代产生后代的能力。这可确保后续漂白操作能够获得足够数量的 F1 代动物用于下游实验。首先，在计划进行感染的前一天，将所需数量的 10 厘米未接种线虫生长培养基平板从 4°C 转移至室温。

感染前，将约 2,500 条同步化的 L1 虫在微量离心管中以 1,400 × g 离心 30 秒，形成沉淀。用移液器吸头吸除上清液，使虫体保留在 50 微升 M9 培养基中。向单阶段虫体中加入 1 毫升 10 倍浓度的 大肠杆菌 OP50 菌株，以及适量浓度的 N. parisii 孢子。

作为未感染的对照，准备一个含有 L1 期线虫和 OP50 的等量试管，加入与所用孢子制备液等体积的 M9 培养基。将 L1 期线虫样品短暂涡旋混匀，并将超过一毫升的线虫接种到一个 10 厘米未接种的线虫生长培养基平板上。轻轻旋转平板，确保液体均匀覆盖整个平板表面。

将培养板置于洁净柜中，打开盖子干燥10至20分钟，或直至完全干燥，然后在21摄氏度下培养72小时。感染后72小时，在解剖显微镜下观察培养板。感染线虫的培养板中的胚胎数量应少于未感染线虫的培养板。

然后用1毫升M9培养基将线虫从培养板上冲洗至微量离心管中。如果仍有大量线虫残留在培养板上，可在1400 × g条件下离心30秒，使线虫沉淀。弃去上清液，并进行额外的培养板冲洗。

在室温下以1400 × g离心30秒，使线虫沉淀，用1毫升M9培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。将线虫重悬于最终体积为1毫升的M9培养基中，通过移液充分混匀。取100微升悬浮线虫转移至新管中，对剩余的900微升进行漂白处理，以裂解成虫并释放F1代胚胎用于检测。

按照文稿中所述进行感染操作的修改。感染后72小时，在解剖显微镜下观察培养板。

与诱导过的线虫平板相比，未经诱导的线虫平板上的线虫体型应更小，且包含的胚胎数量更少。随后，开始对线虫进行染色和固定处理：用1毫升含0.1% Tween 20的M9培养基将线虫从平板上冲洗下来，收集至微量离心管中。若仍有大量线虫残留在平板上，可在室温下以1,400 × g离心30秒使线虫沉淀，用移液器吸头移除上清液，并进行额外的平板冲洗步骤。

将线虫在室温下以1,400 × g离心30秒形成沉淀后，用1毫升含0.1% Tween 20的M9培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。去除上清液，加入700微升丙酮，于室温固定线虫10分钟。将固定后的线虫在室温下以10,000 × g离心30秒形成沉淀，并用1毫升含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤两次。

准备 50 毫升 DY96 工作液，用锡箔纸包裹容器，并将其存放在抽屉中以避免光照。向线虫沉淀中加入 500 微升 DY96 工作液，在室温避光条件下旋转孵育 30 分钟。在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒，沉淀线虫，然后弃去上清液。

然后，加入15微升含或不含DAPI的封片剂。用移液器吸取10微升染色后的线虫样品至显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。为分析载玻片上DY96染色的线虫，使用荧光显微镜的GFP通道进行成像。

为了评估线虫群体的适应性，使用 5X 或 10X 物镜对每种条件下超过 100 条线虫进行生殖力分析。在感染后 72 小时，固定 F1 代动物并用 DY96 染色，以评估其对微孢子虫的抗性。在感染后 72 小时，对感染的亲代群体和未感染的对照组进行固定，并用 DY96 染色，以观察线虫胚胎和微孢子虫孢子。

受感染的动物体型较小，含有大量微孢子虫孢子，且产生的胚胎数量少于健康未感染的对照组。对线虫生殖能力的评估显示，约95%的未感染动物可产生后代，而受感染动物的比例则低于80%。定量分析表明，约90%经微孢子虫处理的群体被感染，该数据基于含有DY96染色孢子的线虫数量确定。对这些固定样本的定量结果显示，经预处理的线虫所含胚胎数量显著多于未受预处理的对照组，表明其在感染压力下具有更高的适应性。

使用 Fiji ImageJ 分析单个未免疫和免疫预处理线虫的寄生虫负荷，即线虫体内充满荧光 N.parisii 孢子部分所占的百分比。定量结果显示，来自感染亲本的线虫其寄生虫负荷显著降低。此外，对单个线虫体长的计算表明，在 N.parisii 感染条件下，预处理线虫相较于未免疫线虫具有显著的生长优势。

成像研究表明，未免疫动物通常含有多个孢子和若干感染细胞，而免疫动物的孢子数量明显更少或无孢子，且通常无孢质体。若未免疫和免疫的 F1 群体中孕卵且感染的动物数量相似，则应统计每只动物的卵数，并使用 ImageJ 分析感染组织，以发现更细微的差异。直接黄 96 可对成熟孢子进行染色，而荧光原位杂交则可揭示细胞内的孢质体。

这可以显示经诱导和未经诱导的线虫中感染细胞的数量。这些技术表明，亲代的转录响应可能在诱导子代的遗传免疫中发挥关键作用。目前研究人员正在探究子代中这种免疫特性的本质。