Name: 秀 丽隐杆线虫 感染模型中的遗传免疫研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解秀丽隐杆线虫感染模型中的遗传免疫研究方法。本实验使用Nematocida parisii微孢子虫感染，揭示亲代免疫如何跨代传递给子代，并阐明其分子机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢赵Winnie和Wan Yin Chen对本文手稿提供的有益评论。本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（资助号：522691522691）资助。

本研究使用在21 °C条件下培养的野生型C. elegans Bristol N2品系。
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>按照先前报道的方法制备M9培养基21,22.</li>
	<li>按照先前报道的方法制备线虫生长培养基（NGM）21,22每个6厘米培养皿中加入12 mL NGM，每个10厘米培养皿中加入30 mL NGM。</li>
	<li>准备 大肠杆菌 按照先前报道的方法使用菌株 OP50-123.</li>
	<li>按照以下步骤制备接种OP50-1的NGM平板。
	<ol>
		<li>通过涡旋振荡重悬10倍浓缩的OP50-1。</li>
		<li>使用重复移液器在培养皿中央接种。6 cm 和 10 cm 培养皿分别接种 200 µL 或 500 µL 体积。</li>
		<li>对于10 cm的培养皿，使用玻璃涂布棒将OP50-1均匀涂布，形成细菌菌苔。细菌不要涂至培养皿的最边缘。 
		注意：每涂布五个平板后，需将涂布棒浸入乙醇并过火灭菌，以确保无菌。涂布前让涂布棒冷却数秒，以免高温杀死细菌。</li>
		<li>将平板置于室温下2天，以干燥并确保细菌菌苔的生长。 
		&#8203;注意：接种后的平板可在室温下保存2-3周，或在4 °C下保存长达1个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的培养
<ol>
	<li>在接种了OP50-1的大肠杆菌NGM平板上持续培养线虫，提供恒定的细菌食物来源。 
	注意：饥饿可能导致跨代表型，从而影响实验结果。一个直径10 cm、接种OP50-1的平板最多可支持2,500个L1期幼虫（C. elegans的最早幼虫阶段）生长达72小时。</li>
	<li>若线虫发生饥饿，需在OP50-1上连续培养三代后，再用于实验。</li>
</ol>
3. 使用次氯酸钠（漂白）同步化秀丽隐杆线虫（C. elegans）种群
注意：此步骤对时间非常敏感，因此在开始前应确保离心机可用。文献中提供了其他较慢的漂白方案，可根据需要选用。为防止6%次氯酸钠随时间推移而失活，应将试剂避光保存于4 °C，最长可保存1年。
<ol>
	<li>为每个样品配制 2 mL 漂白液，其中包含 400 µL 的 1 M NaOH、250 µL 的 6% 次氯酸钠（见材料表）以及 1350 µL 的蒸馏水。</li>
	<li>使用 1 mL M9 培养基将成虫线虫（孵化后约 72 小时）从培养板上冲洗至微量离心管中。 
	注意：如果大量线虫仍附着在培养板上，可在室温下以 1,400 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，用 1 mL 移液枪头吸除上清液，并进行额外的培养板冲洗。</li>
	<li>在室温下以 1,400 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，然后用 1 mL M9 培养基洗涤两次，以去除细菌。</li>
	<li>吸除上清液，加入 1 mL 已配制好的漂白液（步骤 3.1），设定计时器为 1 分钟，翻转离心管 3–4 次。 
	注意：在光学显微镜下可观察到线虫停止抽搐。</li>
	<li>1 分钟后，在室温下以 3,000 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，吸除上清液并加入 1 mL 新鲜漂白液。</li>
	<li>在光学显微镜下密切观察离心管，观察线虫尸体裂开并释放胚胎的过程。当约 50%–80% 的尸体已裂开且大量胚胎已被释放时，立即进入下一步。 
	注意：根据动物数量和线虫品系的不同，此步骤可能需要 15 秒至 4 分钟。由于未知原因，感染 N. parisii 的线虫通常比未感染的线虫需要更长的漂白时间。</li>
	<li>在室温下以 3,000 × g 离心 30 秒使胚胎沉淀，然后用 1 mL M9 培养基洗涤三次。 
	注意：洗涤步骤可稀释管中残留的次氯酸钠溶液，必须快速完成，以确保漂白液不会损伤胚胎。</li>
	<li>向最终沉淀物中加入 1 mL M9 培养基，并转移至含有 4 mL M9 培养基的 15 mL 锥形管中，使胚胎悬浮于最终体积为 5 mL 的溶液中。</li>
	<li>将管子置于机械旋转器上（见材料表），在 21 °C 下旋转 18–24 小时，使胚胎孵化为 L1 幼虫。 
	注意：由于 N. parisii 感染线虫肠道而不侵入生殖系，因此感染的亲代不会通过垂直传播将感染传递给子代19。对感染的成虫进行漂白处理可同步 F1 代动物，并破坏 N. parisii 孢子，确保 F1 子代不会因亲代携带的孢子而被感染。</li>
	<li>在室温下以 1,800 × g 离心 1 分钟使 L1 幼虫沉淀，弃去上清液，仅保留 1 mL。</li>
	<li>将 1–5 µL L1 混合液滴加至未接种的 NGM 平板上，立即在光学显微镜下观察液滴中的 L1 数量。重复三次，取平均值以确定 L1 的浓度和总数。 
	&#8203;注意：大多数胚胎应已完成孵化，L1 应在液滴中快速移动。若仍有大量未孵化的胚胎或活力低下（移动缓慢）的 L1 存在，则表明漂白时间过长。</li>
</ol>
4. 巴西奈氏虫（N. parisii）孢子的制备
<ol>
	<li>参照已发表的文献19,24制备N. parisii孢子。</li>
</ol>
5. 用 N. parisii 感染 C. elegans 以获得免疫预激活的子代
<ol>
	<li>在计划感染的前一天，将所需数量的10 cm未接种NGM平板从4 °C转移至室温。</li>
	<li>感染前立即在微量离心管中以1,400 × g 离心约2,500条同步化的L1期线虫，室温离心30秒以沉淀线虫。用移液器吸头吸除上清液，使线虫保留在约50 µL的M9培养基中。</li>
	<li>向L1期线虫中加入1 mL 10倍浓度的OP50-1以及目标浓度的N. parisii孢子（通常约为250万个孢子）。作为未感染对照组，准备另一管等量的L1期线虫和OP50-1，加入与孢子悬液等体积的M9培养基。 
	注意：为获得免疫启动的子代，孢子剂量应足够高，使72小时后（通过DY96染色检测，见步骤7）超过&#62;90%的个体被感染，但又足够低，使超过&#62;80%的个体仍保持产卵状态。这可确保大多数子代来自感染亲本，且亲本漂白后能获得足量胚胎用于F1代检测。尽管孢子悬液的浓度和感染性存在差异，通常每10 cm平板使用5–15 µL孢子悬液（约250万个孢子）为适宜的亲代剂量。</li>
	<li>短暂涡旋混匀，将上述1 mL线虫悬液接种至10 cm未接种NGM平板上。轻轻旋转平板，确保液体均匀覆盖整个表面。</li>
	<li>将平板置于洁净台中，打开盖子干燥10–20分钟，或直至液体完全蒸发，随后在21 °C培养72小时。</li>
	<li>感染后72小时（hpi），用1 mL M9培养基将线虫从平板上冲洗至微量离心管中。若大量线虫仍附着于平板，以1,400 × g 离心30秒沉淀线虫，吸除上清液，并进行额外的平板冲洗。</li>
	<li>室温下以1,400 × g 离心30秒沉淀线虫，用1 mL M9培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。最后重悬于1 mL M9培养基中。</li>
	<li>上下吹打混匀，然后将100 µL线虫悬液转移至新离心管中。 
	注意：此约250条成虫样品可后续固定并染色，用于评估亲本线虫的健康状态和感染情况，具体方法见步骤7及步骤3开头部分。</li>
	<li>为裂解成虫并释放F1代胚胎用于检测，对剩余的900 µL线虫悬液进行漂白处理，方法见步骤3。 
	&#8203;注意：此步骤还可消除后续感染实验前存在的任何N. parisii孢子。</li>
</ol>
6. 测试遗传性免疫  N. parisii 在  秀丽隐杆线虫
<ol>
	<li>按照步骤 5.1–5.6 所述进行感染操作，并根据下述内容进行修改。 
	注意：F1 代线虫的感染实验可进行规模缩小，在 6 cm NGM 平板上使用约 1,000 条 L1 期线虫和 400 µL 的 10 倍浓度 OP50-1 进行。必须使用&#34;高&#34;剂量的孢子，以确保约 100% 的未受感染 F1 代线虫（即来自未感染亲本的线虫）被感染，且仅有约 10% 的未受感染 F1 代线虫达到产卵期。尽管孢子制剂的浓度和感染能力存在差异，但通常每 6 cm 平板使用 5–15 µL（约 250 万孢子）为适宜剂量。</li>
	<li>在感染后 72 小时，按照步骤 7 所述进行固定和染色，以评估线虫的适应性及感染状态。</li>
</ol>
7. 使用 DY96 染色法对 C. elegans 进行染色以观察胚胎和微孢子虫孢子
注意：DY96 是一种绿色荧光几丁质结合染料，可对线虫胚胎和微孢子虫孢子壁进行染色19,15,25。这使得能够同时监测线虫的健康状况和感染状态。
<ol>
	<li>使用含有 0.1% Tween-20 的 1 mL M9 培养基将线虫从培养板上冲洗至微量离心管中。若仍有大量线虫残留于培养板上，可在室温下以 1,400 × g 离心 30 秒收集线虫，用移液器吸头移除上清液，并进行额外的培养板冲洗。</li>
	<li>在室温下以 1,400 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，用 1 mL 含 0.1% Tween-20 的 M9 培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。</li>
	<li>移除上清液，加入 700 µL 丙酮，于室温固定线虫 10 分钟。 
	注意：如需长期保存，此时可将线虫在 -20 °C 条件下储存数月后再进行后续处理。</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒使固定后的线虫沉淀，用 1 mL 含 0.1% Tween-20 的 PBS（PBST）洗涤两次。</li>
	<li>配制 50 mL DY96 工作液：PBST、0.1%（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和 20 µg/mL DY96（来自蒸馏水中配制的 5 mg/mL 储存液）（参见 材料表）。将管子用铝箔包裹并置于抽屉中避光保存。 
	注意：DY96 储存液和工作液若避光保存，可在室温下稳定存放 &#62;1 年。</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，移除上清液后向沉淀中加入 500 µL DY96 工作液，在室温下旋转孵育 30 分钟。</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒使线虫沉淀，移除上清液后加入 15 µL 封片剂（含或不含 DAPI）（参见 材料表）。</li>
	<li>取 10 µL 染色后的线虫溶液滴加至显微镜载玻片上，盖上盖玻片。 
	注意：载玻片及额外样品可在避光条件下于 4 °C 长期保存。</li>
</ol>
8. 使用DY96染色的线虫进行成像与分析，以评估线虫的适应性及感染状态
<ol>
	<li>对染色后的DY96线虫（已封片，如步骤7.8所述）进行成像时，使用荧光显微镜的GFP通道。</li>
	<li>为了确定线虫种群的适应性，使用5倍或10倍物镜检测其生殖状态 &#62;每种条件下100条蠕虫。 
	注意：携带 ≥1 个胚胎的线虫被视为怀卵。使用机械细胞计数器有助于减少人工计数时的误差。与微孢子虫孢子相比，线虫胚胎的染色较浅（荧光较弱）。19胚胎呈卵圆形，约50 µm × 约30 µm，位于健康个体的体中部 秀丽隐杆线虫 成虫。健康的未感染成虫体内携带10-20个胚胎，沿其体长方向成行排列26.</li>
	<li>为了揭示更细微的适合度差异，进行胚胎计数。具体操作为：每种条件下，人工计数20-30条独立线虫中的胚胎数量。</li>
	<li>为了确定线虫群体的感染程度，使用5倍至40倍物镜观察并评估其感染状态 &#62;每种条件下100条线虫。凡肠道内含有任意数量胞内孢子的线虫均视为感染。 
	注意：微孢子虫孢子比线虫胚胎更亮。呈豆形的孢子 N. parisii 约为 2.2 µm × 0.8 µm，由蠕虫肠道细胞在感染后约 48 小时产生15仅在肠道腔内观察到孢子而未在肠壁上发现孢子的线虫不被视为感染。19这是因为这些孢子很可能是新摄入的孢子，而非个体感染后产生的孢子。</li>
	<li>使用图像分析软件（参见 材料表），按照以下步骤定量分析寄生虫负荷和蠕虫大小。
	<ol>
		<li>使用荧光直立体视显微镜，对每个样本固定于载玻片上的20-30条线虫进行成像。在明场、DAPI和GFP通道中采集图像。在GFP通道中选择合适的曝光时间，确保感染程度最高的样本中的荧光信号不出现饱和。 
		注意：即使在感染程度最低的样本中，仍可观察到感染情况。图像通常使用 5 倍物镜拍摄。</li>
		<li>在 FIJI/ImageJ 中打开文件。根据文件类型，可能需要使用 Bio-Formats Importer 插件在 ImageJ 中打开图像。</li>
		<li>使用明场或 DAPI 图像以及图像中的 20-30 条单个蠕虫进行勾画 多边形选择 工具栏中的工具。保存每个轮廓时使用 分析 &#62; 工具 &#62; 感兴趣区域（ROI）管理器 通过点击下拉菜单中的选项 添加 [t]勾勒出画面中完全可见的动物轮廓。 
		注意：可通过将包含轮廓的文件保存为 Tiff 格式，以便后续重新查看线虫的轮廓。</li>
		<li>点击 取消选择 在 ROI 管理器 去除图像中的所有轮廓并点击 图像 &#62; 重复 在下拉菜单中。将对应于目标通道的数字输入到 &#34;通道&#34; 用于复制GFP通道以计算寄生虫负荷的方框（例如，2）。</li>
		<li>使用阈值处理此通道 图像 &#62; 调节 &#62; 阈值 到能够捕捉到明亮的寄生虫负荷，但不会捕捉到较微弱的虫体胚胎荧光的水平，然后单击 应用记录所应用的阈值，并在同一次实验的所有图像中保持一致地使用。 
		注意：在分析所有图像之前，需确认阈值对于感染程度最低和最高的样本均是合适的数值。</li>
		<li>选择 分析 &#62; 设置测量参数 并勾选复选框 面积分数依次从 ROI 管理器中选择单个线虫轮廓，然后点击 分析 &#62; 测量 功能。A 结果 窗口将提供%Area（即寄生虫负荷百分比）的测量结果。 
		注意：如果胚胎的荧光过强，导致信号超过阈值，则 画笔工具 工具栏中的黑色工具可用于在测量面积百分比前手动擦除这些区域。</li>
		<li>为了将线虫体型作为适合度的指标进行测定，按照第8.3步所述方法勾画线虫轮廓并选择 分析 &#62; 设置测量参数 并勾选该框 面积依次选择单个蠕虫的轮廓 ROI 管理器 并点击 分析 &#62; 测量 功能。A 结果 窗口将提供面积百分比（%Area）的测量结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. FISH 检测法评估侵袭性  秀丽隐杆线虫 由微孢子虫及其孢子喷射
注意：MicroB FISH 探针可识别微孢子虫 18S rRNA 的保守区域，可用于标记细胞内孢子质（即已侵入的宿主细胞）以及孢子内的遗传物质。
<ol>
	<li>用 400 µL M9 培养基配制的混合液（含 400 万个 N. parisii 孢子和 10 µL 10 倍浓缩的 OP50-1）感染 6,000 条经漂白同步化的 L1 虫。&#160;</li>
	<li>将混合物接种至 6 cm 未接种的 NGM 平板上，在洁净台中干燥 10–20 分钟，随后置于 21 °C 培养。</li>
	<li>30 分钟后，用含 0.1% Tween-20 的 1 mL M9 培养基将线虫从平板上洗下。</li>
	<li>在室温下以 1,400 × g 离心 1 分钟，收集线虫沉淀。</li>
	<li>用移液器吸头移除上清液，加入 700 µL 丙酮，室温静置 10 分钟。 
	注意：此时可将线虫在 -20 °C 下保存，以备后续处理。</li>
	<li>按照已发表的文献方法27,19，使用 MicroB 探针进行过夜 FISH 检测。 
	注意：为评估孢子发射情况，在最终 500 µL 洗涤缓冲液中加入 20 µg/mL DY96，样品在 21 °C 下旋转孵育 30 分钟，之后按常规流程继续操作。</li>
	<li>将载玻片存放于载片盒中，置于 4 °C 保存。如需长期保存（数月），应将额外样品置于避光条件下，于 4 °C 保存在微量离心管中。</li>
	<li>为评估 FISH 染色线虫中的侵染情况，使用荧光显微镜的红色通道观察线虫。由于 L1 期线虫体积较小，且孢子质处于早期复制阶段，需使用高倍镜（63× 物镜）观察感染事件。为评估孢子发射情况，使用 63× 物镜并同时观察红色和绿色荧光通道。 
	注意：GFP 与 mCherry 信号共定位的孢子被视为未发射；仅含 GFP 信号的空孢子壳被视为已发射。</li>
	<li>为检测侵染或孢子发射情况，每组条件手动计数 20–30 条线虫中孢子质的数量（肠道细胞中的 mCherry 荧光点）或已发射孢子的百分比。调整 z 轴焦平面，以捕捉所有感染事件和孢子，因其常分布于不同焦平面。 
	注意：孢子质仅存在于肠道细胞内，其浓度最高区域通常位于咽部之后。若样品同时用 DY96 染色，应寻找不与孢子信号共定位的孢子质。</li>
</ol>

<ol><li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates%3A+current+knowledge+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).</li>
<li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li>
<li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li>
<li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics%3A+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li>
<li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+worm%3A+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li>
<li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remembering+your+enemies%3A+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741(2020).</li>
<li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+microsporidia%3A+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).</li>
<li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+host+cells+by+microsporidia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).</li>
<li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion%2C+proliferation+and+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).</li>
<li>Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011(2019).</li>
<li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+discreet+escape%3A+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li>
<li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li>
<li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023(2017).</li>
<li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).</li>
<li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li>
<li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458(2022).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic%2C+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).</li>
<li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li>
<li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li>
<li>Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).</li>
<li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).</li>
<li>Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309(2008).</li>
<li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved%2C+stress-specific%2C+and+have+deleterious+trade-offs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425(2021).</li>
<li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).</li>
<li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本方案描述了在一种简单且遗传学上易于操作的微孢子虫 N. parisii 与 C. elegans 感染模型中研究微孢子虫及遗传免疫的方法。
孢子制备是一项耗时的实验流程，通常可获得足够未来6个月实验使用的孢子，具体产量取决于产孢效率24重要的是，每一批新孢子都必须测定其感染性 &#34;批次&#34; 在用于实验之前，由于不同孢子制备物之间的感染性存在差异，必须在实验的所有重复中持续使用同一批次的孢子。单个分装样品不应反复冻融，因为解冻可能导致孢子萌发并降低其感染性。因此，孢子仅可在感染前立即从-80 °C冰箱中取出，并在操作过程中始终保持在冰上。
在步骤5-6中概述了感染实验。在进行感染实验时，必须避免动物受到污染或饥饿，因为这可能导致额外的跨代效应，从而干扰F1代的免疫表型。遗传性免疫实验的一个重要局限性在于，感染程度更高的亲代产生的F1后代数量更少。因此，必须在亲代感染程度足够以传递免疫力，同时又保持足够健康以产生可供检测的后代之间，取...

遗传免疫是一种表观遗传现象，指亲代暴露于病原体后能够产生具有抗感染能力的子代。这种免疫记忆已在许多缺乏适应性免疫系统的无脊椎动物中得到证实，可抵御病毒、细菌和真菌性疾病1。尽管遗传免疫对于理解健康与进化具有重要意义，但介导这种保护作用的分子机制在很大程度上仍不清楚。部分原因在于，已报道存在遗传免疫的许多动物并非研究中常用的标准模式生物。相比之下，对透明线虫Caenorhabditis elegans的研究则具有诸多优势，包括丰富的遗传学与生物化学研究工具2,3、高度注释的基因组4,5以及较短的世代周期。事实上，关于C. elegans的研究已推动了表观遗传学和先天免疫领域的多项基础性进展6,7，目前它已成为研究免疫记忆的成熟模式生物8,9。
微孢子虫是一类真菌性病原体，可感染几乎所有动物，并在免疫功能低下的人群中引起致命感染10。感染始于微孢子虫孢子通过一种称为极管的结构，将其细胞内容物（孢质体）注入宿主细胞，即所谓的“发射”过程&#34;发射&#34;。病原体在细胞内复制后形成裂殖体，最终分化为成熟的孢子，从而离开宿主细胞11,12。尽管这类寄生虫对人类健康和粮食安全均构成严重威胁，但其感染生物学仍有许多未知之处12。Nematocida parisii 是一种天然的微孢子虫寄生虫，仅在蠕虫的肠细胞内复制，导致宿主繁殖力下降，并最终致死。N. parisii 与 C. elegans 的感染模型已被用于揭示以下机制：（1）自噬在清除病原体中的作用13；（2）微孢子虫如何以非裂解方式从感染细胞中释放14；（3）病原体通过形成合胞体实现细胞间传播的机制15；（4）N. parisii 用于与宿主相互作用的蛋白质16；以及（5）细胞内病原体应答（IPR）转录调控机制17,18。
本文描述了感染秀丽隐杆线虫（C. elegans）的实验方案，可用于揭示微孢子虫独特的生物学特性，并解析宿主对感染的响应。通过对固定后的线虫使用结合几丁质的染料Direct Yellow 96（DY96）染色并进行显微观察，可显示含几丁质的微孢子虫孢子在肠道内的感染扩散情况。DY96染色还可用于可视化含几丁质的线虫胚胎，从而在评估宿主适应性时，同步检测线虫的生殖能力（即产生胚胎的能力）作为宿主健康状态的读数。
最近的研究表明，感染了 N. parisii 的 C. elegans 所产生的后代对相同感染具有显著的抗性19。这种遗传性免疫仅持续一代，且具有剂量依赖性，即来自感染程度更高的亲代的后代对微孢子虫的抗性更强。有趣的是，经 N. parisii 免疫启动的后代对细菌性肠道病原体 Pseudomonas aeruginosa 也表现出更强的抗性，但对天然病原体奥尔赛病毒（Orsay virus）则无保护作用19。本研究还表明，免疫启动的后代能够限制微孢子虫对宿主细胞的侵入。本文方法还描述了免疫启动后代的收集，以及如何利用FISH检测肠道细胞中 N. parisii 的RNA，以评估宿主细胞侵入和孢子释放情况20。
这些实验方案共同为研究微孢子虫以及秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的遗传免疫提供了坚实的基础。希望未来在此模式系统中的研究能够推动遗传免疫这一新兴领域的重要发现。这些技术也可能成为研究其他宿主生物中微孢子虫诱导的遗传免疫的起点。

<table><tbody><tr><td>2.0 mm 氧化锆珠</td><td>Biospec Products Inc.</td><td>11079124ZX</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482613</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>用于在显微镜载玻片上对 DY96 和 FISH 染色的线虫进行成像的荧光显微镜</td></tr><tr><td>Axio Zoom V.16 荧光体视变倍显微镜</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>用于活体荧光转基因动物的成像以观察 IPR</td></tr><tr><td>Baked EdgeGARD 水平气流洁净工作台</td><td>Baker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>珠磨破碎仪，Genie SI-D238 模拟型细胞破碎仪，120 V</td><td>Global Industrial</td><td>T9FB893150</td><td></td></tr><tr><td>Cell-VU 载片，Millennium Sciences 一次性精子计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>DRM600</td><td></td></tr><tr><td>直接黄 96（Direct Yellow 96）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S472409-1G</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 EverBrite 封片剂</td><td>Biotium</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>不含 DAPI 的 EverBrite 封片剂</td><td>Biotium</td><td>23002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 软件</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>机械旋转器</td><td>Thermo Scientific</td><td>415110 / 1834090806873</td><td>用于旋转装有漂白后胚胎的离心管，以实现过夜孵化</td></tr><tr><td>MicroB FISH 探针</td><td>Biosearch Technologies Inc.</td><td>-</td><td>以 Quasar 570（Cy3）进行 5' 修饰并经 HPLC 纯化合成，序列：CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td></tr><tr><td>N2</td><td>野生型，Bristol 品系</td><td>默认品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液（5 N）</td><td>Fisher Chemical</td><td>FLSS256500</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（6%）</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>用于线虫日常维护以及实验设置时 L1 期线虫的计数</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield + A16</td><td>Biolynx</td><td>VECTH1500</td><td></td></tr></tbody></table>

研究微孢子虫感染的 caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

遗传免疫描述了某些动物如何将先前感染的“记忆”传递给后代。这种机制可增强其子代对病原体的抵抗力，促进生存。尽管在多种无脊椎动物中已有遗传免疫的报道，但介导这一表观遗传现象的机制在很大程度上仍不清楚。该感染的 秀丽隐杆线虫 由天然微孢子虫病原体 Nematocida parisii 导致蠕虫产生的后代对微孢子虫具有强效抗性。本实验方案描述了在遗传背景简单且易于操作的模式生物中对跨代免疫的研究。 N. parisii -秀丽隐杆线虫 感染模型。本文描述了感染的方法 秀丽隐杆线虫 并产生具有免疫预激活的子代。还提供了通过染色微孢子虫并利用显微镜观察感染情况来检测抗微孢子虫感染能力的方法。特别是，遗传性免疫能够阻止微孢子虫对宿主细胞的侵入，以及荧光信号的出现。 原位 杂交（FISH）可用于量化侵染事件。通过使用几丁质结合染料对孢子进行染色，可定量测定免疫预激活后代中产生的微孢子虫孢子的相对数量。迄今为止，这些方法已揭示了遗传性免疫的动力学特征和病原体特异性，以及其潜在的分子机制。这些技术，连同现有的大量研究工具，可用于 秀丽隐杆线虫 研究将推动遗传免疫学领域的重要发现。

在本研究中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）的亲代群体（P0）在L1阶段以低剂量的巴黎奈索孢子虫（N. parisii）孢子进行感染。这种感染条件通常用于通过亲本漂白法获得大量微孢子虫抗性F1子代。感染的亲代群体与未感染的对照组均在感染后72小时（72 hpi）固定，并用DY96染色以观察线虫胚胎和微孢子虫孢子（图1A）。感染个体体型较小，体内含有大量微孢子虫孢子，且产生的胚胎数量少于健康的未感染对照组。对线虫繁殖力的评估显示，约95%的未感染个体可产生后代，而感染个体中该比例低于80%（图1B）。定量分析表明，约90%的微孢子虫处理群体已被感染，依据为含有DY96染色孢子的线虫数量（图1C）。为了获得免疫预激活的F1子代，使用微孢子虫的剂量至关重要：剂量需足够高以确保大多数亲本被感染，但又需足够低以保证群体仍能产生后代。本研究中所用微孢子虫剂量的详细信息见（表1）。
<p cl...

微孢子虫寄生虫Nematocida parisii感染Caenorhabditis elegans后，可使线虫产生的后代对该病原体具有高度抗性。这是遗传性免疫的一个实例，属于一种尚未被充分理解的表观遗传现象。本实验方案描述了在遗传学上易于操作的线虫&#160;模型中研究遗传性免疫的方法。

研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

遗传免疫描述了某些动物如何将先前感染的“记忆”传递给后代。这可以增强后代对病原体的抵抗力……

这些实验方案可用于研究对微孢子虫的遗传性免疫。本文介绍的技术有助于我们理解免疫特性如何跨代传递，以及决定子代对微孢子虫免疫能力的分子机制。C.elegans 是一种遗传操作简便、世代周期短的简单模式生物，适用于遗传研究。可利用多种适用于线虫的研究工具来揭示跨代免疫的分子机制。在感染 P0 代动物时，应使用较低的孢子剂量，以避免显著影响亲代产生后代的能力。这可确保后续漂白操作能够获得足够数量的 F1 代动物用于下游实验。首先，在计划进行感染的前一天，将所需数量的 10 厘米未接种线虫生长培养基平板从 4°C 转移至室温。感染前，将约 2,500 条同步化的 L1 虫在微量离心管中以 1,400 × g 离心 30 秒，形成沉淀。用移液器吸头吸除上清液，使虫体保留在 50 微升 M9 培养基中。向单阶段虫体中加入 1 毫升 10 倍浓度的 大肠杆菌 OP50 菌株，以及适量浓度的 N. parisii 孢子。作为未感染的对照，准备一个含有 L1 期线虫和 OP50 的等量试管，加入与所用孢子制备液等体积的 M9 培养基。将 L1 期线虫样品短暂涡旋混匀，并将超过一毫升的线虫接种到一个 10 厘米未接种的线虫生长培养基平板上。轻轻旋转平板，确保液体均匀覆盖整个平板表面。将培养板置于洁净柜中，打开盖子干燥10至20分钟，或直至完全干燥，然后在21摄氏度下培养72小时。感染后72小时，在解剖显微镜下观察培养板。感染线虫的培养板中的胚胎数量应少于未感染线虫的培养板。然后用1毫升M9培养基将线虫从培养板上冲洗至微量离心管中。如果仍有大量线虫残留在培养板上，可在1400 × g条件下离心30秒，使线虫沉淀。弃去上清液，并进行额外的培养板冲洗。在室温下以1400 × g离心30秒，使线虫沉淀，用1毫升M9培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。将线虫重悬于最终体积为1毫升的M9培养基中，通过移液充分混匀。取100微升悬浮线虫转移至新管中，对剩余的900微升进行漂白处理，以裂解成虫并释放F1代胚胎用于检测。按照文稿中所述进行感染操作的修改。感染后72小时，在解剖显微镜下观察培养板。与诱导过的线虫平板相比，未经诱导的线虫平板上的线虫体型应更小，且包含的胚胎数量更少。随后，开始对线虫进行染色和固定处理：用1毫升含0.1% Tween 20的M9培养基将线虫从平板上冲洗下来，收集至微量离心管中。若仍有大量线虫残留在平板上，可在室温下以1,400 × g离心30秒使线虫沉淀，用移液器吸头移除上清液，并进行额外的平板冲洗步骤。将线虫在室温下以1,400 × g离心30秒形成沉淀后，用1毫升含0.1% Tween 20的M9培养基洗涤两次，或直至上清液澄清。去除上清液，加入700微升丙酮，于室温固定线虫10分钟。将固定后的线虫在室温下以10,000 × g离心30秒形成沉淀，并用1毫升含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤两次。准备 50 毫升 DY96 工作液，用锡箔纸包裹容器，并将其存放在抽屉中以避免光照。向线虫沉淀中加入 500 微升 DY96 工作液，在室温避光条件下旋转孵育 30 分钟。在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒，沉淀线虫，然后弃去上清液。然后，加入15微升含或不含DAPI的封片剂。用移液器吸取10微升染色后的线虫样品至显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。为分析载玻片上DY96染色的线虫，使用荧光显微镜的GFP通道进行成像。为了评估线虫群体的适应性，使用 5X 或 10X 物镜对每种条件下超过 100 条线虫进行生殖力分析。在感染后 72 小时，固定 F1 代动物并用 DY96 染色，以评估其对微孢子虫的抗性。在感染后 72 小时，对感染的亲代群体和未感染的对照组进行固定，并用 DY96 染色，以观察线虫胚胎和微孢子虫孢子。受感染的动物体型较小，含有大量微孢子虫孢子，且产生的胚胎数量少于健康未感染的对照组。对线虫生殖能力的评估显示，约95%的未感染动物可产生后代，而受感染动物的比例则低于80%。定量分析表明，约90%经微孢子虫处理的群体被感染，该数据基于含有DY96染色孢子的线虫数量确定。对这些固定样本的定量结果显示，经预处理的线虫所含胚胎数量显著多于未受预处理的对照组，表明其在感染压力下具有更高的适应性。使用 Fiji ImageJ 分析单个未免疫和免疫预处理线虫的寄生虫负荷，即线虫体内充满荧光 N.parisii 孢子部分所占的百分比。定量结果显示，来自感染亲本的线虫其寄生虫负荷显著降低。此外，对单个线虫体长的计算表明，在 N.parisii 感染条件下，预处理线虫相较于未免疫线虫具有显著的生长优势。成像研究表明，未免疫动物通常含有多个孢子和若干感染细胞，而免疫动物的孢子数量明显更少或无孢子，且通常无孢质体。若未免疫和免疫的 F1 群体中孕卵且感染的动物数量相似，则应统计每只动物的卵数，并使用 ImageJ 分析感染组织，以发现更细微的差异。直接黄 96 可对成熟孢子进行染色，而荧光原位杂交则可揭示细胞内的孢质体。这可以显示经诱导和未经诱导的线虫中感染细胞的数量。这些技术表明，亲代的转录响应可能在诱导子代的遗传免疫中发挥关键作用。目前研究人员正在探究子代中这种免疫特性的本质。

studying-inherited-immunity-caenorhabditis-elegans-model

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

秀 丽隐杆线虫 感染模型中的遗传免疫研究

基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

蠕虫分选仪通过根据荧光报告基因的表达对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

由细菌病原体不同程度定植的 C. elegans 的自动化分离

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本文中，我们利用一种定制的微流控装置，对单个线虫进行活体成像。在该装置中，多条线虫被分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重化、长期监测。...

用于纵向成像的微流控平台 秀丽隐杆线虫

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

这是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 性腺解剖结合冷冻裂解，用于制备生殖系样本以进行免疫荧光分析 通过...

C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式物种之一，然而几乎所有研究都是在缺乏其天然共生微生物的情况下进行的。本文所述方法将有助于增进我们对这些共生微生物多样性的理解，为未来开展功能性的 C. elegans...

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

了解秀丽隐杆线虫感染模型中的遗传免疫研究方法。本实验使用Nematocida parisii微孢子虫感染，揭示亲代免疫如何跨代传递给子代，并阐明其分子机制。

研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

探索更多视频