RNA干扰在松林线虫、木犀牛线虫中的应用

RNAi已成为鉴定线虫基因功能的有效方法，被提出作为有效控制病原线虫的新途径。RNAi将线虫浸泡在dsRNA中就足以完成该程序。首先，通过贝尔曼漏斗法收集线虫。

为此，将夹紧的橡胶管放在漏斗下方，并在漏斗口中放置两层滤纸。将灰霉菌真菌培养物转移到漏斗中，并加水浸入真菌垫中。收集线虫时，将500微升提取试剂和100微升磁珠加入两毫升离心管中。

吸出20微升线虫，并以9， 000 x g 研磨样品30秒。孵育五分钟，并在 12， 000 x g 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。将上清液转移到新鲜的离心管中。

加入100微升氯仿，将试管倒置数次混合。孵育三分钟，然后在 12， 000 x g 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。再次，将上清液转移到新鲜的离心管中。

加入250微升异丙醇，剧烈涡旋。以12， 000 x g 离心10分钟并涡旋。弃去上清液，加入500微升75%乙醇洗涤RNA。

涡旋样品，然后在4摄氏度下以12， 000 x g 离心五分钟。将RNA沉淀风干五分钟，然后将其重悬于30微升无RNase的水中。使用此公式计算RNA浓度并计算A260与A280的比例。

接下来，使用一对引物扩增来自嗜木双歧杆菌的BX ppm-1基因的部分编码序列。然后将ppm-1基因序列克隆到含有T7启动子的pGEM-T Easy载体中。使用克隆质粒作为PCR模板回收894碱基对长的ppm-1基因片段。

然后，使用体外转录试剂盒合成dsRNA。使用分光光度计分析dsRNA的质量，并在1%琼脂糖凝胶上可视化产物。加入四微升5X浸泡缓冲液，并用双蒸水将体积补足至20微升，以获得每毫升0.8微克的最终RNA浓度。

然后将线虫放入培养皿中 30 分钟，等待卵粘附在底部。小心地去除水和线虫，不要打扰鸡蛋，直到只有鸡蛋留在培养皿中。将收集的卵在25摄氏度的黑暗中孵化24小时以获得J2幼虫。

将幼虫收集在管中，并用双蒸水洗涤三次。然后，将幼虫转移到含有dsRNA溶液的管中。为此，加入间苯二酚溶液以获得 1% 的溶液。

将幼虫放在振动台上，以确保dsRNA充分吸收到幼虫中。对于对照，在没有dsRNA探针或GFP dsRNA探针的情况下，将相同数量的线虫浸泡在浸泡缓冲液中。使用 actB 和 tbb-2 基因作为内部参考进行 qPCR，以评估基因表达水平的变化。

使用δδCt方法根据溶出曲线和Ct值估计相对基因表达水平。RNAi后，在PDA平板上的灰霉菌草坪上培养J2幼虫直至成年。使用贝尔曼漏斗方法收集成虫，如第一节所示。

在显微镜下获取成年线虫的图像，并使用 ImageJ 软件测量 50 只雄性和 50 只雌性线虫的体长。通过计算每个样本的平均值和标准差来分析数据。应用学生 t 检验来比较不同组样本的均值。

RNAi后的相对基因表达分析表明，ppm-1 dsRNA能有效抑制嗜木杆菌ppm-1基因的表达。而外源性GFP dsRNA对ppm-1表达没有影响。RNAi后，尽管达到性成熟，但成虫的大小显着减小，导致小体型突变表型。

突变雌性和雄性的平均体长分别为544和526微米，而对照组为971和912微米，最重要的是将线虫转移到双链RNA溶液中，并添加另一种试剂以刺激线虫进食。该方法适用于大规模基因筛选，常用于细胞研究。该方法研究嗜木杆菌的基因功能对嗜木杆菌的生物防治具有指导价值。