Name: 辅酶Q过量设置下线粒体通透性转变孔隙的开放概率评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 了解线粒体通透性转变孔隙低电导开放的新方法，通过测量膜电位依赖性开放概率评估心肌线粒体功能。该技术适用于脆性X综合征模型与野生型对照比较研究。

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本工作获得以下基金资助：NIH/NIGMS T32GM008464（K.K.G.），哥伦比亚大学欧文医学中心麻醉学系校长目标机遇奖（K.K.G.），小儿麻醉学会青年研究者研究奖（K.K.G.），以及 NIH/NINDS R01NS112706（R.J.L.）

本研究中所述所有方法均获得哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。脆性X综合征（Fmr1 基因敲除，Fmr1 KO）模型小鼠（FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J）及对照组小鼠（FVB品系，FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ）作为本研究的模型系统，均购自商业供应商（参见材料表）。每个实验组使用5至11只动物。出生后第10天（P10）的小鼠用于模拟人类婴儿期的某一时间点。
1. 小鼠心脏线粒体的分离
<ol>
	<li>按照表1所述配制用于线粒体分离和呼吸实验的缓冲液。如需提前配制，请在4 °C下保存。
	<ol>
		<li>配制15%密度梯度介质：将商用密度梯度介质用密度梯度稀释液稀释至80%体积比（v/v）。再将80%密度梯度介质用线粒体分离缓冲液（MI）/牛血清白蛋白（BSA）进一步稀释至15% v/v。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>本实验应使用新鲜组织而非冷冻组织分离线粒体，并在制备当天使用，通常在五小时内完成26。所有分离步骤均需在冰上操作。
	<ol>
		<li>处死小鼠后迅速取出心脏。立即在培养皿中用预冷的MI/BSA溶液清洗1–2次。剪去心房，将心室组织剪碎。</li>
		<li>将剪碎的心脏组织转移至含有1 mL MI/BSA的玻璃-玻璃匀浆器中。先用较松的（A型）研杵匀浆10次，再用较紧的（B型）研杵匀浆10次。</li>
		<li>将匀浆液在4 °C下以1,100 × g离心2分钟，以去除细胞核和细胞碎片。</li>
		<li>小心吸取上清液，避免接触松散的沉淀，将其缓慢铺加到离心管中700 μL的15%密度梯度介质上。在4 °C下以18,500 × g离心15分钟。</li>
		<li>将沉淀用1 mL蔗糖缓冲液（SB）/BSA重悬，然后在4 °C下以10,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>彻底移除并弃去上清液。将沉淀用SB/BSA重悬至终体积55 μL。</li>
		<li>使用标准方法（如二辛可宁酸（BCA）蛋白测定法）定量线粒体蛋白含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 线粒体氧（O2）消耗与ΔΨ
<ol>
	<li>氧电极的组装与校准
	<ol>
		<li>根据制造商说明设置并校准氧电极（参见材料表）。
		<ol>
			<li>在电极圆盘的球形顶部滴加一滴50%氯化钾（KCl）电解液。</li>
			<li>在电解液滴上放置一小块约2 cm2的香烟纸垫片，并覆盖一块稍大的所提供的聚四氟乙烯（PTFE）膜。</li>
			<li>使用所提供的涂抹工具，将小型电极圆盘O形圈推入电极球形顶部。 
			注意：确保无气泡存在，且膜表面平整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用电解液补充电极储液井。</li>
		<li>将较大的O形圈放入电极圆盘井周围的凹槽中。</li>
		<li>将圆盘安装到电极室中，并连接至控制单元。</li>
		<li>向反应室中加入2 mL空气饱和的去离子水，并将PTFE涂层磁力搅拌子放入室中。</li>
		<li>将反应室连接至控制单元后部。</li>
		<li>将温度设定为37 °C，搅拌速度设定为100。</li>
		<li>系统温度平衡需10分钟，之后开始校准。</li>
		<li>在校准选项卡下，选择液相校准以执行液相校准。确认温度设定为37 °C，搅拌速度为100，压力设定为大气压（101.32 kPa）。</li>
		<li>点击确定，等待信号达到平台期。</li>
		<li>当信号达到平台期时，点击确定。</li>
		<li>通过加入少量（约20 mg）连二亚硫酸钠建立反应室中O2的零点。</li>
		<li>点击确定，等待信号达到平台期。</li>
		<li>当信号达到平台期时，点击保存以确认校准结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TPP+-选择性电极的组装
	<ol>
		<li>使用提供的注射器和柔性针头将10 mM TPP溶液注入TPP+-选择性电极尖端，注意避免产生气泡。</li>
		<li>根据制造商说明组装TPP+-选择性电极装置，包括参比电极和电极支架（参见材料表）。</li>
		<li>简要步骤：松开电极支架帽，将内参比电极插入TPP+&#160;尖端，拧紧帽以固定尖端。将提供的电缆连接至电极支架和控制盒的辅助端口。</li>
		<li>将TPP+-选择性电极和参比电极插入专用于离子选择性电极的改良推杆组件中。将参比电极连接至控制盒的参比端口。</li>
		<li>将TPP+-选择性电极和参比电极插入专用于离子选择性电极的改良推杆组件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应室的准备
	<ol>
		<li>向反应室中加入反应混合物：10 mM琥珀酸（复合体II底物）、5 μM鱼藤酮（复合体I抑制剂）、80 ng mL−1尼日里菌素（用于消除线粒体内膜IMM上的pH梯度）、2.5 μg mL-1寡霉素（用于诱导状态4呼吸），以及呼吸缓冲液（RB）/BSA反应缓冲液，最终体积为1 mL。注意避免将气泡引入反应室。</li>
		<li>用已安装TPP+-选择性电极和参比电极的改良推杆组件封闭反应室。点击开始以启动记录。封闭反应室后，使用经塑料管调节针长的独立微量注射器，直接向反应溶液中加入其他试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TPP+校准
	<ol>
		<li>获得稳定的电压信号后，通过逐次加入0.1 mM TPP溶液（每次1 μM增量），使最终浓度达到3 μM，对TPP+-选择性电极进行校准。观察每次加入后TPP+电压信号呈对数下降。 
		注意：每次实验开始前均需校准TPP+-选择性电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>等待O2和TPP+信号稳定后，通过推杆组件的试剂添加口向反应室中加入100 μg新鲜制备的心肌细胞线粒体，最终浓度为0.1 mg mL-1。观察到随着线粒体被激活并消耗O2，反应室中O2水平下降；同时，由于线粒体产生膜电位并从溶液中摄取TPP+，TPP+电压信号急剧上升。</li>
		<li>加入2.5 μg mL-1寡霉素以诱导状态4呼吸。 
		注意：此时O2消耗速率代表质子漏呼吸速率。寡霉素也可在TPP+加入前添加至反应室，作为替代方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估mPTP的开放概率
	<ol>
		<li>观察到在漏呼吸过程中ΔΨ随时间下降。当达到目标ΔΨ时，向反应室中加入1 μM环孢素A（CsA，mPTP抑制剂），以评估在该特定ΔΨ下mPTP的开放概率。</li>
		<li>测量CsA加入前后对O2消耗和ΔΨ的影响。</li>
		<li>通过在连续实验中改变加入CsA时的ΔΨ，确定mPTP开放的电压依赖性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了一种评估mPTP开放概率的方法。具体而言，通过在一系列ΔΨ条件下评估CsA抑制对质子漏的影响，确定了低电导mPTP开放的电压阈值。利用该技术，我们能够识别出FXS小鼠与FVB对照小鼠之间在mPTP电压门控方面的差异，这与它们在组织特异性CoQ含量上的差异一致。该方法成功的关键在于线粒体必须在使用前新鲜分离，并且质量良好。在分离过程中受损或过于陈旧的线粒体将无法产生适当的ΔΨ，通常会处于解偶联状态。需要注意的是，尽管基质pH通常对质子推动力有贡献，但在本实验中使用尼日里菌素（nigericin）来消除线粒体内膜（IMM）两侧的ΔpH，如先前标准的质子漏评估方案中所述29。因此，在本情况下，质子推动力等同于ΔΨ，从而简化了实验方法。
另一个重要考虑因素是，呼吸测定体系中使用的某些抑制剂（如鱼藤酮、寡霉素和环孢素A）难以在实验间彻底清洗干净，因为它们会吸附在反应室的塑料表面，包括离子选择性电极上。必须定期使用乙醇以及粗制冻融线粒体悬液对反应室进行清洗，以 &#34;清除&#34; 从腔室中彻底清除这些抑制剂，并降低抑制剂残留转移的...

mPTP介导通透性转换（PT），即线粒体内膜（IMM）突然对小分子和溶质变得通透1,2。这一显著现象明显不同于IMM通常所具有的不通透特性，而IMM的这种不通透性对于建立氧化磷酸化所需的电化学梯度至关重要3。PT与其他线粒体转运机制不同，是一种高电导、非特异性和非选择性的过程，允许分子量高达1.5 kDa的多种分子通过4,5。mPTP是位于IMM上的一种电压门控通道，其开放会改变ΔΨ、ATP生成、钙稳态、活性氧（ROS）的产生以及细胞活力4。
在病理状态下，mPTP 的非受控且持续的高电导开放会导致电化学梯度的崩溃、基质肿胀、基质中吡啶核苷酸耗竭、外膜破裂、膜间隙蛋白（包括细胞色素 c）的释放，最终导致细胞死亡4,6。此类病理性 mPTP 开放已被证实参与心肌缺血-再灌注损伤、心力衰竭、创伤性脑损伤、多种神经退行性疾病以及糖尿病的发生发展1,7。然而，低电导的 mPTP 开放属于生理性过程，与高电导开放不同，不会引起显著的去极化或线粒体肿胀4。
通道孔的低电导开放将通透性限制在约300 Da，允许质子在不依赖ATP合成的情况下通过，并可能成为生理性质子漏的重要来源5。生理性mPTP开放会引起ΔΨ的可控性下降，增加呼吸链中的电子流，并导致超氧阴离子短暂的爆发或闪光，从而参与活性氧（ROS）信号传导8。调控这种瞬时的mPTP开放对钙稳态以及正常细胞的发育和成熟至关重要4,9,10,11。例如，在发育中的神经元中，瞬时通道开放可触发分化，而在未成熟心肌细胞中，mPTP的关闭则诱导其成熟4,5。
尽管mPTP在健康与疾病中的功能意义已得到充分证实，但其确切的分子身份仍存在争议。关于mPTP分子结构与功能的研究进展已在其他文献中得到全面综述12。简而言之，目前推测mPTP的高电导态和低电导态可能分别由不同的分子实体介导12。其中主要候选分子分别为F1/F0 ATP合酶（ATP synthase）和腺苷酸转运蛋白（ANT），分别对应高电导和低电导模式12。
尽管关于mPTP形成孔道的确切组分尚无定论，但某些关键特性已被阐明。mPTP的一个明确特征是其受电化学梯度调控，线粒体内膜（IMM）去极化可导致孔道开放13。先前研究表明，邻近巯基的氧化还原状态可改变mPTP的电压门控特性：氧化作用使孔道在相对较高的ΔΨ下开放，而巯基的还原则增加mPTP关闭的概率14。然而，介导该电压感应的蛋白质组分仍不明确。
已鉴定出多种可调节孔道开放概率的小分子。例如，线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放可被钙离子、无机磷酸盐、脂肪酸和活性氧（ROS）促进，而腺嘌呤核苷酸（尤其是ADP）、镁离子、质子和环孢素A（CsA）则可抑制其开放5,12。其中部分调节因子的作用机制已被阐明。线粒体钙离子至少部分通过与ATP合酶的β亚基结合，从而触发mPTP的开放15。活性氧（ROS）可通过降低mPTP对ADP的亲和力，并增强其对亲环素D（CypD）的亲和力，从而激活该孔道；CypD是目前研究最为深入的蛋白质性质的mPTP激活因子16。无机磷酸盐和脂肪酸激活mPTP的具体机制尚不明确。至于内源性抑制因子，ADP被认为可通过结合腺苷酸转位酶（ANT）或ATP合酶而抑制mPTP；而镁离子则通过将钙离子从其结合位点置换出来，发挥其抑制作用15,17,18,19。
低pH通过质子化ATP合酶调节性寡霉素敏感赋予蛋白（OSCP）亚基的组氨酸112，从而抑制mPTP的开放12,20,21。mPTP的典型药理学抑制剂环孢素A（CsA）通过结合CypD并阻止其与OSCP相互作用而发挥作用22,23。先前的研究还表明，多种辅酶Q（CoQ）类似物可与mPTP相互作用，发挥抑制或激活作用24。在近期研究中，我们发现新生FXS小鼠前脑线粒体中因CoQ缺乏导致mPTP病理性开放、质子泄漏过度以及氧化磷酸化效率低下25。
外源性辅酶Q封闭孔道可阻断病理性质子泄漏，并诱导树突棘形态成熟25。有趣的是，在相同动物中，脆性X综合征心肌细胞的辅酶Q水平异常升高，且线粒体通透性转换孔（mPTP）关闭概率高于野生型对照组26。尽管这些组织特异性辅酶Q水平差异的原因尚不清楚，但这些发现强调了内源性辅酶Q可能是mPTP的关键调节因子。然而，目前对辅酶Q介导mPTP抑制的机制仍不清楚，存在重要的知识空白。
mPTP的调控是细胞信号传导和存活的关键决定因素4因此，在研究特定的病理生理机制时，检测线粒体内mPTP的开放至关重要。通常，通过使用钙离子诱导通透性转换，来确定高电导孔道开放的阈值。这种钙超载会导致膜电位崩溃、氧化磷酸化迅速解偶联以及线粒体肿胀。27,28我们旨在开发一种检测低电导mPTP开放的方法 原位 而不诱导它 本身.
该方法利用了mPTP作为质子渗漏通道的作用。为此，采用克拉克型电极和TPP+离子选择性电极，分别在分离的线粒体进行渗漏呼吸期间，同时测量氧气消耗和膜电位29。mPTP开放的阈值通过环孢素A（CsA）介导的质子渗漏抑制在特定膜电位下的起始点来确定。利用该方法，精确界定了在辅酶Q过量背景下mPTP电压门控的差异。

<table><tbody><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>适用于 OXYT1 的 pH 或离子选择性电极适配推杆组件</td><td>PP系统</td><td>941039</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE 管道，PE 50，0.023 英寸，10 英尺</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>根据需要调整 Hamilton 注射器的长度</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），无脂肪酸</td><td>Sigma</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Ref 参比电极，2 mm</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>用于KWIK-Tips的电极夹持器</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>KWIK-2</td><td>&amp;nbsp;离子选择性电极架</td></tr><tr><td>乙二醇双(&amp;beta;-氨基乙基醚-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸&amp;nbsp; (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>FVB.129P2-Pde6b&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Tyr&lt;sup&gt;c-ch&lt;/sup&gt; Fmr1&lt;sup&gt;tm1Cgr&lt;/sup&gt;/ 
J</td><td>杰克逊实验室，巴港，缅因州</td><td></td><td>FXS 小鼠， &lt;em&gt;Fmr1 &lt;/em&gt;敲除&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FVB.129P2-Pde6b&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Tyr&lt;sup&gt;c-ch&lt;/sup&gt;抗J</td><td>杰克逊实验室，巴港，缅因州</td><td></td><td>FVB小鼠</td></tr><tr><td>Hamilton 80366 标准注射器，10 μL，固定针头，6 支/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07938-30</td><td>微量注射器</td></tr><tr><td>Hamilton 80500 标准微量注射器，50 μL，固定针头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07938-02</td><td>微量注射器</td></tr><tr><td>Hansatech Instruments Oxytherm+ 系统（呼吸作用）完整套装</td><td>PP系统</td><td>OXYTHERM+R</td><td>氧电极和软件</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M9546-250G</td><td></td></tr><tr><td>P1,P5-二腺苷-5&amp;prime; 五磷酸五钠（AP5A）</td><td>Sigma</td><td>D4022-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td>密度梯度分离培养基</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>5.43841</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TPP&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 电极尖端（3）</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>TIPTPP</td><td></td></tr></tbody></table>

辅酶q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

线粒体通透性转换孔（mPTP）是一种电压门控、非选择性的线粒体内膜（IMM）大型通道，在生理和病理过程中具有重要作用。mPTP在低电导开放状态下介导质子跨内膜泄漏，且其活性可被环孢素A（CsA）特异性抑制。辅酶Q（CoQ）是mPTP的调节因子，在脆性X综合征新生小鼠模型（FXS，Fmr1基因敲除）中，已发现前脑和心脏线粒体的CoQ含量及mPTP开放概率存在组织特异性差异。我们建立了一种技术，利用mPTP作为质子泄漏通道的特性，测定该突变品系中mPTP开放的电压阈值。
为此，在质子漏呼吸期间，通过极谱法和四苯基磷（TPP+）离子选择性电极，同时测量分离线粒体中的耗氧量和膜电位（ΔΨ）。通过特定膜电位下环孢素A（CsA）介导的质子漏抑制的起始点，确定mPTP开放的阈值。利用该方法，可在辅酶Q过量的背景下精确定义mPTP电压门控的差异。这一新型技术将有助于未来进一步研究，以加深对mPTP低电导开放生理及病理调控机制的理解。

这些实验中生成的典型 O2 消耗和 ΔΨ 曲线如图所示（图 1A、B）。每次实验开始时均显示了 TPP+ 校准过程中电压信号的对数下降。若未出现该对数模式，可能提示 TPP+ 选择性电极存在问题。线粒体在加入呼吸缓冲液后通常会立即产生 ΔΨ。根据能斯特方程，可通过 TPP+ 电压的变化来解读 ΔΨ（即线粒体基质内 [TPP+] 与外部 [TPP+] 的对数比值）30。请注意，生理状态下的 ΔΨ 接近标准曲线中 2 μM TPP+ 的水平。因此，电压阈值是相对于 2 μM TPP+ 标准设定的（记为 Δ mV TPP+ 电压信号）。
例如，“高 ΔΨ”定义为约 Δ0 mV（在 2 μM TPP+ 水平），“中等 ΔΨ”设定为约 ...

该方法利用线粒体通透性转换孔对低电导质子漏的贡献，测定新生脆性X综合征小鼠心肌细胞线粒体辅酶Q含量升高情况下孔道开放的电压阈值，并与野生型对照小鼠进行比较。

辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

线粒体通透性转换孔（mPTP）是一种电压门控、非选择性的线粒体内膜（IMM）巨通道，在……中具有重要作用

本方案提供了一种研究线粒体通透性转换孔低电导开放状态的新方法。该技术的主要优势在于能够简便地测量孔道开放概率随线粒体膜电位变化的关系。该技术可广泛应用于从任何器官系统及物种中分离的线粒体。首先校准氧电极，将一滴50%氯化钾电解液溶液置于电极片的圆顶上。在电解液液滴上放置一小块面积为2平方厘米的香烟纸垫片，并覆盖一块稍大的聚四氟乙烯膜。然后使用涂抹工具将小电极片O形圈推入电极的圆顶上。接下来，用电解液补充储液井。将较大的O形圈放入电极片井周围的凹槽内。然后将电极片安装到电极室中，并将其连接至控制单元。向反应室中加入 2 毫升空气饱和的去离子水和聚四氟乙烯涂层磁子。完成后，将反应室连接至控制单元后端。将温度设置为 37 °C，搅拌速度设置为 100。校准前，让系统温度平衡10分钟。确保温度、搅拌速度和压力正确后，在“校准”选项卡下选择“液相校准”选项以执行液相校准。然后按“确定”，并等待信号达到稳定平台期。达到平台期后，按下“确定”。然后向反应室中加入约20毫克连二亚硫酸钠，以建立无氧环境。再次按下“确定”，等待信号达到稳定平台期后，点击“保存”按钮以确认校准。准备四苯基磷（TPP）选择性电极组件时，使用注射器和柔性针头将10毫摩尔的TPP溶液注入TPP选择性电极尖端。填充电极尖端时避免产生气泡。松开电极 holder 帽，将内参比电极插入 TPP 尖端。完成后，组装 TPP 选择性电极装置，包括参比电极和电极 holder。拧紧帽盖以固定探头。然后将电缆连接至控制箱的辅助端口和TPP电极架。将TPP选择性电极和参比电极插入离子选择性电极专用的推杆组件中。将参比电极连接到控制盒的参比端口。接下来，准备反应室：向反应室中加入一毫升反应混合物，避免产生气泡。使用带有TPP选择性电极和参比电极的适配推杆组件密闭反应室。关闭反应室后，使用带有塑料管路的独立微量注射器将额外试剂直接注入反应室。当装置准备就绪后，点击“开始”以启动记录。获得稳定的电压信号后，通过逐次加入0.1毫摩尔TPP溶液（每次增加1微摩尔），使终浓度达到3微摩尔，从而对TPP选择性电极进行校准。观察每次添加后TPP电压信号的对数下降。在氧浓度和TPP信号稳定后，通过推杆组件上的试剂添加口向反应室中加入100微克新鲜制备的心肌细胞线粒体，终浓度为0.1毫克/毫升。观察线粒体被激活并消耗氧气时，反应室中氧水平的下降。此外，观察线粒体产生膜电位并从溶液中摄取TPP时，TPP电压信号的急剧上升。然后加入2.5微克/毫升的寡霉素以诱导状态4呼吸。为评估线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放概率，观察在渗漏呼吸期间膜电位随时间的下降情况。当达到目标膜电位后，向反应室中加入一微摩尔的环孢素A（cyclosporine A）作为mPTP抑制剂，以评估在该特定膜电位下mPTP的开放概率。随后，测量加入环孢素A前后其对氧气消耗和膜电位的影响。在同步记录的氧气消耗与膜电位的代表性曲线中，高膜电位相对于两微摩尔TPP校准水平设为零，中等电位设为五毫伏，低电位设为十毫伏。在零毫伏时，线粒体的mPTP关闭概率为100%，而在10毫伏时则表现出100%的开放概率。加入寡霉素后，未观察到耗氧量发生显著变化，表明三磷酸腺苷（ATP）合酶对状态2呼吸的贡献极小。此外，比较了加入环孢素A前后耗氧速率和膜电位的变化。氧消耗速率降低以及膜电位趋于稳定，表明开放的线粒体通透性转换孔（mPTP）发生关闭。当mPTP处于关闭状态时，氧消耗速率未见下降，且膜电位持续降低。实验结果表明，在FVB对照组和Fmr1基因敲除型心肌线粒体中，高膜电位和低膜电位下mPTP处于关闭和开放状态的概率相似。在中间膜电位下，Fmr1 基因敲除型心肌线粒体的mPTP关闭概率较FVB对照组升高。向检测室中加入液体时不得引入气泡，否则会导致氧气消耗读数不稳定，增加结果解读难度。完成此步骤后，可测定钙负荷能力。该方法可评估孔道的高电导开放状态，并补充了我们技术的结果。

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科研

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生物学

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