Name: 原代细胞培养物研究小鼠穆勒胶质细胞在微RNA处理后的再生潜力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解原代小鼠穆勒胶质细胞培养方法，通过微RNA处理诱导其向视网膜祖细胞转化。该技术为视网膜再生医学研究提供可靠的体外筛选平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Ann Beaton 博士及实验室所有成员对本文手稿提出的宝贵意见。特别感谢 Tom Reh 博士、Julia Pollak 博士和 Russ Taylor 博士在 S.G.W. 于西雅图华盛顿大学进行博士后培训期间，将其引入使用穆勒胶质细胞（MG）原代培养作为筛选工具的方法。本研究由 Empire Innovation Program（EIP）向 S.G.W. 提供的资助、纽约州立大学视光学院向 S.G.W. 提供的启动资金，以及美国国立眼科研究所（NEI）授予 S.G.W. 的 R01EY032532 项目资助。

华盛顿大学已就本报告中包含的部分研究成果向发明人Nikolas Jorstad、Stefanie G. Wohl和Thomas A. Reh提交了专利申请。该专利的名称为“刺激视网膜再生的方法和组合物”。

本方案描述了如何从解离的小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），用于miRNA介导的重编程研究。如多项先前研究所示并证实，这些培养物中绝大多数细胞（80%–90%）为MG20,23,24。该方法是一种非常稳健且可靠的培养技术，只要严格按照方案操作，结果易于重复21,27。然而，培养物的成功生长及其重编程效率取决于多种因素。
首先，小鼠的年龄对细胞成功生长具有重要作用。因此，如果从野生型小鼠或表型类似于野生型的转基因小鼠（如报告基因小鼠）中培养Müller胶质细胞（MG），获得融合MG单层的最晚时间为出生后第12天（P12）。在P12阶段，所有视网膜神经元和MG均已分化，视网膜中不再存在视网膜前体细胞（RPCs）。MG表达成熟的MG标志物，如谷氨酰胺合成酶或谷氨酸-天冬氨酸转运体（GL...

Müller胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞。它们的功能与其他中枢神经系统部位的胶质细胞相似，包括维持水和离子稳态、为神经元提供营养以及保护组织。MG还具有另一个引人注目的特征：尽管它们是成熟的胶质细胞，但仍表达许多在视网膜发育晚期阶段的视网膜前体细胞（RPCs）中表达的基因1,2。这种相似性被认为是鱼类视网膜受损后MG介导的神经元自然再生现象的原因3,4。在此过程中，MG重新进入细胞周期，并去分化为RPCs，随后分化为全部六种类型的视网膜神经元。尽管这一现象在鱼类中自然发生，哺乳动物的MG却不能转化为神经元5,6。然而，它们可以被重编程。已有多种因子被证明能够将MG重编程为RPCs/神经元；其中一种因子是碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子achaete-scute同源物1（Ascl1），该因子参与了鱼类的视网膜再生过程7,8。在小鼠中，Ascl1仅在视网膜发生过程中表达于RPCs中，而在成熟的MG或视网膜神经元中则不表达9。
直接重编程细胞 体内 不仅在方法学上具有挑战性，还需要获得机构动物护理与使用委员会的批准。要获得批准，必须提供有关所使用或改变的因素、浓度、脱靶效应、潜在机制、毒性和效率的初步数据。细胞培养系统可在体内应用之前用于测试这些指标 体内 模型。此外，由于Müller胶质细胞仅占整个视网膜细胞群体的约5%10，MG 培养物可用于研究其功能11 以及它们的行为，包括迁移12,13增殖14，对损伤/损害的应激反应15,16，它们与其他细胞类型（如小胶质细胞）的相互作用17 或视网膜神经节细胞（RGCs）18，或其神经发生潜能19,20,21许多研究人员使用永生化细胞系进行研究，因为这些细胞具有无限增殖潜能，易于培养和转染。然而，在生物学相关性检测中，原代细胞比永生化细胞更优，因为原代细胞具有真实的细胞特性（基因和蛋白表达），更重要的是，它们代表发育过程中的特定阶段，因此具有相应的 &#34;年龄&#34;动物的年龄（以及由此获得的细胞的年龄）是细胞重编程过程中尤为关键的因素，因为细胞可塑性会随着发育阶段的推进而降低22.
本方案详细描述了如何利用miRNA对原代小胶质细胞进行重编程 体外 用于研究再生的方法。该肌抑素（MG）原代培养模型于2012年建立，旨在评估P53基因敲除小鼠中MG细胞的增殖特性。trp53-/- 小鼠23已证明培养的少突胶质细胞能维持其胶质细胞特征（即表达S100）&#946;，Pax6 和 Sox2 蛋白的检测 通过 免疫荧光标记），并且它们具有相似性 体内 MG（经FACS纯化的MG的微阵列）23随后，采用病毒载体的另一种方法对胶质细胞的 mRNA 和蛋白质表达进行了验证和确认。20几年后，通过使用少突胶质细胞特异性的 Rlbp1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl&#160;报告基因小鼠24此外，对经FACS纯化的显微胶质细胞（MG）和原代培养的MG中一组miRNA的定量分析显示，在生长阶段，培养的MG中MG特异性miRNA（mGLiomiRs）的水平变化不大。然而，延长培养时间会导致miRNA水平发生变化，进而影响mRNA水平和蛋白质表达，因为miRNA是翻译调控因子。25.
2013年，该穆勒胶质细胞（MG）培养模型被用于测试多种转录因子将MG重编程为视网膜神经元的能力20. Ascl1 被发现是一种非常稳健且可靠的重编程因子。过表达 Ascl1通过 病毒载体诱导了形态学变化、神经元标志物的表达以及神经元电生理特性的获得。更重要的是，从这些首次研究中获得的见解和结果 体外 实验已成功转移至 体内 应用22,26 表明原代小胶质细胞培养是进行初始因子筛选及胶质细胞特征评估的可靠工具 体内 实施
几年前，有研究发现，在脑组织中富集且在视网膜神经元中高表达的miRNA miR-124能够诱导 Ascl1 培养的MG细胞中的表达21. Ascl1 在活细胞中的表达被可视化 通过 一个 Ascl1 报告基因小鼠（Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl）。报告基因小鼠是一种经过基因改造的小鼠，其DNA中插入了报告基因。该报告基因编码报告蛋白，在本研究中为tdTomato，一种红色荧光蛋白。该报告蛋白用于报告目的基因的表达情况，此处指 Ascl1换句话说，表达 Ascl1 会变成红色。由于&#160;Ascl1&#160;是&#160;仅&#160;表达&#160;在&#160;视网膜前体细胞9,&#160;这 Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl 小鼠模型可用于追踪小胶质细胞向 Ascl1 表达RPCs，即转化后的细胞将表达红色荧光tdTomato报告蛋白。这是一种不可逆标记，因为这些细胞的DNA已被改变。因此，任何后续的神经元分化过程均可被可视化，因为tdTomato标记会保留在分化细胞中。如果 Ascl1 表达MG来源的RPCs（带有tdTomato标记）分化为神经元后，这些神经元仍将保留红色标记。因此，该小鼠模型不仅可用于活细胞成像中标记MG来源的RPCs，还可用于对这些MG来源的（红色）RPCs进行命运图谱绘制和谱系追踪。最近，关于miRNA的研究集&#160;视网膜前体细胞&#160;是&#160;已鉴定&#160;和&#160;MG&#160;培养物&#160;的 Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl 使用RPC报告基因小鼠筛选并检测这些miRNA对重编程能力与效率的影响27一种候选分子——RPC-miRNA miR-25，被发现能够将培养的MG细胞重编程为 Ascl1 表达（Ascl1-Tomato+）的细胞。这些重编程细胞随时间推移逐渐获得神经元特征，包括神经元形态（胞体较小，具有短或长的细突起）以及神经元转录本的表达水平测定 通过 scRNA-Seq 以及神经元蛋白表达的验证 通过 免疫荧光标记27.
此处的实验方案详细描述了如何培养和转染来自P12小鼠的MG细胞，该方法改编自先前的研究工作21,24,27选择本方案中所述的miRNA miR-25，该miRNA在视网膜前体细胞（RPCs）中高表达，而在穆勒胶质细胞（MG）或视网膜神经元中表达水平较低。为了过表达miR-25，使用小鼠miR-25模拟物，即人工合成的miRNA分子。作为对照，使用来自一种miRNA的模拟物 秀丽隐杆线虫 选择在哺乳动物细胞中无功能的基因，通过可视化方法实现了对MG向RPC转化过程的观察 通过 RPC 报告小鼠（Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl)，一种混合背景的小鼠（C57BL/6, S129，以及 ICR品系）。然而，该培养方法适用于所有小鼠品系，包括野生型品系。近年来，原始实验方案已经过改良，以缩短生长期和整体培养周期，确保胶质细胞状态更加稳定，并最大限度减少长期培养过程中出现的细胞退行性变化。常规转染的时间窗口也从3小时延长至2天。如前所述，尽管当前方案将穆勒胶质细胞（MG）培养作为再生研究的工具进行描述，但该方法不仅可用于测试重编程因子，还可根据需要调整用于其他研究，包括MG的迁移或增殖行为、损伤/细胞损伤相关模型，以及潜在机制和信号通路的鉴定等。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT 小鼠 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>#012882</td><td>Ascl1-CreERT 小鼠与 tdTomato 小鼠杂交</td></tr><tr><td>tdTomato-STOPfl/fl 小鼠&amp;nbsp; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>#007914</td><td>基因分型是鉴定 Ascl1CreER 阳性小鼠所必需的</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-羟基他莫昔芬， &amp;ge;98% Z 异构体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>在乙醇中重新溶解，分装后冷冻</td></tr><tr><td>16 % 甲醛（PFA）水溶液</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>2% PFA（用磷酸盐缓冲液 PBS 配制），冷冻分装</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗兔IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>711-546-152</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗山羊IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>705-606-147</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗人 Otx2 抗体，R&amp;amp;D系统</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗兔MAP2抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>稀释比例 1:250</td></tr><tr><td>抗红色荧光蛋白（RFP）抗体</td><td>Antibodies-Online</td><td>ABIN334653</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>在 PBS 中重悬，分装冻存</td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td>冷冻分装样品</td></tr><tr><td>脑生理神经元培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>在1.2节中用作神经元培养基质，储存于 4 &amp;deg;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.&lt;br/&gt; 1643231638-1407032920.163831&lt;br/&gt; 5521&amp;amp;_gac=1.124727416.1643&lt;br/&gt; 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR&lt;br/&gt; IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY&lt;br/&gt; dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY&lt;br/&gt; -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>按照说明书进行重悬， 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>二丁酰-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>用二甲基亚砜（DMSO）重悬，分装冻存</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>冻存分装样本</td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp;Opti-MEM 低血清培养基，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp;TrypLE Express 酶（1X），酚红</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>含有胰蛋白酶的溶液，储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白，天然</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-017-015</td><td> &lt;p&gt;冻存分装样本，(https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.&lt;br/&gt; 1643231638-1407032920.163831&lt;br/&gt; 5521&amp;amp;_gac=1.124727416.164323&lt;br/&gt; 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA&lt;br/&gt; KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN&lt;br/&gt; 源文本无法识别，可能为乱码或非有效内容。请提供有效的英文科学文本以进行翻译。&lt;br/&gt; 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>冻存分装样本</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA 模拟物阴性对照</td><td>地平线</td><td>CN-001000-01-50</td><td>用无RN酶水重悬（200 &amp;micro;M），冷冻分装样品</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA 小鼠 mmu-miR-25-3p 模拟物</td><td>地平线</td><td>C-310564-05-0050</td><td>用无RN酶水重悬（200 &amp;micro;M），冷冻分装样品</td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>冷冻分装样品</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-103-049</td><td>用于第1.1节生长培养基，储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>LK003153</td><td>在Earle平衡盐溶液中重悬，分装后冷冻</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>冻存分装样本</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸氢溴化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4538-50MG</td><td>用无菌水重悬，分装后冷冻</td></tr><tr><td>重组人BDNF蛋白</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>248-BDB-050/CF</td><td>用无菌 PBS 和 FBS 重悬，分装后冻存</td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF 蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td><td>用无菌 PBS 重悬，分装后冻存</td></tr><tr><td>重组大鼠GDNF蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>512GF010</td><td>用无菌 PBS 重悬，分装后冻存</td></tr><tr><td>罗丹明红 570 - AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>712-296-150</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂（Lipofectamine 3000）</td><td>Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿/耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 提示&amp;nbsp; 无菌滤器&amp;nbsp; 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L 提示&amp;nbsp; 无菌滤膜移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L TIP 无菌滤膜吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 提示&amp;nbsp; 无菌滤膜移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>可调体积移液器（2.5、10、20、100、200、 &amp;amp; 1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>12孔平底带盖培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>24孔带盖平底多孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp; 无菌滤器 10 mL 一次性血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp; 无菌滤器 50 mL 一次性血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp; 无菌滤器 5 mL 一次性血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>无粉丁腈检查手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片（直径12 mm，厚度0.17–0.25 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22293232</td><td></td></tr><tr><td>真空滤器，孔径=0.22 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>一体化荧光显微镜 Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>双目变焦立体显微镜</td><td>视觉科学</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿（100 mm 直径）</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子 - 生物学/钛合金</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子 - 生物学/不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 弯头镊子 - 生物学/钛合金</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000508</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀-锋利</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 剪刀，8 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>金属珠浴</td><td>Lab Armor</td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>摆动式混合器，电气=115V，60Hz，转速=24 rpm</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>硅胶涂层解剖培养皿（90 mm 直径）</td><td>生命系统仪器设备</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>镊子，经济型 #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>水套式CO2培养箱</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

原代细胞培养研究微小rna处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

穆勒胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞，可作为视网膜神经元再生的来源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG介导的再生可自然发生；而在哺乳动物中，则需要特定因子的刺激或基因/表观遗传学操作。由于MG仅占视网膜细胞总数的5%，因此需要能够特异性研究该细胞群体的模型系统。其中一种模型系统是原代MG培养，该系统具有可重复性，可用于多种应用，包括分子/因子的筛选与鉴定、化合物或因子的测试、细胞监测和/或功能检测。该模型可用于研究补充或抑制微小RNA（miRNAs）后小鼠MG转化为视网膜神经元的潜能 通过 转染人工miRNA或其抑制剂。结合使用小胶质细胞特异性报告小鼠、免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq），证实这些培养物中80%–90%的细胞为小胶质细胞（MG）。利用该模型发现，miRNA可将MG重编程为视网膜前体细胞（RPCs），随后进一步分化为类神经元细胞。该技术的优势在于，可在将miRNA候选分子应用于体内实验之前，先对其效率和作用效果进行评估。 体内 应用。

本方案描述了如何从P12小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），并利用Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 视网膜前体细胞（RPC）报告小鼠，通过miR-25将这些细胞重编程为视网膜神经元。此前的研究已详细报道了该方法可用于筛选其他适合的miRNA（模拟物或抑制剂，可单独使用或组合使用），以将MG重编程为RPC，进而获得神经元样细胞特征27。本方法已进行优化，可加快细胞培养速度，从而最大限度减少人工环境随时间推移所引起的细胞改变24,28,29。
视网膜解离与原代穆勒胶质细胞培养的生长阶段 
最早在第一天即可观察到第一个肌无力症状 体外 使用光学显微镜观察。MG 具有管状、细长的形态以及浅灰色的细胞体（<stro...

从小鼠视网膜获得的穆勒胶质细胞原代培养物是研究微小RNA处理后胶质细胞转化为视网膜前体细胞的一种非常稳健且可靠的工具。可在将其进一步应用于体内实验之前，利用该体系检测单个分子或分子组合的效果。 体内 方法。

原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能

穆勒胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞，可作为视网膜神经元再生的来源。在低等脊椎动物中……

本方案可用于研究Muller胶质细胞在特定因子（如microRNA）处理后转化为视网膜前体细胞的潜能与能力。该技术的优势在于，可在将microRNA应用于体内实验之前，先对其效率和效果进行测试。本实验操作将由Stefanie Wohl实验室的博士生Seoyoung Kang协助演示。首先，将摘除的眼球短暂浸入含有乙醇的离心管中，以避免动物体内的细菌带入。然后，在10厘米的培养皿中短暂清洗眼球，再将其放入置于冰上的24孔板中。眼球摘除并清洗完毕后，将一只眼球置于解剖皿中，并放置在带有光源的体视显微镜下进行解剖。现在用Dumont 5号精细镊子夹住视神经及巩膜周围的结缔组织，将一只眼球固定在解剖皿上并轻轻压紧。接着，用30号针头在角膜中央刺一个小孔，以便静脉剪更容易进入。然后，使用静脉剪沿睫状体周围剪开角膜，并用Dumont 5号精细镊子小心移除角膜、晶状体、虹膜和玻璃体。随后用静脉剪解剖巩膜，直至暴露视神经，使用Dumont 5号精细镊子小心取出视网膜。接着用第二把Dumont 5号精细镊子抵住视网膜，彻底去除玻璃体。将视网膜转移后，用无菌移液管尖端约2.5厘米处剪断，以扩大其直径。现在使用该枪头，完整取出视网膜组织而不损伤组织，并将视网膜转移至一个新的无菌培养皿中，内含冷的HBSS，轻轻晃动培养皿。接着，使用一支新的无菌移液管，小心推动视网膜以冲洗掉视网膜色素上皮细胞。立即将分离的视网膜放入24孔板的一个新的洁净孔中，孔内预先加入1 mL HBSS，并在解剖过程中始终保持24孔板置于冰上。按照论文中所述方法配制木瓜蛋白酶和DNase I解离混合液。现在使用扩口移液管吸取视网膜组织。等待视网膜沉降至管尖底部后，将视网膜转移至含有木瓜蛋白酶和DNase I混合液的离心管中，注意避免带入过多HBSS。接下来，将离心管置于孵育箱中的旋转摇床（nutator）上，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟。随后，使用1毫升移液器轻轻反复吹打，使细胞解离。细胞解离后，加入275微升Papain解离试剂盒中的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂以中和Papain，并通过上下吹打轻轻混匀。将离心管放入离心机，在4摄氏度下以相对离心力300离心8分钟。将表皮生长因子加入已预热至37摄氏度的计算体积的生长培养基中。小心地从离心机中取出离心管。小心且完全地移除上清液，注意不要触碰管底的沉淀物。随后，用500微升添加了表皮生长因子的培养基重新悬浮细胞沉淀。然后，将细胞悬液转移至已标记的12孔板中的一个孔内。用另外500 µL添加了表皮生长因子的培养基冲洗离心管，并将冲洗液加入孔中。轻轻摇动培养板，然后将培养板放入37°C、含二氧化碳的培养箱中。首先检查细胞融合度是否达到90%至100%。接着，移除培养基，并加入一毫升冷的HBSS洗涤孔板。轻轻摇动培养板，彻底去除HBSS，确保无残留。随后，加入500微升预热的含胰蛋白酶溶液，以使细胞从孔板上脱离。轻轻摇动，在37摄氏度培养箱中孵育2分钟。将培养板从培养箱转移至生物安全柜后，倾斜吸除含胰蛋白酶的溶液。小心缓慢地将溶液反复吹打数次，直至细胞完全脱落。接下来，将此细胞悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，并将离心管放入离心机。在4°C条件下以300 × g离心8分钟，然后将离心管重新移入生物安全柜中。弃去上清液，注意不要触及沉淀。现在，加入600 µL预热的培养基，轻轻重悬细胞沉淀，并上下吹打约30至40次。最后，将获得的细胞悬液100 µL接种到24孔板中六个包被盖玻片的中央。将培养板放入培养箱中，使细胞沉降，以备后续使用microRNA模拟物进行转染。图中显示了转染后第五天的对照组情况，仅有少量 Ascl1-Tomato 阳性细胞存在。然而，在经 miR-25 处理后，可观察到更多的 Ascl1-Tomato 阳性细胞。定量分析结果显示，与对照组相比，经 miR-25 处理的孔中 Ascl1-Tomato 阳性细胞数量增加了四倍。最重要的是，在riR-25处理的孔中发现的绝大多数Ascl1-Tomato阳性细胞呈现出神经元形态。这种神经元形态的特征包括细胞胞体变小、出现细长的突起以及形成微小的网络结构。定量分析显示，约70%的Ascl1-Tomato阳性细胞具有神经元特征。免疫荧光标记显示，具有神经元形态的 Ascl1-Tomato 阳性细胞表达神经标记物 OTX2 和 MAP2，证实其神经元身份。对这些细胞的定量分析表明，在过表达 miR-25 后，每视野约有 40 个 Ascl1-Tomato 阳性神经元，而对照组每视野仅有 5 个神经元细胞。在经 miR-25 处理的样本中，鉴定出的神经元细胞约占总 Ascl1-Tomato 阳性细胞群体的 70%。此外，对OTX2和MAP2共表达神经元绝对数量的定量结果显示，经miR-25处理后，每视野约有60个神经元，而对照组每视野仅有10个神经元。必须在洁净且经过消毒的环境中操作，使用清洁无菌的工具，并谨慎操作，避免任何剧烈处理。下游应用可包括蛋白质定量、DNA或RNA分析，或电生理学研究。该技术帮助我们探索了有关核重编程的初步问题，核重编程属于再生医学领域。此外，还可通过测试多种因素和条件，进一步探索新的科学问题。

primary-cell-cultures-to-study-regeneration-potential-murine-mller

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

原代细胞培养物研究小鼠穆勒胶质细胞在微RNA处理后的再生潜力

本视频演示了从小鼠幼崽的小脑中分离和培养小脑神经前体细胞的过程。通过差速贴壁法分离并纯化小脑颗粒神经元前体细胞，有效去除星形胶质细胞。这些培养的前体细胞随后可分化为小脑颗粒神经元。...

分离与培养小鼠小脑颗粒神经元前体细胞

本视频展示了从小鼠视网膜中分离的穆勒胶质细胞（MG细胞）的培养过程。视网膜通过消化酶处理解离为单细胞悬液。随后，细胞在含有促进MG细胞增殖和神经元细胞死亡的生长因子的培养基中培养。在传代过程中去除死亡的神经元细胞，继续培养MG细胞以用于后续分析。...

建立从小鼠视网膜获取的穆勒胶质细胞培养体系

本视频展示了一种从成年小鼠脊髓组织中分离和培养原代混合胶质细胞的技术。该方案包括对组织进行酶消化，随后去除破碎的细胞膜和髓鞘碎片，以获得单细胞悬液。然后将细胞接种于适合混合胶质细胞生长的优化培养基中进行培养。...

建立源自小鼠脊髓的原代混合胶质细胞培养

我们概述了从新生小鼠大脑皮层和成年小鼠脊髓中高效、快速分离和培养活体小胶质细胞的方法。皮层小胶质细胞的解剖与接种可在90分钟内完成，初次解剖后约10天可进行后续的小胶质细胞收获。...

培养来自新生期和成年中枢神经系统的小胶质细胞

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内...

分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以在无血清培养基中促进动态分支状形态

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。...

从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。...

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

了解原代小鼠穆勒胶质细胞培养方法，通过微RNA处理诱导其向视网膜祖细胞转化。该技术为视网膜再生医学研究提供可靠的体外筛选平台。

原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能

探索更多视频