硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的MATLAB平台（RpEGEN）

斑马鱼具有再生多种不同类型组织的内在能力，包括视网膜色素上皮（RPE），这一特性使其独具优势。本实验方案可用于鉴定驱动RPE再生及与RPE疾病相关机制的分子通路。该方法的主要优势在于其多功能性。

除了研究视网膜色素上皮（RPE）再生外，本方案还可用于观察RPE的退行性过程以及RPE损伤对眼部邻近组织的影响。包括人类在内的哺乳动物无法修复由外伤或退行性疾病引起的大面积RPE损伤。利用斑马鱼作为工具来发现促进RPE再生的因子，是推动哺乳动物RPE再生的重要一步。

为了配制新鲜的10毫摩尔MTZ溶液，在受精后第五天，将MTZ粉末加入不含PTU的系统水中，并在37摄氏度下剧烈振荡混匀一小时。将10毫摩尔MTZ溶液在室温下置于台式旋转器或摇床上冷却一小时。为了筛选携带rpe65a:nsfB-eGFP转基因的斑马鱼幼鱼，使用配备488纳米激发激光的荧光体视显微镜，将转基因eGFP阳性幼鱼与非转基因eGFP阴性幼鱼分离开来。

通过将幼虫直接用移液器转移至含有新鲜1.5X PTU但不含三卡因的培养皿中，立即唤醒已筛选的幼虫。筛选完成后，进一步将eGFP阳性的幼虫分至两个培养皿组中，一组接受MTZ处理，另一组作为未消融对照组。随后，通过从消融处理组的培养皿中去除1.5X PTU，并加入新配制的10毫摩尔MTZ溶液，实现视网膜色素上皮的消融。

同时从未消融的对照组培养皿中移除1.5X PTU，并加入不含PTU的新鲜系统水。在恰好24小时后移除10毫摩尔的MTZ溶液，并加入不含PTU的新鲜系统水。更换MTZ阴性培养皿中的不含PTU的新鲜系统水。

在受精后第四天筛选表达 eGFP 的阳性幼虫。eGFP 在受精后第四天可见，但其荧光强度较第五天弱。将 eGFP 阳性幼虫以每孔不超过 10 条幼虫的密度接种于六孔板中，而非培养皿中，用于药理学处理。

为消融和未消融的幼虫分别指定单独的六孔板。确定所需15微摩尔IWR-1或体积匹配的DMSO溶剂对照预处理的体积，并相应地将1.5X PTU分装至锥形管中。将IWR-1储备液加入1.5X PTU中，使IWR-1的终浓度为15微摩尔。

向1.5X PTU中加入等体积的DMSO储备液，通过涡旋充分混匀，并肉眼确认化合物完全溶解。从六孔板中移除表达eGFP阳性幼鱼的1.5X PTU溶液，每孔加入5毫升新鲜配制的0.06% DMSO或15 µM IWR-1处理液。

于次日消融RPE。受精后第五天，确定未消融和已消融的六孔板所需的药理学处理组及溶剂对照组的处理体积，并将适量体积的不含PTU的新鲜系统水或10毫摩尔浓度的MTZ溶液分装至锥形管中。按照先前方法，将IWR-1和DMSO储备液分别加入对应的锥形管中。

通过涡旋充分混匀，并目视确认化合物完全溶解。从指定的未消融和已消融的六孔板中去除含0.06% DMSO和15 µM IWR-1的1.5X PTU预处理液。更换为不含PTU和MTZ溶液的相应新鲜系统水。

在恰好24小时后，从含10毫摩尔MTZ的溶液中去除0.06% DMSO和15微摩尔IWR-1处理，并用不含PTU的新鲜系统水重新添加上述处理。在未消融的六孔板中，使用不含PTU的新鲜系统水补充0.06% DMSO和15微摩尔IWR-1处理。在基因消融后的幼虫维持期间，利用体视显微镜的透射光照明监测消融的成功率和消融范围。

使用 Fiji 生成视网膜色素上皮（RPE）感兴趣区域（ROI）时，打开一个 8 位 TIFF 图像，通过选择“图像”、“变换”、“水平翻转”来调整图像方向，使背侧朝上、远端朝左。对于最后一步操作，请根据该图像所需的方向性选择最合适的选项。通过选择“分析”、“工具”、“ROI 管理器”来启动 ROI 管理器。

使用图像，缩放并切换 DAPI 和明场通道。为提高效率，请使用键盘快捷键。确定 RPE 顶侧与外界膜尖端相邻的位置，并将此解剖标志作为 ROI 的起始点。

使用 Fiji 工具栏中的多边形选择工具，结合 DAPI 和明场图像通道以及图像缩放功能，确定 RPE 的顶端和基底边界，创建 RPE 感兴趣区域（ROI）。将 ROI 的背侧和腹侧末端处理成尖锐的点状，而不是钝化或圆化。在 ROI 管理器中点击“add”按钮以添加该 ROI。

在 ROI 管理器中选择“更多”并保存，以保存 ROI 文件。双击 rpegen.m 文件，即可在编辑器窗格中打开。

在 rpegen.m 文件的用户自定义变量部分，输入包含 roi 文件的文件夹、tiff 图像文件的文件夹以及输出文件保存位置的目录路径。输入要导出的 mat 文件的组名，以及 TIFF 图像堆栈中明场通道的位置。

通过点击 MATLAB 顶部编辑器菜单中的运行按钮来执行脚本。保存 MAT 文件后，将为每幅图像生成一个包含三个面板的图形，并同时以 PDF 格式保存至输出目录。请等待这些质量控制 PDF 文件保存至输出文件夹，且最后一个图形消失后再进行后续操作。

打开各个 PDF 文件，并核对所有 ROI 是否与明场图像一致。双击 rpegen_permplot.m 文件，在新的编辑器标签页中打开。

在“单用户定义变量”部分，输入运行 rpegen.m 脚本后生成的 MAT 文件所在输出文件夹的目录路径。输入每个要加载的 MAT 文件名。

通过点击编辑器菜单中的运行节按钮来执行此部分脚本。在第二节中，在数据A和数据B变量中输入用于统计比较的两个组的名称，并在reps变量中指定置换模拟重复的次数。本演示仅使用了2,000次重复，以减少处理时间。

通过点击编辑器菜单中的运行节按钮来执行此部分脚本。使用运行节按钮分别独立运行热图图形、分组结果和 P 值部分。受精后五天幼虫的整体装片损伤显示，在进行基因消融筛选时，视网膜色素上皮（RPE）中出现强烈的转基因表达。

未消融的受精后六天幼鱼的横切冷冻切片显示，转基因表达局限于成熟的视网膜色素上皮（RPE）细胞，且最强表达局限于RPE中央的2/3区域。箭头指示顶端微绒毛。消融后一天损伤幼鱼的横切冷冻切片显示eGFP阳性细胞形态遭到破坏。

箭头指示固缩的细胞核。未消融的受精后七天幼鱼整体装片显示，视网膜色素上皮（RPE）在整个眼部均存在色素沉着；而损伤后两天的消融幼鱼则显示中央RPE区域的色素缺失。利用RpEGEN生成的图谱显示，在RPE全长范围内，未消融的受精后九天DMSO组与IWR-1组之间具有相似性。

结果显示，在损伤后第四天，经消融处理的DMSO组和IWR-1组整体像素强度较轻，其中IWR-1处理组的消融区域显得最亮，与其他任何处理组相比均更为明显。在比较经消融处理并接受IWR-1处理的幼鱼与经消融处理的DMSO对照组幼鱼时，中央视网膜色素上皮（RPE）色素沉着的差异具有显著性。利用这种斑马鱼消融模型，我们已能够鉴定出多个对RPE再生起关键调控作用的分子信号通路，例如本文中所展示的Wnt信号通路。