Name: 硝基还原酶/甲硝唑介导的消融和MATLAB平台（RpEGEN）研究斑马鱼视网膜色素上皮的再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 学习利用硝基还原酶/甲硝唑介导的消融和MATLAB平台（RpEGEN）研究斑马鱼视网膜色素上皮再生。该方法可识别驱动RPE再生的分子通路，为哺乳动物RPE修复提供新策略。

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本文所述工作由美国国立卫生研究院（RO1-EY29410 资助 J.M.G，以及 NIH 核心资助 P30-EY08098 资助眼科系）；UPMC 免疫移植 &amp;#38; 治疗中心（资助编号：L.L.L. 和 J.M.G.）；以及眼科研究 E. Ronald Salvitti 讲席（资助编号：J.M.G.）。额外支持来自眼科 Wiegand 奖学金（资助编号：L.L.L）、眼科 &amp;匹兹堡耳科基金会以及纽约“防盲研究”组织提供的无限制资助。作者还要感谢Amanda Platt提供的技术支持，以及Hugh Hammer博士和水生动物饲养团队在动物护理方面给予的出色支持。

L.L.L. 是美国专利 #9,458,428 的共同发明人，该专利描述了一种从人多能干细胞快速衍生视网膜色素上皮细胞的方法；此专利与本文内容无关。J.M.G. 和 G.B.F. 无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了在幼龄斑马鱼中遗传性消融视网膜色素上皮（RPE）并研究其退变与再生机制的方法。该方案也已在成年斑马鱼中成功实施3，但表征程度相对有限，因此本文重点介绍幼鱼阶段的操作。本方案此部分的关键步骤（步骤1-4）包括：1）在黑色素生成开始前向胚胎中加入1.5x PTU；2）在2-3 dpf时对经PTU处理的胚胎进行脱膜；3）仔细筛选eGFP阳性个体；4）在使用MTZ进行遗传消融过程中精确控制换水时间。PTU可抑制黑色素合成21,22，在本RPE消融模型中被用于促进对rpe65a:nfsB-eGFP转基因表达的筛选，并通过色素组织的缺失及随后的恢复，分别实现对RPE退变与再生过程的表征3。由于PTU仅能抑制后续色素生成，而无法使已开始黑色素生成的组织脱色21，因此必须在色素形成开始前添加PTU。斑马鱼的色素生成起始于约24 hpf<sup class="xref...

本文所述方法详细介绍了一种利用幼年斑马鱼遗传性消融视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。RPE覆盖于眼球后部，位于神经视网膜的分层结构与构成脉络膜的血管层之间。RPE执行多种关键功能，包括提供营养支持、吸收光毒性光线以及维持视觉循环相关蛋白的稳定，这些功能对于维持邻近组织的健康与完整性至关重要1. 哺乳动物视网膜色素上皮（RPE）的损伤在病灶较小时可修复2；然而，较大损伤或进行性退行性疾病所造成的损害是不可逆的。在人类中，视网膜色素上皮（RPE）退行性疾病（例如，&#160;年龄相关性黄斑变性（AMD）和Stargardt病）导致永久性视力丧失，且由于可用的治疗选择有限，患者生活质量下降&#160;生活质量。哺乳动物RPE自我修复能力有限，导致RPE再生过程研究领域存在知识空白。鉴于斑马鱼在多种不同组织类型中均具有强大的再生能力，本方案旨在建立一种 体内 脊椎动物系统，以促进对内在再生视网膜色素上皮（RPE）的研究，并揭示驱动该再生反应的机制。采用此处所述的消融范式，经典Wnt信号通路3mTOR 通路4以及免疫相关反应5 已被确定为RPE再生的关键介质，可能具有功能上的重叠。
在此基因消融范式中，Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 斑马鱼在视网膜色素上皮增强子元件 rpe65a7 的调控下，表达一种源自细菌的硝基还原酶（NTR/nfsB）基因6，该基因与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）融合。通过将前体药物甲硝唑（MTZ）加入饲养斑马鱼的系统水中，即可实现细胞消融。硝基还原酶在细胞内激活MTZ，导致表达NTR/nfsB的细胞发生DNA交联和凋亡8,9。该技术已广泛应用于斑马鱼中，用于消融视网膜10,11,12,13及其他组织的细胞8。上述各要素共同实现了可诱导性细胞消融技术（NTR/MTZ）的靶向表达(rpe65a)8,9，并提供了用于可视化观察的荧光标记（eGFP）。
其他有趣的 体内 也存在可用于研究视网膜色素上皮（RPE）再生潜能的模型14这些现象较为广泛，包括两栖动物视网膜切除术后视网膜色素上皮细胞（RPE）向视网膜细胞的转分化，其中因视网膜再生而丢失的RPE细胞被替代15,16损伤后RPE的修复 &#34;超级愈合&#34; MRL/MpJ 小鼠17以及在自发生RPE和视网膜变性的大鼠模型中对RPE增殖的外源性刺激18以及其他。 体外 模型，例如成人人类视网膜色素上皮干细胞（RPESCs）19 也已开发出来。这些模型均为研究与视网膜色素上皮再生相关的细胞过程的宝贵工具（例如，&#160;增殖、分化等；然而，斑马鱼在视网膜色素上皮（RPE）消融后具有独特的内在修复能力。
尽管本方法的撰写重点在于理解驱动视网膜色素上皮（RPE）再生的机制，但Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)转基因品系及该遗传消融方案也可用于研究其他细胞过程，例如RPE凋亡、RPE变性以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响。该消融方案还可进行修改以纳入药理学干预，这是一种便捷的初步策略，可用于筛选感兴趣的信号通路。例如，使用Wnt反应抑制剂-1（IWR-1）阻断经典Wnt通路已被证明会损害RPE再生203。本文中重复了该实验，以指导用户完成药理学干预实验，并作为概念验证，用于验证一种基于色素恢复程度量化RPE再生的MATLAB脚本（RpEGEN）。与转基因品系和消融方案类似，RpEGEN脚本具有可适应性，可用于量化RPE内的其他标志物或细胞过程。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;实验材料/设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-脒基苯基)-6-吲哚甲脒二盐酸盐（DAPI）</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>锥形聚丙烯离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>目录号对应50 mL离心管</td></tr><tr><td>金刚石尖刻划笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-254-51</td><td>由Electron Microscopy Sciences生产，类似该货号的产品亦可使用</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;ge;99.7%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td>请查阅机构对化学废弃物处理的要求</td></tr><tr><td>胚胎培养箱（大型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>3720A</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养箱（小型/台式）</td><td>Labnet</td><td>I5110A</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td>或类似设备，需配备488 nm激发激光/滤光片</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-4</td><td>由Corning生产，非无菌</td></tr><tr><td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5.04462</td><td>由Calbiochem生产；25 mM溶于DMSO；请查阅机构对化学废弃物处理的要求</td></tr><tr><td>亚甲蓝（粉末）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP117-100</td><td>也可使用预先配制的水溶液</td></tr><tr><td>甲硝唑（MTZ）</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3761</td><td>请查阅机构对化学废弃物处理的要求</td></tr><tr><td>N-苯硫脲（PTU）</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7629</td><td>请查阅机构对化学废弃物处理的要求</td></tr><tr><td>16%（w/v）无甲醇甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>属于化学废弃物，需妥善处理</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>直径10 cm</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（粉末包）</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>用于配制10× PBS储备液</td></tr><tr><td>蛋白酶K（Pronase）</td><td>Millipore Sigma</td><td>PRON-RO</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Benchmark</td><td>H2010</td><td>用于在37摄氏度下孵育MTZ 1小时</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>或类似设备，需具备透射光照明</td></tr><tr><td>学生型Dumont #5镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>尖端精细的镊子，用于手动去壳</td></tr><tr><td>台式旋转器/摇床</td><td>Scilogex</td><td>SK-D1807-E</td><td></td></tr><tr><td>移液管（带橡胶头）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z135003</td><td>容量3.2 mL，非无菌</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS-222）</td><td>Pentair</td><td>TRS1, TRS2, TRS5</td><td>也可从Fisher Scientific购买（货号NC0342409）</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI（Fiji is Just ImageJ）</td><td>FIJI（Fiji is Just ImageJ）</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td>版本：2.0.0-rc-69/1.52p；构建号：269a0ad53f；所需插件：Bio-Formats</td></tr><tr><td>GRAMM示例与使用指南</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>运行RpEGEN所需工具箱：图像处理工具箱、曲线拟合工具箱、统计与机器学习工具箱</td></tr><tr><td>MATLAB支持</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/support.html</td><td></td></tr></tbody></table>

硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的matlab平台（rpegen）

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

视网膜色素上皮（RPE）位于眼球后部，执行维持邻近视网膜和血管组织健康与完整性的关键功能。目前，哺乳动物RPE的修复能力有限，仅能应对微小损伤，这一局限性阻碍了相关研究的进展 体内 RPE再生过程。本文提供了一种详细的方法学，以促进对 体内 利用斑马鱼进行RPE修复&#160;具有强大组织再生能力的脊椎动物模型。本方案描述了一种转基因硝基还原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）介导的损伤模型（rpe65anfsB-eGFP），在甲硝唑（MTZ）处理24小时后可特异性消融视网膜色素上皮（RPE）中央三分之二区域，并随后观察组织的再生恢复过程。本研究重点描述了在斑马鱼幼鱼中进行RPE消融的方法，并概述了评估药理化合物对RPE再生影响的实验方案。同时介绍了RpEGEN的构建与验证过程，该工具为一种基于色素沉着自动量化RPE再生程度的MATLAB脚本。除研究主动的RPE修复机制外，本实验体系还可拓展应用于RPE变性与损伤应答的研究，以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响，涵盖多种细胞与分子过程。该斑马鱼模型在揭示驱动RPE再生及相关疾病机制的基因、分子网络与生物学过程方面具有重要意义，其长远目标是将所获知识应用于哺乳动物系统，并最终推动治疗策略的开发。

已知抑制经典Wnt信号通路会显著损害斑马鱼视网膜色素上皮（RPE）的再生能力，本研究采用遗传消融模型（rpe65a:nfsB-eGFP）和药理学干预方法（IWR-1）进行验证，相关方法在本方案中有详细描述3。本实验在此重复进行，旨在验证一种基于色素沉着的自动化定量斑马鱼RPE再生的方法。下文总结的结果涵盖了从受精当天（0 dpf）到利用RpEGEN进行RPE再生定量的全部实验步骤。
在幼年斑马鱼中实施视网膜色素上皮消融方案（结合药理学干预） 
从三组不同的亲本（N = 3）收集的胚胎在约6 hpf时开始用1.5x PTU处理，并在1 dpf时通过肉眼确认视网膜色素上皮（RPE）和表层黑色素细胞中无色素沉着。胚胎在2 dpf时使用2 mg/mL蛋白酶进行酶法去壳（步骤2.4）。在4 dpf时，幼鱼使用三卡因（MS-222）麻醉，并利用荧光体视显微镜通过eGFP荧光进行筛选（步骤3.2和5.2）。eGFP+ 幼虫被转移至6孔板中（每孔10只幼虫），并分别用0....

本方案描述了利用转基因斑马鱼模型遗传消融视网膜色素上皮（RPE）的方法。文中详细阐述了对该方案的改进，以结合使用药理学化合物调控信号通路。此外，开发并介绍了基于色素沉着定量分析RPE再生的MATLAB平台，并对此进行了讨论。

硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的MATLAB平台（RpEGEN）

视网膜色素上皮（RPE）位于眼球后部，执行维持邻近组织健康与完整性的关键功能……

斑马鱼具有再生多种不同类型组织的内在能力，包括视网膜色素上皮（RPE），这一特性使其独具优势。本实验方案可用于鉴定驱动RPE再生及与RPE疾病相关机制的分子通路。该方法的主要优势在于其多功能性。除了研究视网膜色素上皮（RPE）再生外，本方案还可用于观察RPE的退行性过程以及RPE损伤对眼部邻近组织的影响。包括人类在内的哺乳动物无法修复由外伤或退行性疾病引起的大面积RPE损伤。利用斑马鱼作为工具来发现促进RPE再生的因子，是推动哺乳动物RPE再生的重要一步。为了配制新鲜的10毫摩尔MTZ溶液，在受精后第五天，将MTZ粉末加入不含PTU的系统水中，并在37摄氏度下剧烈振荡混匀一小时。将10毫摩尔MTZ溶液在室温下置于台式旋转器或摇床上冷却一小时。为了筛选携带rpe65a:nsfB-eGFP转基因的斑马鱼幼鱼，使用配备488纳米激发激光的荧光体视显微镜，将转基因eGFP阳性幼鱼与非转基因eGFP阴性幼鱼分离开来。通过将幼虫直接用移液器转移至含有新鲜1.5X PTU但不含三卡因的培养皿中，立即唤醒已筛选的幼虫。筛选完成后，进一步将eGFP阳性的幼虫分至两个培养皿组中，一组接受MTZ处理，另一组作为未消融对照组。随后，通过从消融处理组的培养皿中去除1.5X PTU，并加入新配制的10毫摩尔MTZ溶液，实现视网膜色素上皮的消融。同时从未消融的对照组培养皿中移除1.5X PTU，并加入不含PTU的新鲜系统水。在恰好24小时后移除10毫摩尔的MTZ溶液，并加入不含PTU的新鲜系统水。更换MTZ阴性培养皿中的不含PTU的新鲜系统水。在受精后第四天筛选表达 eGFP 的阳性幼虫。eGFP 在受精后第四天可见，但其荧光强度较第五天弱。将 eGFP 阳性幼虫以每孔不超过 10 条幼虫的密度接种于六孔板中，而非培养皿中，用于药理学处理。为消融和未消融的幼虫分别指定单独的六孔板。确定所需15微摩尔IWR-1或体积匹配的DMSO溶剂对照预处理的体积，并相应地将1.5X PTU分装至锥形管中。将IWR-1储备液加入1.5X PTU中，使IWR-1的终浓度为15微摩尔。向1.5X PTU中加入等体积的DMSO储备液，通过涡旋充分混匀，并肉眼确认化合物完全溶解。从六孔板中移除表达eGFP阳性幼鱼的1.5X PTU溶液，每孔加入5毫升新鲜配制的0.06% DMSO或15 µM IWR-1处理液。于次日消融RPE。受精后第五天，确定未消融和已消融的六孔板所需的药理学处理组及溶剂对照组的处理体积，并将适量体积的不含PTU的新鲜系统水或10毫摩尔浓度的MTZ溶液分装至锥形管中。按照先前方法，将IWR-1和DMSO储备液分别加入对应的锥形管中。通过涡旋充分混匀，并目视确认化合物完全溶解。从指定的未消融和已消融的六孔板中去除含0.06% DMSO和15 µM IWR-1的1.5X PTU预处理液。更换为不含PTU和MTZ溶液的相应新鲜系统水。在恰好24小时后，从含10毫摩尔MTZ的溶液中去除0.06% DMSO和15微摩尔IWR-1处理，并用不含PTU的新鲜系统水重新添加上述处理。在未消融的六孔板中，使用不含PTU的新鲜系统水补充0.06% DMSO和15微摩尔IWR-1处理。在基因消融后的幼虫维持期间，利用体视显微镜的透射光照明监测消融的成功率和消融范围。使用 Fiji 生成视网膜色素上皮（RPE）感兴趣区域（ROI）时，打开一个 8 位 TIFF 图像，通过选择“图像”、“变换”、“水平翻转”来调整图像方向，使背侧朝上、远端朝左。对于最后一步操作，请根据该图像所需的方向性选择最合适的选项。通过选择“分析”、“工具”、“ROI 管理器”来启动 ROI 管理器。使用图像，缩放并切换 DAPI 和明场通道。为提高效率，请使用键盘快捷键。确定 RPE 顶侧与外界膜尖端相邻的位置，并将此解剖标志作为 ROI 的起始点。使用 Fiji 工具栏中的多边形选择工具，结合 DAPI 和明场图像通道以及图像缩放功能，确定 RPE 的顶端和基底边界，创建 RPE 感兴趣区域（ROI）。将 ROI 的背侧和腹侧末端处理成尖锐的点状，而不是钝化或圆化。在 ROI 管理器中点击“add”按钮以添加该 ROI。在 ROI 管理器中选择“更多”并保存，以保存 ROI 文件。双击 rpegen.m 文件，即可在编辑器窗格中打开。在 rpegen.m 文件的用户自定义变量部分，输入包含 roi 文件的文件夹、tiff 图像文件的文件夹以及输出文件保存位置的目录路径。输入要导出的 mat 文件的组名，以及 TIFF 图像堆栈中明场通道的位置。通过点击 MATLAB 顶部编辑器菜单中的运行按钮来执行脚本。保存 MAT 文件后，将为每幅图像生成一个包含三个面板的图形，并同时以 PDF 格式保存至输出目录。请等待这些质量控制 PDF 文件保存至输出文件夹，且最后一个图形消失后再进行后续操作。打开各个 PDF 文件，并核对所有 ROI 是否与明场图像一致。双击 rpegen_permplot.m 文件，在新的编辑器标签页中打开。在“单用户定义变量”部分，输入运行 rpegen.m 脚本后生成的 MAT 文件所在输出文件夹的目录路径。输入每个要加载的 MAT 文件名。通过点击编辑器菜单中的运行节按钮来执行此部分脚本。在第二节中，在数据A和数据B变量中输入用于统计比较的两个组的名称，并在reps变量中指定置换模拟重复的次数。本演示仅使用了2,000次重复，以减少处理时间。通过点击编辑器菜单中的运行节按钮来执行此部分脚本。使用运行节按钮分别独立运行热图图形、分组结果和 P 值部分。受精后五天幼虫的整体装片损伤显示，在进行基因消融筛选时，视网膜色素上皮（RPE）中出现强烈的转基因表达。未消融的受精后六天幼鱼的横切冷冻切片显示，转基因表达局限于成熟的视网膜色素上皮（RPE）细胞，且最强表达局限于RPE中央的2/3区域。箭头指示顶端微绒毛。消融后一天损伤幼鱼的横切冷冻切片显示eGFP阳性细胞形态遭到破坏。箭头指示固缩的细胞核。未消融的受精后七天幼鱼整体装片显示，视网膜色素上皮（RPE）在整个眼部均存在色素沉着；而损伤后两天的消融幼鱼则显示中央RPE区域的色素缺失。利用RpEGEN生成的图谱显示，在RPE全长范围内，未消融的受精后九天DMSO组与IWR-1组之间具有相似性。结果显示，在损伤后第四天，经消融处理的DMSO组和IWR-1组整体像素强度较轻，其中IWR-1处理组的消融区域显得最亮，与其他任何处理组相比均更为明显。在比较经消融处理并接受IWR-1处理的幼鱼与经消融处理的DMSO对照组幼鱼时，中央视网膜色素上皮（RPE）色素沉着的差异具有显著性。利用这种斑马鱼消融模型，我们已能够鉴定出多个对RPE再生起关键调控作用的分子信号通路，例如本文中所展示的Wnt信号通路。

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