检测白纹伊蚊细胞系中的沃尔巴克氏体菌株 wAlbB

该协议有助于验证细胞中沃尔巴克氏体的存在，这是理解沃尔巴克氏体与其宿主之间相互作用的基础。该方案采用4种方法成功检测细胞内沃尔巴克氏体感染，证实并提高了沃尔巴克氏体感染细胞的检测准确率。现代病原生物学与特征重点实验室研究生肖秋秋将演示该程序。

首先使用光学显微镜以100倍放大率观察未染色的Aa23和Aa23-T细胞。将细胞培养五到七天，使每个烧瓶达到70%至80%的汇合度。使用移液管将1 mL培养基转移到微量离心管中。

在100 RCF下离心五分钟以收获细胞。除去上清液并将所得细胞沉淀储存在零下20摄氏度。将细胞培养五到七天，以达到每个烧瓶90至100%的汇合度。

将沉淀重悬于0.40 mL PBS中，并将该溶液的50微升转移到微量离心管中。加入5微升20mg / mL蛋白酶K，并在55摄氏度下孵育一小时。然后将试管在99摄氏度下孵育15分钟，以获得粗DNA并将其储存在零下20摄氏度。

要进行PCR，请制备20微升的总反应混合物，并按照文本手稿中所述设置PCR条件。使用凝胶成像仪检测1%琼脂糖凝胶上的DNA。在实时荧光定量PCR系统中使用TB Green进行定量PCR扩增，并记录每个反应的结果。

分析总反应体积为20微升的DNA，并按照文本手稿中所述设置定量PCR条件。根据建立的标准曲线计算细胞中的WSP和RPS6基因拷贝数。然后通过 wsp/RPS6 的拷贝数计算沃尔巴克氏体相对密度。

使用独立的样本 t 检验分析数据。向细胞沉淀中加入200微升裂解缓冲液，并在冰上孵育30分钟。在4摄氏度下以12， 000 RCF离心裂解物10分钟，然后吸出上清液。

按照制造商的说明，使用BCA蛋白测定试剂盒分析上清液的wsp浓度。在15%SDS-PAGE凝胶上加载等量的蛋白质。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶阻断膜两小时。

然后用TBST洗涤膜三次。将膜在4摄氏度下用100微升的抗wsp多克隆抗体孵育过夜，该抗体是用5%脱脂牛奶稀释一抗fsp多克隆抗体。用TBST洗涤一抗三次。

向膜中加入100微升辣根过氧化物酶偶联的二抗，并在室温下在振荡器上孵育一小时。用TBST洗涤膜三次，并在化学发光检测试剂盒中以一比一的比例混合20微升溶液A和20微升溶液B。将整个膜同时浸入发光溶液中，并使用多功能成像系统观察信号。

在激光共聚焦培养皿上，在5%大气二氧化碳下，在28摄氏度下孵育Aa23和Aa23-T细胞三到四天。当细胞达到60%至70%汇合度时，用PBS洗涤细胞三次。将细胞固定在一毫升4%多聚甲醛中，在四摄氏度下20分钟。

使用PBST洗涤固定细胞五分钟，并用PBS重新洗涤细胞两次。将培养皿放入一毫升3%牛血清白蛋白中，在37摄氏度下孵育一小时。向载玻片中加入100微升小鼠抗wsp多克隆抗体和小鼠血清，并在4摄氏度的湿箱中孵育过夜。

从湿盒中取出培养皿，并将其恢复到室温。用PBS清洗它们三次，然后取出PBS。保护以下程序免受光线照射。

将培养皿与100微升Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠抗体在37摄氏度下孵育30分钟。将样品培养皿与在PBS中稀释至10微克/毫升的50微升DAPI在37摄氏度下孵育五分钟，然后用PBS洗涤三次。在共聚焦显微镜下观察免疫染色。

在检测沃尔巴克氏体之前，在光学显微镜下观察Aa23和Aa23-T细胞以确定两种细胞系之间的形态差异。Aa23和AA23-T细胞至少具有两种细胞形态，但两种细胞类型之间没有观察到明显的形态差异。使用诊断引物81F / 691R，在Aa23细胞中检测到沃尔巴克氏体wsp基因的阳性扩增，但在Aa23-T细胞中未检测到。

对细胞系中沃尔巴克氏体密度的分析显示，Aa23细胞的wsp/rps6比值为2.4，但Aa23-T细胞中没有沃尔巴克氏体。蛋白质提取物的蛋白质印迹分析显示Aa23具有较强的wsp信号，但Aa23-T未检测到信号。间接免疫荧光测定在Aa23细胞中检测到wsp蛋白，而在Aa23-T细胞中仅检测到DAPI染色的DNA。

确保将培养瓶在28摄氏度的5%大气二氧化碳下孵育五到七天。该过程可以通过电子显微镜进行，其中需要特别注意样品制备和切片。本研究采用的四种实验方法证实了沃尔巴克氏体感染在细胞中的检测准确性，也适用于其他类型的细胞和组织。