Name: 检测白纹伊蚊细胞系中的沃尔巴克氏体菌株 wAlbB (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用四种互补方法在白纹伊蚊细胞系中检测细胞内沃尔巴克氏体wAlbB菌株。该方法结合PCR、Western blot和免疫荧光技术，可显著提高感染检测准确性，适用于微生物学与细胞生物学研究。

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感谢来自明尼苏达大学的 Xin-Ru Wang 博士提供的深刻建议与指导。本工作由国家自然科学基金（编号：81760374）资助。

1. 材料与试剂
<ol>
	<li>使用无热原的溶液和培养基进行细胞培养（参见材料表）。</li>
	<li>使用超纯水配制所有溶液。</li>
	<li>选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时需谨慎，并遵循批次验证流程。 
	注意：由于FBS批次会定期更换，本实验方案中无法提供相应的目录号和批次号。</li>
	<li>选择源自A. albopictus卵的Aa23细胞株，对应无Wolbachia的Aa23-T。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>用含有10%胎牛血清的Schneider's培养基4 mL准备25 cm2细胞培养瓶。</li>
	<li>将培养瓶在28 °C、5% CO2的环境中孵育5至7天7,24。</li>
	<li>在100倍放大下通过光学显微镜观察培养瓶中未经染色的Aa23和Aa23-T细胞（图1）。</li>
</ol>
3. DNA 提取
<ol>
	<li>将细胞培养 5-7 天，直至每瓶细胞汇合度达到 70-80%（步骤 2）。通过移液枪吸取 1 mL 重悬的培养基，于微型离心机中以 100 × g 离心 5 分钟，收集细胞。</li>
	<li>通过抽吸去除上清液，并将所得细胞沉淀在 -20 °C 下保存。</li>
	<li>将沉淀重悬于 0.40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，取 50 µL 溶液加入微型离心管，加入 5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），在 55 °C 下孵育 1 小时。最后，将这些离心管在 99 °C 下加热 15 分钟以获得粗制 DNA，并在 -20 °C 下保存。</li>
</ol>
4. 检测 Wolbachia 核酸
<ol>
	<li>PCR 分析
	<ol>
		<li>在总体积为 20 µL 的反应体系中进行 PCR，其中包含 8 µL ddH2O、10 µL Taq 聚合酶（见材料表）、1 µL DNA 模板（来自步骤 3）以及 0.5 µL 正向和反向引物（10 µM）：wsp81F（5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3'）和 wsp691R（5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3'）25。</li>
		<li>采用以下 PCR 条件：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 35 个循环的 94 °C 变性、55 °C 退火和 72 °C 延伸；最后在 72 °C 下终延伸 7 分钟。</li>
		<li>使用凝胶成像系统在 1% 琼脂糖凝胶（PBS 中含 1% w/v 琼脂糖）上检测 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qPCR 分析
	<ol>
		<li>使用 wsp 引物 183F（5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3'）和 QBrevR（5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3'）22，对提取的 DNA（步骤 3）中的三个生物学重复（n = 6）进行 Wolbachia 基因组拷贝数分析，并以核糖体蛋白 S6（RPS6）的正向和反向引物（分别为 5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' 和 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3'）3 进行归一化处理。</li>
		<li>构建 wAlbB 和 RPS6 的标准曲线。
		<ol>
			<li>从含有 wsp 和 rps6 基因片段的 PMD-18T（一种用于高效克隆 PCR 产物的特殊载体，即 TA 克隆）重组质粒（补充文件）中提取 DNA，测定质粒 DNA 浓度（见材料表）。</li>
			<li>使用公式（1）将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数浓度。 
			质粒拷贝数 = <img alt="DNA 定量方程；质粒浓度转分子数公式；用于教学" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （1）</li>
			<li>用超纯水将质粒拷贝数稀释至 101 到 108，每个浓度梯度设置 3 个重复。</li>
			<li>使用 TB Green 和实时 PCR 系统（见材料表）进行 qPCR 扩增，记录每次反应的结果。使用 Ct 值建立标准曲线。qPCR 反应总体积为 20 µL，包含 7 µL ddH2O、10.4 µL TB Green（见材料表）、1 µL DNA 模板（来自步骤 3）以及 0.8 µL 正向和反向引物（10 µM）。反应条件如下：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环的 95 °C 变性 10 秒和 60 °C 退火 35 秒。</li>
			<li>根据建立的标准曲线计算细胞中 WSP 和 RPS6 基因的拷贝数，并通过 wsp/RPS6 拷贝数比值计算 Wolbachia 的相对密度。使用独立样本 t-检验分析数据。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wolbachia 蛋白的 Western 印迹分析
	<ol>
		<li>蛋白提取
		<ol>
			<li>从六孔板（来自步骤 2）中收集 2 × 107 个 Aa23 和 Aa23-T 细胞至微量离心管中，用 PBS 洗涤三次，4 °C 下以 100 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>用 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]、2 mM 焦磷酸钠、25 mM β-甘油磷酸、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4、0.5 µg/mL 亮抑酶肽）和 PMSF（终浓度 1 mM）制备 1 mL 裂解液。</li>
			<li>向细胞沉淀中加入 200 µL 裂解缓冲液，冰上孵育 30 分钟。4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照制造商说明书，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（见材料表）测定上清液中 wsp 蛋白的浓度。</li>
		<li>将等量蛋白上样至 15% SDS-PAGE 凝胶 [10% 蒸馏水；50%（30% Acr-Bis（29:1）、38% 1 M Tris，pH 8.8）；1%（10% SDS）、1%（10% 过硫酸铵）、0.04% TEMED]。</li>
		<li>将蛋白转移至硝酸纤维素膜，室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 2 小时26,27，然后用 TBST（1 L TBS 中含 1 mL Tween 20）洗涤三次（见材料表）。</li>
		<li>将膜与 100 µL 抗 wsp 多克隆抗体（实验室自制，见补充文件）在 4 °C 下孵育过夜，该抗体用 5% 脱脂牛奶按 1:12,000 比例稀释。</li>
		<li>用 TBST 洗涤一次抗体三次。</li>
		<li>将膜在摇床上与 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育 1 小时。</li>
		<li>用 TBST 洗涤膜三次，将化学发光检测试剂盒中的溶液 A（HRP 底物鲁米诺试剂）20 µL 与溶液 B（HRP 底物过氧化物试剂）20 µL 按 1:1 比例混合。同时将整张膜浸入发光液中，使用多功能成像系统观察信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wolbachia 蛋白的免疫荧光定位
	<ol>
		<li>将 5 × 105 个 Aa23 和 Aa23-T 细胞接种于底部厚度为 0.17 mm 的激光共聚焦培养皿中，在 28 °C、5% CO2 条件下孵育 3 至 4 天7,24。待细胞融合度达到 60%–70% 后，用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>在 4 °C 下用 1 mL 含 4%（w/v）多聚甲醛的 PBS 固定细胞 20 分钟。</li>
		<li>用 PBST（PBS 中含 0.2% v/v Triton X-100）洗涤固定后的细胞 5 分钟，再用 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>将载玻片置于 1 mL 含 3%（w/v）牛血清白蛋白的 PBS 中，37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>将载玻片置于湿盒（可保持湿度并防止液体蒸发）中，与 100 µL 小鼠抗 wsp 多克隆抗体（实验室自制）和小鼠血清（PBS 中 1:1,000 稀释）在 4 °C 下孵育过夜。</li>
		<li>从湿盒中取出载玻片并恢复至室温，用 PBS 洗涤三次并吸除 PBS。 
		注意：自步骤 4.4.7 起，所有操作均需避光。</li>
		<li>将载玻片与 100 µL Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠抗体（PBS 中 1:2,000 稀释）在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>将样本载玻片与 50 µL DAPI（用 PBS 稀释至 10 µg/mL，可强结合 DNA）在 37 °C 下孵育 5 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>在共聚焦显微镜下观察免疫染色结果。
		<ol>
			<li>打开电源和激光器。</li>
			<li>打开显微镜的普通灯和汞灯。</li>
			<li>启动系统并运行操作软件。在样本载玻片上滴加一滴杉木油，将载玻片置于显微镜载物台上，并移动载物台至合适位置。</li>
			<li>在软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，通过倒置显微镜观察样本并调焦。</li>
			<li>使用手动控制面板选择绿色和蓝色荧光，在 100 倍放大倍数下拍摄荧光图像。</li>
			<li>关闭汞灯观察按钮，开始采集图像。</li>
			<li>为确保良好的图像质量，先以扫描尺寸（512 像素 × 512 像素）进行预扫描。调整扫描尺寸以获得清晰图像（1,024 像素 × 1,024 像素）。</li>
			<li>若背景噪声过高，进行降噪处理。</li>
			<li>停止扫描并保存图像。</li>
			<li>关闭汞灯和激光器。</li>
			<li>用 75% 酒精擦拭物镜，并将物镜降至最低位置。</li>
			<li>关闭快门和显微镜电源。</li>
			<li>待仪器冷却后，盖上防尘罩。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Patholology%22%5BJournal%5D)">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li>
<li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biologial+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li>
<li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li>
<li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li>
<li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evoution%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li>
<li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li>
<li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+Developmental+Biology+-+Animals%22%5BJournal%5D)">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li>
<li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+species+are+infected+with+Wolbachia%3F-A+statistical+analysis+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li>
<li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%3A+master+manipulators+of+invertebrate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li>
<li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li>
<li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neill%2C+SL+%22Influential+passengers%3A+inherited+microorganisms+and+arthropod+reproduction%22">Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction</a>. , Oxford University Press. (1997).</li>
<li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+insecticides%3A+new+thinking+on+an+ancient+problem%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li>
<li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li>
<li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li>
<li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).</li>
<li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).</li>
<li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue%2C+Chikungunya%2C+and+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li>
<li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).</li>
<li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase%2C+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li>
<li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li>
<li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).</li>
<li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).</li>
<li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Royal+Society+Publishing.+Proceedings+B%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li>
<li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li>
<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

检测细胞内Wolbachia感染对于研究Wolbachia与宿主的相互作用以及确认将新菌株成功转染至细胞至关重要。在本方案中，采用了四种方法，在核酸和蛋白质水平上成功检测了细胞内Wolbachia感染。这四种实验方法相互验证，提高了Wolbachia细胞感染检测的准确性。
采用 PCR 在核酸水平上检测细胞中 Wolbachia 感染的存在。然而，由于 PCR 无法定量感染水平28,29，因此使用 qPCR 对 DNA 拷贝密度进行定量28,30。由于 PCR 方法的准确性可能受到扩增效率低和假阳性结果的影响，因此确保 DNA 的高质量尤为重要，特别是在 qPCR 检测中，试剂和模板必须置于冰上以防止变性，并应按照标准方法进行操作。扩增效率低通常由反应体系中试剂...

白纹伊蚊Aedes albopictus（Skuse）（双翅目：蚊科）是登革病毒（DENV）在亚洲及其他地区的重要传播媒介1，也是胞内共生菌Wolbachia（wAlbA和wAlbB）的天然宿主，这两种细菌广泛分布于其生殖系和体组织中2,3。源自A. albopictus胚胎的Aa23细胞系&#160;包含至少两种形态不同的细胞类型，均可支持感染4，并可通过抗生素处理清除其原有的Wolbachia感染（Aa23-T）。由于Aa23细胞系仅保留wAlbB，因此是研究宿主-内共生菌相互作用的有用模型4,5,6。
Wolbachia 通过母系遗传，估计感染了 65% 的昆虫物种8,9 和 28% 的蚊子物种10。它可感染多种组织，并与宿主形成密切的共生关系，通常通过操控宿主生殖系统诱导胞质不相容性（CI）11，进而实现种群替换12,13。此类宿主反应已在自然种群的 Drosophila simulans14 以及实验室笼养和田间试验中的 A. aegypti15 中被观察到。Wolbachia 引发的重要非生殖性调控表现为诱导宿主对多种病原体产生抗性，包括登革病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）和西尼罗病毒（WNV）16,17，其机制可能涉及共生菌增强的先天免疫系统18,19、Wolbachia 与病毒之间对宿主必需资源的竞争20，以及对宿主抗病毒防御通路的调控21。
本方案已开发用于研究这些潜在机制 Wolbachia诱导的宿主抗病毒反应。它采用四种细胞内检测方法 Wolbachia Aa23细胞的感染。这些方法为细胞内研究提供了坚实的理论基础 Wolbachia 感染其他宿主物种。第一种方法为PCR——一种强大的技术，可对DNA的特定区域进行酶促扩增，而无需使用传统的克隆程序——用于检测 Wolbachia DNA 并确定其存在/缺失情况 Wolbachia 感染22第二种方法测量 Wolbachia 使用定量PCR（qPCR）检测和测量每个PCR循环中产生的产物，其产物量与PCR前模板量成正比，从而实现DNA拷贝数密度的准确定量23. 第三种方法检测细胞内是否存在 Wolbachia 蛋白质，使用蛋白质印迹法（Western blot）——这是一种通过结合电泳的高分离能力、抗体的特异性以及显色酶促反应的灵敏性，来检测复杂混合物中特定蛋白质的最强大工具之一。最后一种方法是免疫荧光检测（IFA），该方法结合了免疫学、生物化学和显微镜技术，用于检测 Wolbachia 表面蛋白（wsp）通过抗原-抗体反应以确认细胞摄取 Wolbachia 并确定其细胞定位。
本文描述了上述四种用于验证细胞中是否存在Wolbachia的方法，可用于检测外源性Wolbachia是否成功转染以及细胞内的Wolbachia是否已被清除。在确定细胞中是否存在Wolbachia后，可进行多种不同类型的分析，包括基因组学、蛋白质组学或代谢组学。本方案以Aa23细胞为例演示Wolbachia的检测，但也适用于其他细胞。

<table><tbody><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;inSituX 平台&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铈掺杂钇铝石榴石</td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG 单晶基片</td></tr><tr><td>芯片夹具</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>控制软件</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>A型低粘度 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX 平台</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红外光源&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>带玻璃透镜的 LED，1085 nm，5 mW，TO-18</td></tr><tr><td>外环&amp;nbsp;</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泵浦激光器&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm，400 mW，&amp;Oslash;9 mm，E 引脚编码，激光二极管</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡环</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>用于 &amp;Oslash;1&quot; 镜筒和镜座的 SM1 卡环</td></tr><tr><td>无籽石英晶体</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>直径 25.4 mm，Z 切，厚度 0.05 mm，双面抛光，-X 轴方向偏移 8 mm</td></tr><tr><td>垫片</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X 射线光束挡板</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

检测 wolbachia walbb 菌株在 白纹伊蚊 细胞系

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

作为一种母系传播的内共生菌，Wolbachia 感染了大部分昆虫种群。近期研究报道了利用转染 Wolbachia 的蚊子成功调控RNA病毒传播的成果。控制病毒的关键策略包括通过胞质不相容性调控宿主繁殖，以及通过免疫预激活和竞争宿主资源来抑制病毒转录。然而，转染 Wolbachia 的蚊子对病毒感染应答的潜在机制仍不清楚。本文提供了一种在体外（in vitro）水平上，于白纹伊蚊（Aedes albopictus，双翅目：蚊科）Aa23细胞中从核酸和蛋白质层面鉴定 Wolbachia 感染的实验方案，以增进对 Wolbachia 与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过联合使用聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR、蛋白质印迹（western blot）和免疫学分析方法，建立了一种比单一方法更准确的标准形态学检测流程，用于鉴定 Wolbachia 感染细胞。该方法也可应用于其他昆虫分类群中 Wolbachia 感染的检测。

之前 Wolbachia 检测到后，在光学显微镜下观察 Aa23 和 Aa23-T 细胞，以确定两种细胞系之间是否存在形态学差异。Aa23 和 Aa23-T 细胞均表现出至少两种细胞形态，但两种细胞类型之间无明显形态学差异。 (图1)在此，使用 Aa23 细胞作为模型系统进行检测 Wolbachia 使用四种方法进行感染检测。阳性扩增的 Wolbachiawsp 使用诊断性引物检测基因 81F/691R 在Aa23细胞（泳道1和2）中是可能的，但在Aa23-T细胞（泳道3和4）中则不可能 (图 2A)分析 Wolbachia 使用qPCR检测细胞系中的密度显示 wsp/rps6 Aa23细胞中比值为2.4，但无 Wolbachia 在 Aa23-T 细胞中（图2B）。对...

采用四种方法检测细胞内 Wolbachia，二者相互补充，提高了检测的准确性 Wolbachia 感染 白纹伊蚊衍生的 Aa23 和 Aa23-T&#160;治愈天然 Wolbachia 使用抗生素治疗感染。

检测 Wolbachia wAlbB 菌株在 白纹伊蚊 细胞系

作为一种由母体携带的内共生菌，沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染了大部分昆虫种群。近期研究报道了成功调控……

本方案有助于验证细胞中沃尔巴克氏体的存在，这是理解沃尔巴克氏体与其宿主之间相互作用的基础。在本方案中，采用了四种方法成功检测了细胞内沃尔巴克氏体的感染情况，相互印证并提高了沃尔巴克氏体感染检测的准确性。本实验操作将由现代病原生物学与特征重点实验室的研究生肖秋秋进行演示。使用光学显微镜在100倍放大倍数下观察未染色的Aa23和Aa23-T细胞。将细胞培养5至7天，使每瓶细胞达到70%至80%的融合度。用移液器将1 mL培养基转移至微量离心管中。在100 RCF下离心五分钟以收集细胞。弃去上清液，将所得的细胞沉淀在-20摄氏度下保存。每瓶培养细胞五至七天，使其达到90%至100%融合度。将沉淀重悬于 0.40 mL PBS 中，取 50 微升该溶液转移至微量离心管中。加入 5 微升 20 mg/mL 蛋白酶 K，55 °C 孵育 1 小时。然后将离心管置于 99 °C 孵育 15 分钟，以获得粗制 DNA，并于 -20 °C 保存。进行PCR时，配制总体积为20微升的反应混合液，并按照文稿中所述设置PCR反应条件。使用凝胶成像系统在1%琼脂糖凝胶上检测DNA。在实时PCR系统中使用TB Green进行定量PCR扩增，并记录每次反应的结果。在总体积为 20 微升的反应体系中分析 DNA，并按照文稿中描述的条件设置定量 PCR 程序。根据已建立的标准曲线计算细胞中 WSP 和 RPS6 基因的拷贝数。然后通过 wsp/RPS6 的拷贝数比值计算沃尔巴克氏体（Wolbachia）的相对密度。使用独立样本 t 检验分析数据。向细胞沉淀中加入 200 µL 裂解缓冲液，冰上孵育 30 分钟。在 4°C 条件下以 12,000 ×g 离心裂解物 10 分钟，然后吸除上清液。根据制造商说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒分析上清液中的wsp浓度。将等量的蛋白质上样至15% SDS-PAGE凝胶中。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后用TBST洗涤膜三次。将膜与100微升抗wsp多克隆抗体在4摄氏度孵育过夜，该抗体通过将一抗用5%脱脂牛奶稀释制备而成。用TBST洗涤一抗三次。向膜中加入 100 微升辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下于摇床上孵育 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次，将化学发光检测试剂盒中的溶液 A 和溶液 B 各取 20 微升按 1:1 的比例混合。将整张膜同时浸入发光液中，使用多功能成像系统观察信号。在激光共聚焦培养皿中，将 Aa23 和 Aa23-T 细胞在 28 摄氏度、5% 大气二氧化碳条件下培养三至四天。当细胞融合度达到 60% 至 70% 时，用 PBS 洗涤细胞三次。在 4 摄氏度条件下，用 1 mL 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。用PBST清洗固定后的细胞5分钟，并用PBS再重复清洗细胞两次。将培养皿置于37摄氏度条件下，加入1 mL 3%牛血清白蛋白孵育1小时。向切片中加入100 µL小鼠抗wsp多克隆抗体和小鼠血清，在4摄氏度湿盒中孵育过夜。从湿盒中取出培养皿，并恢复至室温。用 PBS 洗涤三次，弃去 PBS。后续操作需避光进行。将100微升Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体加入培养皿中，在37摄氏度孵育30分钟。将样品培养皿中加入50微升用PBS稀释至10微克/毫升的DAPI溶液，在37摄氏度孵育5分钟，然后用PBS洗涤三次。在共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色结果。在检测沃尔巴克氏体（Wolbachia）之前，使用光学显微镜观察Aa23和Aa23-T细胞，以确定两种细胞系之间的形态学差异。Aa23和Aa23-T细胞均至少存在两种细胞形态，但两种细胞类型之间未观察到明显的形态学差异。使用诊断性引物81F/691R，可在Aa23细胞中检测到沃尔巴克氏体wsp基因的阳性扩增产物，而在Aa23-T细胞中未检测到。细胞系中沃尔巴克氏体（Wolbachia）密度分析显示，Aa23细胞的wsp/rps6比值为2.4，而Aa23-T细胞中未检测到沃尔巴克氏体。对蛋白提取物进行的蛋白质印迹分析显示，Aa23细胞有强烈的wsp信号，而Aa23-T细胞未检测到信号。间接免疫荧光实验在Aa23细胞中检测到wsp蛋白，而在Aa23-T细胞中仅观察到DAPI染色的DNA。确保将培养瓶置于28摄氏度、5%大气二氧化碳条件下孵育5至7天。此操作之后可进行电子显微镜检测，其中需特别注意样品制备与切片过程。本研究中采用的四种实验方法验证了沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染在细胞中检测的准确性，该方法同样适用于其他类型的细胞和组织。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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卵寄生蜂松毛虫赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi Matsumura）中的RNA干扰

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蚊子卵巢、中肠和唾液腺的解剖以进行器官水平的微生物组分析

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从单克隆培养物的生成 Wolbachia-感染的 黑腹果蝇 JW18 细胞系

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检测 Wolbachia wAlbB 菌株在白纹伊蚊细胞系

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