Name: 高分辨率中子光谱研究蛋白质和水合水的皮秒纳秒动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 探索中子背散射光谱技术，用于研究溶菌酶和tau蛋白等淀粉样蛋白的聚集动力学及其水合水动态。该方法为理解神经退行性疾病的分子机制提供了无损、无标记的研究手段。

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作者感谢德国加兴海因茨·迈尔-莱布尼茨中心（Heinz Maier-Leibnitz Zentrum）于利希中子科学中心（Jülich Centre for Neutron Science）的 Michaela Zamponi，其参与了在 SPHERES 仪器上进行的部分中子散射实验。本研究受益于欧盟资助合同 HPRI-2001-50065 和 RII3-CT-2003-505925 支持下的氘化实验室（Deuteration Laboratory, DLAB）联盟的相关工作，同时也受益于英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）资助、在劳厄-朗之万研究所（Institut Laue Langevin）与欧洲分子生物学实验室（EMBL）联合 DLAB 框架下开展的研究（资助编号 GR/R99393/01 和 EP/C015452/1）。特此致谢欧洲委员会第七框架计划下“加强欧洲研究区，研究基础设施”重点行动所提供的支持 [合同编号 226507 (NMI3)]。Kevin Pounot 和 Christian Beck 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF，资助编号 05K19VTB）对其博士后奖学金的资助。

1. 准备用于液态蛋白质的氘代缓冲液
<ol>
	<li>将缓冲液的所有组分溶解于纯 D2O 中。</li>
	<li>若 pH 电极是在 H2O 中校准的，则使用 NaOD 或 DCl34 根据公式 pD = pH + 0.4 调整 pD。 
	注意：使用 D2O 而非 H2O 可能会影响蛋白质的溶解度，可能需要调整缓冲条件（例如，通过轻微改变盐浓度）。</li>
</ol>
2. 准备用 H2O 水合的全氘代蛋白质粉末
<ol>
	<li>准备样品架。
	<ol>
		<li>用清水和乙醇彻底清洗平底铝制样品架及其铟丝密封圈和螺丝，然后使其完全干燥。 
		注意：使用平底样品架可使粉末均匀分布在表面。粉末的量应足够多，能够被样品架壁固定住，在将样品架垂直放置时不会掉落。</li>
		<li>使用精密天平分别称量样品架的各个部件——底部、盖子和铟丝。</li>
		<li>将1 mm厚的铟丝密封圈放入样品架底部的凹槽中，两端连接处需留有轻微重叠（图2A）。</li>
		<li>取适量冻干蛋白（通常约为100 mg蛋白），使其均匀覆盖样品架底部的内表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对蛋白粉末进行水合。
	<ol>
		<li>将样品架放入干燥器中，并在干燥器内放置一个含有P2O5粉末的培养皿，持续24小时，以彻底干燥蛋白粉末35（图2B）。称量含有铟丝密封圈和干燥粉末的样品架底部，得到质量mdry。 
		注意：P2O5粉末具有强腐蚀性。</li>
		<li>从干燥器中移除P2O5，换入一个装有D2O的培养皿。定期监测粉末质量，以检查水合程度h = mhyd / mdry，其中mhyd和mdry分别为水合后粉末和干燥粉末的质量。 
		注意：对于胰岛素等高度疏水的蛋白，可能需要提高干燥器内的温度，以增加水蒸气压，从而达到目标水合水平h。</li>
		<li>重复步骤2.2.1和2.2.2至少三次，以确保所有可交换的氢原子充分被氘代。 
		注意：也可采用反复冻干并溶于纯D2O的方法，以提高氢/氘交换效率，前提是该过程不会影响蛋白结构。</li>
		<li>将粉末水合至略高于目标水平，然后将带有铟丝和水合粉末的样品架底部保留在精密天平上，等待其质量缓慢下降至目标值，以获得所需的h值（对于中等大小的球状蛋白，通常h为0.2–0.4，对应覆盖一层完整的水合层）。</li>
		<li>迅速将盖子盖上，并先用四个螺丝固定样品架，以终止水蒸气交换（补充图S3A）。</li>
		<li>安装并拧紧所有剩余螺丝，直至样品架底部与盖子之间无可见缝隙（补充图S3B）。</li>
		<li>称量密封后的样品架，以检查中子散射实验后是否存在因泄漏导致的水合损失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 进行非相干中子散射实验
<ol>
	<li>在指定的机时前几周，与本地联系人讨论并再次确认实验所需的仪器配置。</li>
	<li>制备液态样品。
	<ol>
		<li>将蛋白质溶解于氘代缓冲液中。</li>
		<li>使用水确定应加入样品架的合适液体体积（确保关闭样品架时液体不会溢出）； 图2C). 
		注意：以下步骤（3.3 和 3.4）描述了在 ILL 的 NBS 谱仪 IN16B 上进行的实验8,9，使用冷冻炉作为样品环境。仪器控制系统因不同仪器而异，但工作原理保持相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>插入样品。
	<ol>
		<li>彻底干燥样品杆（图2D），并在处理任何材料前检查电离辐射剂量是否低于100 µSv/h（在ILL）。</li>
		<li>放置样品，检查其相对于光束中心是否居中补充图 S4），并将样品杆插入低温炉中（图 2D）。开启真空泵，使真空度达到低于10-3 条，并通过以下步骤重复三次以排空冷冻炉内的空气：向冷冻炉中充入氦气至大气压，再用真空泵抽走气体。 
		注意：若使用平面样品架，样品架应相对于入射中子束呈45°角放置。由于样品池对中子的吸收和散射，有效动量转移范围可能减小。可使用镉等强中子吸收材料遮蔽样品架的某些部分（如螺丝、较厚部位）。</li>
		<li>向低温炉中通入少量氦气，使压力约为0.05 bar。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集数据（例如，在 ILL 的 IN16B 上使用 NOMAD，假设用户在采集准弹性中子散射谱（QENS）前希望将样品温度稳定在 200 K，随后在以 0.5 K/min 的速率升温至 310 K 的过程中采集能量/固定窗口扫描（E/IFWS）数据，最后在 310 K 下采集 QENS 谱）。
	<ol>
		<li>使用 NOMAD，在 执行 标签，拖放一个 炉式低温恒温器 控制器在 发射台. 设置 温度 以 200 K. 使用 快速 模式和一个 超时 的 30 min 以便温度有足够时间稳定。点击 旋转箭头 在降温过程中于后台运行以采集数据。</li>
		<li>拖放 IN16多普勒设置 控制器，设置 速度分布曲线 至 精确速度 由...设定 最大ΔE，一个值为 0.00 µeV 和 128 个通道 以获得EFWS配置。</li>
		<li>拖放一个 计数 控制器，填充 字幕 字段名称应便于数据的识别，并进行设置 60 次重复 的 30 s 扫描 (补充图 S5A).</li>
		<li>拖放一个 IN16多普勒设置 控制器，设置 速度分布曲线 到 正弦 由...设定 速度 值为 4.5 m/s 和 2,048 个通道 以获得准弹性中子散射（QENS）配置。</li>
		<li>拖放一个 计数 控制器与 4 次 30 分钟扫描，重复 3 次 (补充图 S5B).</li>
		<li>对于温度梯度实验，拖放一个 炉冷恒温器 控制器，设置 温度 至 310 K，设定 斜坡 至 设定点 与 Δ = 0.05 K 以及 6 s. 使用一个 超时 的 220 分钟 (补充图 S6A).</li>
		<li>使用一个 for 循环 与 65 次重复. 内部插入一个 IN16Doppler设置 控制器，如步骤 3.4.2 所述，随后进行一次计数 30 s随后，插入 IN16多普勒设置，如前所述，但使用一种 能量偏移 的 1.5 µeV 和 1,024 个通道 随后进行一次计数 3 分钟 (补充图 S6B).</li>
		<li>为获得310 K下的最后一个QENS，拖放 IN16Doppler设置 以及 计数 分别按照步骤 3.4.4 和 3.4.5 中所述配置的控制器。</li>
		<li>按下 中子散射能够在无需标记（除氘标记外）且非破坏性的条件下，探测样品在宽广能量范围内的动力学行为。特别是中子背散射谱学技术，可同时记录多个散射角的散射信号，非常适合研究生物体系在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学过程。通过使用D2O，以及可能的氘化缓冲液组分，该方法能够监测液态蛋白质的质心扩散以及主链和侧链运动（内部分子动力学）。此外，通过使用全氘化蛋白质粉末并以H2O进行水合，可研究水合水的动力学行为。本文介绍了在法国劳厄-朗之万研究所（Institut Laue-Langevin, ILL）的IN16B仪器上研究蛋白质及水合水动力学所采用的实验流程。文中详细说明了溶液样品以及通过蒸气交换法制备的水合蛋白质粉末样品的制备方法。针对中子背散射谱仪可获得的不同类型数据集（准弹性谱或固定窗口扫描），描述了蛋白质和水合水动力学的数据分析流程。本文通过两个涉及淀粉样蛋白的研究实例展示了该方法的应用：溶菌酶聚集成微米尺度的球形聚集体（称为颗粒物）的过程，在IN16B所探测的空间与时间范围内表现为一步完成的过程，同时其内部分子动力学保持不变；此外，在全氘化蛋白质的水合粉末上研究了tau蛋白水合水的动力学，结果显示水分子的平移运动在淀粉样纤维形成过程中被激活。最后，本文讨论了该实验流程中的关键步骤，并评述了中子散射在动力学研究领域相对于其他实验生物物理方法所处的地位。 单击窗口底部的按钮（直角三角形图标）以运行脚本。 
		注意：每次实验都需要采集校准数据，即用于扣除或吸收校正的空样品池、用于在不同温度下建模背景的缓冲液单独测量数据，以及钒的测量（或等效地，样品在10 K或更低温度下的测量），以获得仪器的分辨率函数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析 - QENS
<ol>
	<li>使用 Python 软件 nPDyn v3.x 中的 'IN16B_QENS.process()' 方法导入数据集36 
	&gt;&gt;&gt;&gt; from nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS 
	 
	&gt;&gt;&gt; 样品 = IN16B_QENS( 
	...&lt;数据文件路径&gt; 
	... [detGroup=&lt;整数或XML格式的探测器分组文件 
	……格式&gt;] 
	... ).process() 
	 
	&gt;&gt;&gt; sample = sample.get_q_range(0.3, 1.8)</li>
	<li>根据 nPDyn 的文档（详见相关说明），可选择使用以下命令执行数据校正（可选）： 图3): 
	#假设已获取空样品池、钒和缓冲液的数据 
	# 已在名为 'empty_cell'、'vanadium' 的数据集中导入 
	# 和“缓冲液”，分别。 
	 
	# 用于带比例因子的空细胞减法 
	#（误差自动传递） 
	&gt;&gt;&gt; 样品 = 样品 - 0.95 × 空样品池 
	 
	# 用于使用 Paalman-Ping 系数进行校正 
	# （与上述示例互斥） 
	&gt;&gt;&gt; sample = sample.吸收校正(空样品池) 
	 
	# 用于归一化 
	&gt;&gt;&gt; 样本 = 样本用钒片进行归一化处理 
	 
	# 用于沿可观测轴进行数据分箱 
	# 可观测的是此处的聚集时间 
	&gt;&gt;&gt; 样本 = 样本.bin(3, 轴=0)</li>
	<li>拟合校准数据。可使用内置模型或用户自定义模型（参见 nPDyn 文档）对数据集（样品、空样品池、氘代缓冲液（如需要）和钒）进行拟合： 
	&gt;&gt;&gt; 来自 nPDyn.models.builtins 的导入（ 
	... 模型PVoigt， 
	……modelWater， 
	...modelCalibratedD2O, 
	... ) 
	 
	# 内置模型使用动量的列向量 
	# 转移 q 值 
	&gt;&gt;&gt; q = vanadium.q[:, None] 
	 
	# 使用伪沃伊特轮廓拟合钒峰 
	&gt;&gt;&gt; vanadium.fit(modelPVoigt(q))</li>
	<li>使用名为 'modelWater' 的内置水合水模型。该模型的表达式如公式 (4)17 
	<img alt="Scattering intensity equation; formula for neutron scattering data analysis; scientific notation." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 4"> (4) 
	其中 a0，ar，以及一个t 分别为弹性信号、旋转运动和平移运动相对贡献的标量；j1(qd) 是 lth 阶球形贝塞尔函数，其中 q 为动量转移；d 为水分子中的 O-H 距离；δ(ω) 为狄拉克δ函数，在此与 EISF 相乘；N 为所用球形贝塞尔函数的最高阶数（通常约为 5）； <img alt="Mathematical expression, L subscript 1 plus 1 gamma subscript r, in physics context." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 5"> 以及 <img alt="Stochastic process equation, Lyapunov function with Yt variable, mathematical formula." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq11.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 11"> 分别为洛伦兹旋转运动和扩散运动；b(q) 为平坦背景项。球贝塞尔函数给出了水分子各角动量态的相对贡献，N 的取值取决于动量转移 q 的范围。对于典型的中子背散射谱仪，取项数至 N = 4 即可几乎完全解释信号补充图 S7). 
	# 此处对水合水使用公式2 
	# 与分辨率函数的卷积及添加 
	# D2O 背景自动完成 
	# 提供的参数 
	&gt;&gt;&gt; sample.fit(modelWater(q), 
	... res=vanadium, 
	... bkgd=缓冲液, 
	... 体积分数_bkgd=0.95 
	... ) 
	注意：从严格意义上讲，旋转运动和平移运动的贡献应通过卷积方式进行处理。加和模型之所以成功，归因于蛋白质表面存在不同的水分子群体，以及可探测能量范围有限。</li>
	<li>使用以下方法绘制数据（图4): 
	&gt;&gt;&gt; from nPDyn.plot import plot 
	&gt;&gt;&gt; 绘制样本图</li>
</ol>
5. 数据分析——温度梯度、弹性固定窗口扫描（EFWS）
<ol>
	<li>采用与第4节类似的方法，通过最低温度（通常为10 K）下的信号对温度梯度数据进行归一化处理： 
	&gt;&gt;&gt; from nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS 
	 
	&gt;&gt;&gt; 样品 = IN16B_FWS( 
	... &lt;数据文件路径&gt;, 
	... detGroup=[detGroup=&lt;XML 格式的整数或探测器分组文件&gt;] 
	... ).process() 
	 
	# 使用可观测范围内前5个点进行归一化 
	# 轴，对应于温度 
	&gt;&gt;&gt; 样本 /= 样本[:5].均值(0) 
	 
	# 此处使用的动量转移 q 范围更小 
	# 因所用模型仅在低 q 值下有效 
	&gt;&gt;&gt; sample = sample.get_q_range(0.2, 0.8)</li>
	<li>使用简单的高斯模型开始，其宽度由所谓的均方位移（MSD）给出。使用以下命令构建并拟合该模型： 
	&gt;&gt;&gt; import numpy as np 
	&gt;&gt;&gt; from nPDyn.models import 参数, 模型, 组分 
	 
	# a 是一个缩放因子 
	&gt;&gt;&gt; params = 参数( 
	... a={'值': 1, '边界': (0, np.inf)}, 
	... msd={'值': 1, '范围': (0, np.inf)} 
	... ) 
	 
	&gt;&gt;&gt; model = Model(参数) 
	&gt;&gt;&gt; model.addComponent(Component( 
	… “高斯” 
	… lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6) 
	… )) 
	 
	&gt;&gt;&gt; sample.fit(模型, x=sample.q[:, None]) 
	 
	&gt;&gt;&gt; 绘制（样本） 
	注意：高斯近似在 q 值范围内始终成立2平均平方位移 &lt;&lt; 1，但更宽的动量转移范围可用于样品间的相对比较。已有超越高斯近似方法的更复杂模型被开发出来37,38,39.</li>
</ol>
6. 数据分析——弹性与非弹性固定窗口扫描（E/IFWS）
<ol>
	<li>与步骤4类似，导入数据集，但使用“IN16B_FWS”类： 
	&gt;&gt;&gt; from nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS 
	 
	&gt;&gt;&gt; 样本 = IN16B_FWS( 
	...&lt;数据文件路径&gt; 
	... [detGroup=&lt;XML格式的整数或探测器分组文件&gt;] 
	... ).process() 
	 
	&gt;&gt;&gt; sample = sample.get_q_range(0.3, 1.8)</li>
	<li>拟合校准数据与样品数据。
	<ol>
		<li>使用广义均方位移分析 E/IFWS 数据40 或将其视为粗粒化准弹性中子散射谱（在能量轴上仅有少量数据点）。当将E/IFWS视为粗粒化QENS时，可采用适用于QENS的模型对整个E/IFWS数据集进行一次性拟合（即对能量转移和动量转移进行全局拟合）。 
		注意：此处采用后一种方法——对 E/IFWS 数据使用 QENS 模型——并施加了质心扩散与蛋白质内部分子动力学随动量转移的变化关系。</li>
		<li>使用以下公式对液体中模型蛋白质的动力学进行建模：5)（nPDyn 中的 'modelProteinJumpDiff'）： 
		<img alt="Scattering equation with convolution operator, theoretical physics, mathematical formulation." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq06v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 6"> (5) 
		其中 R(q，ω）是分辨率函数；β 是每个动量转移 q 对应的独立标量； a0 是弹性非相干结构因子（EISF）； <img alt="Mathematical symbol of Lagrangian density, often used in field theory equations." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 7"> 一个洛伦兹函数，用于描述质心扩散，其半高宽由公式（6); <img alt="Lagrangian symbol for quantum field theory, representing mathematical equations and formulas." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq12.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 12"> 是一个包含质心扩散和遵循跳跃扩散模型贡献的洛伦兹函数14 考虑内部动力学（公式 (7); <img alt="Static equilibrium equation, ΣFx=0, symbol diagram for physics analysis." src="/files/ftp_upload/63664/63664eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 8"> 为D的拟合信号2O 按其在样品中的体积分数进行归一化。 
		γ = Dsq2  (6) 
		Ds 即为自扩散系数。 
		<img alt="diffusion coefficient formula; Γ=Diq²/(1+Diq²τ); mathematical expression; scientific analysis" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 9"> (7) 
		Di 内部动力学的表观扩散系数 τ 扩散运动的弛豫时间。 
		&gt;&gt;&gt; 来自 nPDyn.models.builtins 的导入（ 
		... modelPVoigt 
		... 模型蛋白质跳跃扩散， 
		...模型校准D2O, 
		... ) 
		 
		# 内置模型使用动量的列向量 
		# 转移 q 值 
		&gt;&gt;&gt; q = vanadium.q[:, None] 
		 
		# 使用伪Voigt谱型对钒进行拟合 
		&gt;&gt;&gt; vanadium.fit(modelPVoigt(q)) 
		 
		# 对于纯 D2O，采用具有校准线宽的模型 
		# 不同温度下的数据包含在 nPDyn 中 
		&gt;&gt;&gt; buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363)) 
		 
		# 此处，液体样品使用公式3 
		# 与分辨率函数的卷积及添加 
		# D2O 背景扣除将使用提供的参数自动完成 
		&gt;&gt;&gt; sample.fit(模型蛋白跳跃扩散(q), 
		……res=钒， 
		... bkgd=缓冲液, 
		... 体积分数_bkgd=0.95 
		... )</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下方法绘制拟合后的数据： 
	&gt;&gt;&gt; from nPDyn.plot import plot 
	&gt;&gt;&gt; 绘制样本图</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

中子谱学是唯一一种可在使用氘代的情况下，不受蛋白质大小或溶液复杂性限制，探测蛋白质样品在皮秒至纳秒时间尺度上系综平均动力学的方法6。具体而言，通过探测溶液中蛋白质组装体的自扩散行为，可明确测定此类组装体的流体动力学尺寸。然而，该方法通常受限于中子通量较低，这意味着需要较长的采集时间，并且在分配的束流时间内获得良好信噪比通常需要大量样品（通常为100 mg蛋白质）。
样品制备（实验方案步骤1和2）。对于液态样品，可使用的最低浓度约为50 mg/mL（浓度较低时也可使用，但会延长采集时间）。高蛋白浓度与较快的纤维化速率相关，这有助于在分配的束流时间内完成测量，但也可能影响聚集途径44。因此，必须结合原子力显微镜或电子显微镜等互补方法对样品进行充分表征。
在制备样品时，样品架的材料也是一个需要考虑的问题，因为铝合金容易发生腐蚀45。一种具有较好耐腐蚀性且中子...

中子是一种不带电且具有质量的粒子，多年来已成功用于从基础物理学到生物学等多个领域的样品探测1在生物学应用中，小角中子散射、非弹性中子散射、中子晶体学和中子反射测量被广泛使用2,3,4非弹性中子散射能够提供无需特定标记的、对动力学过程的系综平均测量, 且信号质量不依赖于分子大小或蛋白质5.&#160;可使用高度复杂的环境来测量目标蛋白，该环境可模拟细胞内介质，例如氘代细菌裂解物，甚至 体内3,6,7. 可采用不同的实验装置来研究动力学过程，即：i) 飞行时间法——可探测亚皮秒至皮秒量级的动力学；ii) 背散射法——可探测皮秒至纳秒量级的动力学；iii) 自旋回波法——可探测纳秒至数百纳秒量级的动力学。中子背散射利用布拉格定律 2d sin&#952; = n&#955;，其中 d 表示晶体中晶面之间的距离，&#160;&#952; 散射角，n 为散射级次，以及&#160;&#955; 波长。利用晶体将信号背散射至探测器，可实现较高的能量分辨率，通常约为 ~0.8 &#181;eV. 为了测量能量交换，可使用带有背散射晶体的多普勒驱动装置来定义和调节入射中子波长8,9,10 (图1，或者可以使用飞行时间装置，但会降低能量分辨率11.
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg" /> 
图 1：带有多普勒驱动器的中子背散射谱仪示意图。 入射束流首先到达相空间转换（PST）斩波器42，该装置可提高样品位置处的中子通量。随后，多普勒驱动器将中子束流反射至样品，并选择特定能量 E1 （图中以青色箭头表示）。中子随后被样品散射（不同能量以不同颜色箭头表示），而由 Si 111 晶体制成的分析器仅反射具有特定能量 E0 的中子（此处以红色箭头表示）。因此，通过探测器阵列上中子的探测位置可获得动量转移 q，而能量转移则由 E1 - E0 的差值得到。利用 PST 产生的中子脉冲的预期飞行时间，可排除直接散射至探测管的中子信号。缩写：PST = 相空间转换。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
对于背散射光谱学，来自富含氢质子的样品（如蛋白质）的信号主要来源于非相干散射，其散射强度 Sinc(q, ω) 由公式（1）给出12
<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;" /> （1）
其中，σinc 为所考虑元素的非相干散射截面，k' 为散射波矢的模，k 为入射波矢的模，q （= k - k'）为动量转移，rj(t) 为原子 j 在时间 t 时的位置矢量，&#160;ω 为入射中子与系统之间能量转移对应的频率。角括号表示系综平均。因此，非相干散射探测的是原子位置随时间变化的系综平均单粒子自关联，反映系统中所有原子及不同时间起点下的自动力学行为（系综平均）。散射函数是中间散射函数 I(q, t) 在时间上的傅里叶变换，而中间散射函数可视为由公式（2）给出的范霍夫关联函数在空间上的傅里叶变换：
<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;" /> （2）
其中，ρ(r,t) 表示在位置 r 和时间 t 找到一个原子的概率密度13。
对于费克型扩散过程，自扩散函数的结果（见公式（3））经过双重傅里叶变换后，得到一个散射函数，该函数为洛伦兹线型，其线宽由 γ = Dq2 给出。
<img alt="公式 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;" /> （3）
随后开发了更为复杂的模型，并被证明具有实用价值，例如Singwi和Sjölander提出的用于描述蛋白质内部ps-ns尺度动力学的跳跃扩散模型14，以及Sears提出的用于水合水的旋转模型15,16,17。
在中子背散射（NBS）仪器 IN16B 上8,9 在法国格勒诺布尔的ILL（补充图 S1），一种常用于蛋白质研究的设置是使用Si 111晶体作为分析器，并配备多普勒驱动装置以调节入射波长（补充图 S2A），从而获得约0.2的动量转移范围 &#197;-1 &#60; q &#60; ~2 &#197;-1 以及能量转移范围为 -30 &#181;eV &#60; <img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;" /> &#60; 30 &#181;eV- 对应于从几皮秒到几纳秒的时间尺度和几纳米的距离 &#197;此外，IN16B 提供了进行弹性与非弹性固定窗口扫描（E/IFWS）的可能性。10，包括在固定能量转移下进行数据采集。由于中子实验中的通量有限，E/IFWS 可以针对某一能量转移最大化通量，从而减少获得满意信噪比所需的数据采集时间。一种较新的选择是反冲散射与飞行时间谱仪（BATS）模式11，可实现多种能量转移的测量（例如，-150 &#181;eV &#60; <img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;" /> &#60; 150 &#181;eV），通量高于多普勒驱动，但代价是能量分辨率较低（补充图 S2B).
中子散射的一个重要特性是，氢的非相干散射截面&#160;σinc比氘高出约40倍，而对于生物样品中常见的其他元素则可忽略不计。因此，可通过使用氘代缓冲液来研究蛋白质在液态环境中的动力学行为；而粉末状态则可用于研究氢化蛋白质粉末在D2O水合条件下的蛋白质内部动力学，或全氘代蛋白质粉末在H2O水合条件下的水合水动力学。在液态体系中，中子背散射通常可同时探测蛋白质的质心自扩散（符合菲克定律的扩散）及其内部动力学。后者通常指主链和侧链的运动，可用所谓的跳跃扩散模型或其他模型进行描述3,18。在氢化蛋白质粉末中，蛋白质的扩散过程不存在，只需对内部动力学进行建模。对于水合水而言，水分子的平动和转动运动对动量转移q的依赖关系不同，因此可在数据分析过程中加以区分17。
本文通过研究一类能够去折叠、聚集形成由β折叠链堆叠而成的典型结构——即所谓的交叉-β结构19,20——并形成细长纤维的蛋白质，展示了中子背散射方法的应用。这种聚集过程被称为淀粉样蛋白聚集，因其在阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病中起核心作用而被广泛研究21,22。对淀粉样蛋白的研究还受到其潜在功能作用23,24 或其在新型生物材料开发中具有高度应用前景的推动25。尽管近年来取得了巨大进展21,26，淀粉样蛋白聚集的理化决定因素仍不明确，目前尚无普适性的淀粉样蛋白聚集理论。
淀粉样聚集意味着蛋白质结构和稳定性随时间发生变化，对其研究自然涉及与蛋白质构象稳定性、蛋白质功能及蛋白质能量景观相关的动力学过程27动力学通过最快运动的熵贡献与特定状态的稳定性直接相关28，而蛋白质功能可通过从亚皮秒（适用于光敏蛋白）等多种时间尺度上的运动得以维持29 用于毫秒级的结构域运动，可通过皮秒至纳秒级动力学过程实现30.
将介绍中子背散射谱学在淀粉样蛋白研究中的两个应用实例，一个用于研究液态下蛋白质的动力学，另一个用于研究水合粉末状态下水合水的动力学。第一个实例涉及溶菌酶聚集形成淀粉样纤维的过程 &#181;m 实时追踪的微米级球体（称为颗粒物）5，以及人源蛋白tau在天然状态和聚集状态下的水动力学比较31.
溶菌酶是一种参与免疫防御的酶，由129个氨基酸残基组成。在pD为10.5、温度为90 °C的氘代缓冲液中，溶菌酶可形成聚集体。通过中子散射实验，我们发现溶菌酶质心扩散系数随时间的变化遵循硫黄素T荧光信号的单指数动力学（硫黄素T是一种用于监测淀粉样蛋白交叉-β结构形成的荧光探针32），表明聚集体超结构和交叉-β结构的形成是通过同一速率的单步过程完成的。此外，在整个聚集过程中，蛋白质内部动力学保持不变，这可能归因于构象变化过快而无法在NBS仪器上观测到，或归因于蛋白质在聚集过程中内部能量未发生显著变化。
人类tau蛋白是一种内在无序蛋白（IDP），其所谓的2N4R亚型由441个氨基酸组成，在阿尔茨海默病中具有重要作用33。我们利用完全氘代的tau蛋白粉末进行中子背散射实验，发现纤维态下水合水的动力学增强，发生平移运动的水分子比例更高。该结果表明，水合水熵的增加可能驱动tau蛋白的淀粉样纤维化。

<table><tbody><tr><td>铝制样品架</td><td></td><td></td><td>无商业供应。可由仪器本地联系人提供，或根据本地联系人提供的技术图纸自行加工制造。</td></tr><tr><td>氯化氘，D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 35 wt. %，&amp;ge;99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;br/&gt; 543047</td><td></td></tr><tr><td>氧化氘（D，99.9%）</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-4DR-PK</td><td></td></tr><tr><td>道康宁高真空硅脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 96%，EMSURE Reag. Ph Eur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.5901</td><td></td></tr><tr><td>玻璃干燥器</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp; 75871-660</td><td></td></tr><tr><td>玻璃干燥器托盘，140 mm</td><td>VWR</td><td>89038-068</td><td></td></tr><tr><td>铟丝，直径 1.0 mm（0.04 in），Puratronic，99.999%</td><td>Alfa Aesar</td><td>00470.G1</td><td></td></tr><tr><td>来自鸡蛋清的溶菌酶，透析后冻干粉末，~100,000 U/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62970</td><td></td></tr><tr><td>nPDyn</td><td></td><td>v3.x</td><td>见 github.com/kpounot/nPDyn，软件中也包含用于拟合的模型函数</td></tr><tr><td>OHAUS AX324 Adventurer 天平，内置校准</td><td>Dutscher</td><td>92641</td><td></td></tr><tr><td>五氧化二磷，ReagentPlus，99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214701</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 移液器，0.5–10 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-0510</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 移液器，100–1,000 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 移液器，20–200 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 吸头，1,000 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 吸头，10 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-3200</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 吸头，200 &amp;mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>氘氧化钠溶液，D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 40 wt. %，99.5 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372072</td><td></td></tr></tbody></table>

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

中子散射能够在无需除氘以外的标记、且非破坏性的条件下，以较宽的能量范围探测样品内部的动力学过程。特别是，中子背散射谱学可同时记录多个散射角的散射信号，非常适用于研究生物体系在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。通过使用D2O以及可能的氘代缓冲液组分，该方法能够同时监测液态下蛋白质的质心扩散以及主链和侧链运动（内部动力学）。
此外，通过使用经全氘代并以H2O水合的蛋白质粉末，可研究水合水的动力学。本文介绍了在位于法国劳厄-朗之万研究所（ILL）的IN16B仪器上用于研究蛋白质及水合水动力学的工作流程。文中阐述了利用蒸气交换法制备溶液样品和水合蛋白质粉末样品的方法，并针对中子背散射谱仪可获得的不同类型数据集（准弹性谱或固定窗口扫描），描述了蛋白质和水合水动力学的数据分析流程。
该方法通过两项涉及淀粉样蛋白的研究加以说明。溶菌酶聚集形成微米级球形聚集体（称为颗粒物）的过程被证实，在IN16B所探测的空间和时间尺度范围内，该过程以单步方式进行，同时其内部动力学保持不变。 &#181;微米级球形聚集体（称为颗粒物）在IN16B探测的空间和时间范围内表现为一步形成过程，同时其内部动力学保持不变。此外，利用全氘代蛋白的水合粉末样品研究了tau蛋白水合水的动力学，结果显示水的平动运动在淀粉样纤维形成时被激活。最后，讨论了实验方案中的关键步骤，并阐述了中子散射在研究动力学方面相对于其他实验生物物理方法所处的地位。

在90 °C条件下，将溶菌酶在氘代缓冲液（pD 10.5的0.1 M NaCl）中以50 mg/mL的蛋白浓度孵育，使其聚集形成颗粒物。颗粒物的形成由温度升至90 °C触发，并在6小时内完成（补充图S8）。数据采集在IN16B仪器上进行，具体方法如上文方案所述（数据由ILL长期保存，可通过&#160;http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811访问）。
在 7 °C 下采集 QENS 谱以充分表征初始状态。随后将温度升高至 90 °C（在 IN16B 上通常需要约 30 分钟，补充图 S9）以触发聚集过程。可通过 QENS 谱的滑动平均来追踪动力学过程，从而获得完整的能量转移范围，但在时间分辨率上受限。使用 EFWS 可将时间分辨率提高至约 1 分钟，使用 E/IFWS 在四个能量转移值下可提高至约 20 分钟5。
在本示例中，我们研究了 0、0.6、1.5 和 3 µe...

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。

中子散射能够在不破坏样品的情况下，以非侵入方式探测样品在宽广能量范围内的动力学特性，且无需……

中子背散射可测量蛋白质和水合水的全局扩散与内部动力学，且不会造成辐射损伤。中子谱学能够同时在分子层面上获取空间和时间相关性。在软物质和生物材料中，尤其有意义的是从这些长程无序体系中获得有关局部有序的间接信息。因此，中子背散射可用于研究生物学、化学或材料科学中的动力学过程。另一个重要应用领域是能源，例如对电池和燃料电池的研究。中子背散射已成功用于研究与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病相关的蛋白质的分子动力学。所获得的结果有助于我们更深入地理解这些病理的分子特征，并可能为开发更佳的诊断方法铺平道路。准备样品台时，首先用水彻底清洗平底铝制样品台及其铟丝密封圈和螺丝，随后用乙醇清洗，然后使其自然晾干。使用精密天平分别称量样品台的各个部件，包括底部、盖子和铟丝。将一毫米粗的铟丝密封圈放入样品座底部的凹槽中，两端连接处留出少量重叠。加入约100毫克冻干蛋白，使其填满样品座底部的内表面。接着，将样品座放入干燥器中，并在干燥器内放置一个含有五氧化二磷粉末的培养皿，静置24小时，以彻底干燥蛋白粉末。称量含有铟密封圈和干燥粉末的样品 holder 底部干燥部分，以获得干燥样品的质量。将五氧化二磷从干燥器中取出，放入一个装有重水的培养皿以及样品，以使粉末水合。重复干燥和水合过程三次，以实现完全的氢-氘交换。定期测量粉末质量以监测水合程度，当水合程度略高于目标值时，等待质量缓慢下降。达到目标水合程度后，迅速将盖子盖到底部部件上，并先用四颗螺钉固定样品室，以阻止蒸汽交换。随后安装并拧紧其余所有螺钉，直至底部部件与盖子之间无可见缝隙。称量密封的样品架，以检查中子实验后是否因泄漏导致潜在的水分流失。制备液态样品时，将蛋白质溶解于氘代缓冲液中。使用水确定应加入样品架中的液体适当体积。在处理任何材料之前，确保电离辐射剂量低于每小时100微西弗。然后，彻底干燥样品杆，并清除任何先前的样品。将样品放置在样品杆上，检查其相对于光束中心是否居中，随后将样品杆插入低温炉中。在 Nomad 中获取数据时，进入执行选项卡，将炉式低温控制器拖放到启动台中。将温度设置为 200 开尔文。使用快速模式并设置 30 分钟的超时时间，以确保温度有足够时间稳定。单击刷新图标，以在温度下降期间于后台运行温度斜坡，进行数据采集。将 IN16 多普勒设置控制器拖放到启动面板中。将速度模式设为精确速度，控制方式设为最大能量差（max delta E），能量偏移设为 0.00 微电子伏特（micro electronvolt），通道数设为 128，以获得弹性固定窗口扫描配置。将计数控制器拖放到启动面板中，在副标题字段中填写一个便于识别数据的名称，并设置每次扫描30秒，重复60次。接下来，将IN16多普勒设置控制器拖放到启动面板中。将速度分布设为符号（sign），设置依据设为速度，值为4.5米每秒，通道数设为2048，以获得准弹性中子散射配置。拖放一个计数控制器，并在副标题字段中填写一个便于识别数据的名称。设置扫描时间为30分钟，重复四次。对于温度 ramp，拖放一个炉式低温控制器，将温度设置为310开尔文，并设置 ramp 至目标点，每6秒温度变化0.05开尔文。使用 200 分钟的超时时间。使用 65 次重复的 for 循环。在循环内插入一个 IN16 多普勒设置控制器，接着插入计数控制器，并设置单次扫描时间为 30 秒。随后，插入IN16多普勒设置，参数设置同前，但使用1.5微电子伏的能量偏移和1024个通道。然后插入计数控制器，并设置单次扫描时间为三分钟。为获取312开尔文下的最后一次准弹性中子散射数据，拖放此前已配置好的IN16多普勒设置和计数控制器。然后，按下开始按钮以运行脚本。溶酶体的弹性与非弹性固定窗口扫描显示，在低动量转移和低能量转移处信号增强，而在高能量转移和低动量转移处信号减弱。初始质心扩散系数为15 埃²/纳秒，随后随时间呈指数下降。当温度高于220开尔文时，tau纤维周围的水合水分子比tau单体周围的水合水分子具有显著更高的流动性。在纤维周围，发生平移运动的水分子比例以及水分子的平移和旋转扩散系数均有所增加。由于中子反向散射受到中子通量或样品池缓冲液背景的限制，蛋白质浓度应为2000毫克/毫升，或对于质子化蛋白质至少为20毫克/毫升。中子背散射技术最近已被应用于研究水（蛋白质的天然环境）如何被合成聚合物完全取代，以用于生物技术应用，例如药物递送。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

高分辨率中子光谱研究蛋白质和水合水的皮秒纳秒动力学

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

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蛋白质动力学研究 通过 中子自旋回波谱学

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中子自旋回波谱学作为研究脂质膜动力学及膜-蛋白质相互作用的独特探针

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毫秒级氢/氘交换质谱法用于生理条件下α-突触核蛋白结构动力学研究

核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2...

NMR 15N 弛豫实验用于研究蛋白质的皮秒至纳秒级结构动力学

本文介绍了一种利用核磁共振波谱法（NMR）鉴定内在无序蛋白多位点磷酸化的方法，并以Tau蛋白为例进行说明。重组Tau蛋白经同位素标记并修饰 体外...

用于鉴定内在无序蛋白多重磷酸化的核磁共振波谱法

本方法中，我们介绍了从多种小鼠组织中快速高效分离中间丝（IF）蛋白的生化操作流程。分离得到的中间丝可用于通过质谱及其他生化实验研究翻译后修饰的变化。...

从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

探索中子背散射光谱技术，用于研究溶菌酶和tau蛋白等淀粉样蛋白的聚集动力学及其水合水动态。该方法为理解神经退行性疾病的分子机制提供了无损、无标记的研究手段。

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

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