Name: 激光显微切割，用于与物种无关的单组织应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习激光显微切割结合CEL-Seq2技术，用于秀丽隐杆线虫特定组织的转录组分析。该方法适用于非模式物种，无需物种特异性遗传工具即可实现基因表达研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01GM141395）和美国国家科学基金会（NSF，项目号1656736）向DF提供的资助，以及NIH向AW提供的博士后奖学金（F32GM136170）支持。图1的制作得到了BioRender.com的帮助。

1. 线虫同步化
注意：以下介绍了两种用于同步秀丽隐杆线虫（C. elegans）及其他小杆线虫科物种发育的方法。
<ol>
	<li>通过碱性次氯酸盐（漂白剂）处理后，使线虫同步化至第一幼虫期（L1）停滞阶段。 
	注意：该方法此前已有详细描述19该方法依赖于以下两个特征： 秀丽隐杆线虫 对其他多种杆形线虫物种也同样成立：（1）卵壳耐漂白剂，而包裹成虫和幼虫的角质层则不耐；（2）一龄幼虫在无食物条件下会停滞发育20.
	<ol>
		<li>用稀释的次氯酸钠溶液处理怀卵的雌雄同体（或雌性）线虫，以溶解其角质层并释放胚胎。</li>
		<li>将胚胎从次氯酸钠溶液中取出，不添加食物，继续培养直至所有L1幼虫孵化。</li>
		<li>将停滞在L1期的线虫置于食物上，所有个体将在大致相同的时间恢复发育。 
		注意：L1 期滞育的恢复可在一小时内发生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与……同步 &#34;孵化完成&#34; 方法（此处使用）； 图1 顶部： 
	注意：孵化脱离法可实现高度同步化，且不会干扰发育过程（L1期停滞会影响后续发育阶段的发育）21）。该方案改编自 Pepper 等人的研究。22该方法的目的是从仅含有胚胎的培养板中收集在特定时间段内孵化出的L1幼虫。
	<ol>
		<li>挑选母体： 在进行孵化分离的前一天晚上，挑选约30只怀卵的雌雄同体线虫，转移到接种有细菌的培养板上 E. coli OP50</li>
		<li>在25 °C下孵育过夜以产卵。 
		注意：选择无裂纹或气泡的培养皿，以免线虫卡住。避免使用细菌菌苔过厚的培养皿，否则后续难以彻底移除所有线虫。若操作温度敏感型品系，需根据其胚胎发育时间较长的特点调整产卵时间。选取处于最高产卵阶段的母虫进行操作。</li>
		<li>移除母体与幼虫： 次日早晨，在解剖显微镜（20倍放大）下，用移液器轻轻将1–2 mL M9缓冲液沿培养板壁加入，避免直接喷射；轻轻旋转培养板以悬浮线虫。</li>
		<li>将移液器枪头紧贴培养皿边缘的琼脂壁，避免戳破琼脂，移除并弃去所有液体和线虫。检查培养皿上是否仅残留虫卵/胚胎而无线虫，尤其注意无L1幼虫；若仍有线虫残留，则需重复清洗步骤。</li>
		<li>将培养皿置于25 °C下1小时，等待部分L1幼虫孵化。</li>
		<li>收集新孵化的L1幼虫：小心地将1 mL M9缓冲液滴加到琼脂表面。轻轻摇晃培养皿，使L1幼虫脱离而胚胎不脱落。用移液器轻柔地将缓冲液和线虫转移至1 mL离心管中。</li>
		<li>将离心管在约18,000 × g 条件下离心1分钟 g去除上清液。</li>
		<li>将L1直接移液至已接种细菌的平板上。在解剖显微镜下确认无成虫或胚胎存在。</li>
		<li>将线虫置于25 °C培养，直至其发育至所需阶段。 
		注意：如果条件理想，可从同一块平板中再收集两批 L1。检查初始平板，确保其中无 L1 存在。如有必要，再次冲洗。重复步骤 1.2.5–1.2.9。</li>
		<li>检查发育时间点。 在进行下游应用之前，在400倍放大倍数下使用复式显微镜检查部分线虫，以确认其已达到目标发育阶段（此处为L3阶段）。 
		注意：除了阴道发育外，远端尖端细胞或连接细胞的迁移距离也可作为参考指标。关于阴道发育，参见 Mock 等人。23 提供了一份有用的参考指南，尽管该研究中的时间参数是在20 °C下确定的。在25 °C下，野生型 秀丽隐杆线虫 将在孵化后24小时经历L3-L4蜕皮。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 收集L4期雄性和雌雄同体及固定
<ol>
	<li>在固定前，准备好无RNA酶、低温（-20 °C）的70%甲醇。</li>
	<li>在解剖显微镜下以30-50倍放大倍数，一旦能够区分性别（约孵化后21小时，图2），立即从同步化平板上将雄性和雌雄同体分别挑取至未接种的平板上，并持续挑取1-2小时，或直至收集到200只线虫。</li>
	<li>将线虫置于25 °C条件下培养，直至达到实验所需的发育阶段。</li>
	<li>用移液器枪头吸取1-2 mL M9缓冲液冲洗平板上的线虫，枪头需预先用含0.01%去垢剂的M9缓冲液冲洗（防止线虫粘附在枪头上）。</li>
	<li>将线虫转移至1 mL离心管中。</li>
	<li>以21,000 × g离心1分钟使线虫沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>加入1 mL M9缓冲液，混匀以重悬沉淀。</li>
	<li>以21,000 × g离心1分钟使线虫沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>重复洗涤一次。</li>
	<li>加入1 mL冰预冷的70%甲醇，充分混匀。</li>
	<li>以21,000 × g离心1分钟使线虫沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤2.10和2.11。</li>
	<li>加入500 µL 70%甲醇，混匀后于4 °C保存1小时至过夜。</li>
</ol>
3. 激光显微切割
注意：从这一步开始，使用无RNase的试剂和耗材；使用滤芯吸头。
<ol>
	<li>如果使用 CEL-Seq2 方法处理样本，为每种 CEL-Seq2 引物配制母液（补充表 S1）：将 2 µL CEL-Seq2 引物、1 µL 10 mM dNTP 和 9 µL 1% β-巯基乙醇（溶于无 RNase 水中）移入已标记的 200 µL 离心管中。</li>
	<li>载玻片装载
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，将 20 µL 固定的线虫（来自步骤 2.13 的 20–40 条线虫）移取至聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片的磨砂面（即膜所在面）。</li>
		<li>等待甲醇挥发。可使用载玻片加热器加速挥发。 
		注意：若线虫在干燥过程中发生聚集，可追加少量甲醇，并用移液器吸头将线虫分散。线虫成团时难以进行显微切割。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜设置 
	注意：以下操作流程专用于 材料表 中列出的仪器。若使用其他激光显微切割（LMD）显微镜，需相应调整。
	<ol>
		<li>将桌面加湿器置于 LMD 显微镜载物台后方一侧，确保水雾直接吹向载物台。 
		注意：加湿器有助于减少静电，否则静电可能导致微小膜片无法落入管盖中。</li>
		<li>打开激光电源钥匙。</li>
		<li>开启载物台控制电源。</li>
		<li>打开显微镜控制箱电源。</li>
		<li>启动 激光显微切割 软件。</li>
		<li>移除载物台上方的塑料防护罩。</li>
		<li>点击带有向上箭头的 卸载 按钮，以装载膜载玻片。</li>
		<li>确认载玻片完全干燥后，将其翻转，使膜面朝下。</li>
		<li>插入载玻片，并在 更换样本 窗口中点击 继续。</li>
		<li>重新安装塑料防护罩。</li>
		<li>在屏幕底部选择含有载玻片的载玻片架。</li>
		<li>为装载收集管，点击带有向下箭头的 卸载 按钮。</li>
		<li>拉出托盘并取出管架。 
		注意：本实验所用管架适用于 500 µL PCR 管。</li>
		<li>将 500 µL PCR 管的管盖插入支架中，并将管体向下折叠。</li>
		<li>将管架放回托盘，并将托盘推回显微镜载物台。</li>
		<li>在 更换收集装置 弹出窗口中，选择 PCR 管，然后点击 确定。</li>
		<li>点击屏幕左下角 收集装置管盖 区域中的空管位置。</li>
		<li>在 显微镜控制 面板中，选择 TL-BF，以启用透射光明场照明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切割 
	注意：本操作流程专用于 材料表 中列出的仪器。
	<ol>
		<li>使用 2.5x 物镜，调节焦距，直至可见线虫及膜的结构。</li>
		<li>切换至 20x 物镜。</li>
		<li>移动载物台至无虫区域，调节焦距，使膜中的泡状结构呈现黄绿色（图 3A、B），以确保激光聚焦于正确焦平面。</li>
		<li>设置激光参数；对于尾尖切割，初始参数设为 功率 45、孔径 30、速度 20。</li>
		<li>在 激光控制 面板中选择 校准，并按照提示操作。 
		注意：仪器将自动执行此步骤，确保屏幕上用鼠标绘制的图形与激光切割的实际形状一致。</li>
		<li>在屏幕底部的 收集装置管盖 区域，点击 位置 A。</li>
		<li>在屏幕右侧选择 单个图形 | 绘制 + 切割，在左侧选择 PtoP 模式。</li>
		<li>绘制一条直线。</li>
		<li>点击 开始切割，使激光穿透膜层。 
		注意：激光可能同时在玻璃上刻出痕迹。</li>
		<li>若测试切割效果良好（膜被完全切断，切口边缘平滑），则继续下一步操作；否则需重新调节焦距并再次切割。</li>
		<li>找到一条线虫，切换至 移动 + 切割 模式，使用鼠标切割尾部。 
		注意：若激光未能完全切断尾部，需调节焦距并提高激光功率。对于较厚组织，激光功率可能需设为 60。</li>
		<li>保存参数设置：文件选项卡 | 保存应用配置；后续可使用 恢复应用配置 调用。</li>
		<li>为收集样本，切换至 绘制 + 切割 模式并启用 PtoP 功能，绘制图形以完成膜片的切割（图 3C）。 
		注意：相比圆形或椭圆形，较大面积且呈矩形或三角形的膜片更易于在收集管盖中定位。</li>
		<li>在屏幕底部的 收集装置管盖 区域选择下一个收集管，然后切割下一个尾尖。</li>
		<li>完成四条尾尖切割后，卸下载管架（点击带向下箭头的 卸载 按钮），并在解剖显微镜下寻找膜片（图 3D）。 
		注意：膜片可能位于管盖中央，或粘附于管盖侧壁。</li>
		<li>继续后续实验操作。对于 CEL-Seq2，直接将 1.2 µL CEL-Seq2 引物母液（来自步骤 3.1）加至样本上方。</li>
		<li>盖紧管盖，标记引物编号，并立即将管盖直接置于干冰上，以快速冷冻样本，防止 RNA 降解。</li>
		<li>装载更多收集管，将管架放回载物台，继续切割更多样本。为每条尾尖添加不同的 CEL-Seq2 引物混合液。</li>
		<li>将所有管子储存于 -70 °C 条件下。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用 CEL-Seq2 进行单端 RNA 测序
注意：有关 CEL-Seq2 方案的完整细节，请参见 Yanai 和 Hashimshony18。
<ol>
	<li>使用 RNase 去污染溶液清洁实验台区域，以防止 RNA 降解。</li>
	<li>配制主混合液并置于冰上保存。
	<ol>
		<li>配制逆转录主混合液：每份样品加入 0.4 µL 第一链缓冲液、0.1 µL 0.1 M DTT、0.1 µL RNase 抑制剂和 0.1 µL 逆转录酶。</li>
		<li>配制第二链反应主混合液：每份样品加入 7 µL 水、2.31 µL 第二链缓冲液、0.23 µL dNTP、0.08 µL E. coli 连接酶、0.3 µL E. coli DNA 聚合酶和 0.08 µL RNaseH。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解细胞并与引物退火（引物完整列表见补充表 S1）：
	<ol>
		<li>将PCR仪及其加热盖预设至 65 °C。</li>
		<li>从 -70 °C 取出样品，并在PCR仪中孵育 2.5 分钟。</li>
		<li>在 21,000 × g 条件下离心 30–40 秒。</li>
		<li>在 65 °C 下孵育 2.5 分钟。</li>
		<li>立即转移至冰上。</li>
		<li>再次在 21,000 × g 条件下离心 30–40 秒，然后放回冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 RNA 转化为 cDNA：
	<ol>
		<li>向每个尾尖样品中加入 0.8 µL 逆转录混合液。</li>
		<li>在 42 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>在 70 °C 下热失活 10 分钟。</li>
		<li>立即转移至冰上。</li>
		<li>向每个尾尖样品中加入 10 µL 第二链混合液。</li>
		<li>轻轻弹击管壁混匀样品。</li>
		<li>在 21,000 × g 条件下离心 30–40 秒。</li>
		<li>在 16 °C 下孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA 纯化：
	<ol>
		<li>将 DNA 纯化磁珠预热至室温。</li>
		<li>将最多 40 个样品合并至一个 1.5 mL 离心管中（总体积不超过 480 µL）。</li>
		<li>充分混匀磁珠，每 100 µL 混合样品加入 20 µL 磁珠和 100 µL 结合缓冲液（对于 480 µL 样品，加入 480 µL 结合缓冲液和 96 µL 磁珠，终体积最多为 1,056 µL）。通过移液充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上至少 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>移除并弃去上清液，仅保留 20 µL&#160;。</li>
		<li>加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇。</li>
		<li>孵育至少 30 秒，用移液器小心吸除上清液，避免扰动磁珠。弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 4.5.7 和 4.5.8 一次。</li>
		<li>将磁珠在空气中干燥 15 分钟，或直至完全干燥。</li>
		<li>用 6.4 µL 水重悬磁珠（约 6.4 µL），通过上下移液 10 次彻底混匀。</li>
		<li>室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>直接进入体外转录（IVT）步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外转录与片段化：
	<ol>
		<li>向含有 6.4 µL 样品和磁珠的离心管中加入以下混合液（总体积 9.6 µL）：1.6 μL 10× T7 缓冲液、1.6 μL ATP、1.6 µL UTP、1.6 µL CTP、1.6 µL GTP（每种 dNTP 浓度为 75 mM）和 1.6 μL T7 酶。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 13 小时，结束后保持 4 °C。</li>
		<li>加入 6 µL 外切核酸酶溶液（终体积应为 22 µL）。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>将离心管放回冰上，加入 5.5 µL 片段化缓冲液（0.25 × 反应体积）。</li>
		<li>在 94 °C 下孵育 3 分钟。</li>
		<li>立即转移至冰上，并加入 2.75 µL 片段化终止缓冲液（为所加片段化缓冲液体积的 0.5 ×）。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上至少 5 分钟，直至液体变澄清，以去除磁珠。</li>
		<li>将上清液转移至新离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增 RNA（aRNA）纯化：
	<ol>
		<li>将 RNA 纯化磁珠预热至室温。</li>
		<li>充分混匀磁珠。</li>
		<li>移取 55 µL 磁珠（1.8 × 反应体积）。</li>
		<li>室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上至少 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>移除并弃去 80 µL 上清液。</li>
		<li>加入 200 µL 新鲜配制的 70% 乙醇。</li>
		<li>孵育至少 30 秒，用移液器小心吸除上清液，避免扰动磁珠。弃去上清液。</li>
		<li>再重复乙醇洗涤两次。</li>
		<li>将磁珠在空气中干燥 15 分钟，或直至完全干燥。</li>
		<li>用 7 µL 水重悬磁珠。上下移液 10 次以彻底混匀。</li>
		<li>室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>将含磁珠的离心管置于磁力架上 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>将上清液转移至新离心管中。 
		注：可暂停点：样品可在 -70 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：按照制造商说明书，使用自动电泳系统检测 aRNA 的浓度和质量。</li>
	<li>文库制备：
	<ol>
		<li>向 5 µL RNA 中加入 1 µL 100 µM 随机六聚体逆转录引物（见材料表）和 0.5 µL 10 mM dNTP。</li>
		<li>在 65 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>在室温下加入 4 µL 下列混合液：2 µL 第一链缓冲液、1 µL 0.1 M DTT、0.5 µL RNase 抑制剂、0.5 µL 逆转录酶。</li>
		<li>在 25 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 42 °C 下孵育 1 小时（可在杂交炉或预热至 50 °C 加热盖的PCR仪中进行）。</li>
		<li>在 70 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>转移 5 µL 至新离心管（其余反应液保存在 -20 °C）。加入 5.5 µL 超纯水、1 µL RNA PCR 引物（RP1）、1 µL 带索引的 RNA PCR 引物（RPIX）和 12.5 µL PCR 混合液。</li>
		<li>在PCR仪上运行以下程序：98 °C 30 秒，11 个循环（98 °C 10 秒，60 °C 30 秒，72 °C 30 秒），72 °C 10 分钟，4 °C 保存。 
		注：可暂停点：样品可在 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库纯化：
	<ol>
		<li>将 DNA 纯化磁珠预热至室温。</li>
		<li>&#160;充分混匀磁珠。</li>
		<li>向 PCR 反应液中加入 25 µL 磁珠。通过移液充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上至少 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>移除并弃去 45 µL 上清液。</li>
		<li>加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇。</li>
		<li>孵育至少 30 秒，小心吸除上清液并弃去，避免扰动磁珠。</li>
		<li>再重复乙醇洗涤一次。</li>
		<li>将磁珠在空气中干燥 15 分钟，或直至完全干燥。</li>
		<li>用 25 µL 水重悬磁珠。通过移液充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>转移 25 µL 上清液至新离心管中。</li>
		<li>重复步骤 4.10.2–4.10.10 一次。</li>
		<li>用 10.5 µL 水重悬磁珠。通过移液充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上 5 分钟，直至液体变澄清。</li>
		<li>转移 10 µL 上清液至新离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据测序机构的要求评估文库的质量和数量。</li>
</ol>

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<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

方法的关键步骤 
若操作正确，本方法可利用相对较少的激光显微切割样本（本示例中为70个尾部尖端）获得稳定的RNA表达谱。然而，对于来自发育中动物的样本，严格的同步化对于降低样本间的变异性至关重要。因此，本方案推荐采用孵化同步法（hatch-off method）进行线虫同步化。在此方法中，研究者可确定并精确控制个体间的年龄差异（本方案中为1小时）。此外，孵化同步法适用于任何物种，即使其胚胎对次氯酸钠敏感、L1幼虫无法有效停滞，或从L1停滞状态恢复的情况不稳定。要成功实现孵化同步，清洗步骤尤为关键：在孵化期开始时必须彻底清除所有成虫和幼虫，在孵化期结束时则不应将任何胚胎随新孵化的L1幼虫一同洗出。只有当培养皿的琼脂表面无裂缝、孔洞或气泡损伤，培养皿上的细菌菌落新鲜且厚度适中，并且液体仅被极轻柔地加入和搅动时，上述操作才能成功。
如果需要分别获取雄性和雌雄同体/雌性个体的数据，则准确鉴定性别也十分重要。根据性别区分L3幼虫（见图2）需要一定的经验。建议先练习挑选L3阶段的雄性和雌雄同...

线虫——尤其是与模式生物Caenorhabditis elegans相近的杆形目线虫——由于多种原因，成为进化发育生物学（EDB）研究的理想动物类群1,2。其优势包括细胞数量少、细胞谱系明确且稳定、身体透明，以及易于培养和饲养。此外，已有大量资源可供利用，包括多个物种的高质量基因组序列；对于C. elegans，还拥有丰富的分子遗传学工具，以及关于其发育、遗传、解剖和生理的详尽知识3,4,5,6。
与许多其他生物类似，能够在单个组织或单个细胞水平上表征转录组动态的能力，已彻底改变了对C. elegans7,8,9,10发育过程的分析。若能跨线虫物种比较单细胞转录组，也将同样地推动利用这些生物开展进化发育生物学（EDB）研究。例如，此类比较可揭示基因调控网络如何在保守的性状、已发生分化的性状，或独立演化的性状中发生演变。

然而，从线虫中分离特定组织或细胞是目前面临的主要挑战之一。对于许多生物体而言，单个细胞可以从组织中解离并以无偏倚的方式收获，或者通过荧光蛋白的组织特异性表达进行标记，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行分选11。在C. elegans中，由于其坚韧的外部角质层（以及流体静力骨架）阻碍了幼虫和成虫细胞的分离，高通量（HTP）细胞分离主要局限于胚胎。为克服这一难题，一些方法采用了针对整个C. elegans个体的遗传工具，例如组织特异性的mRNA标记技术12，以及野生型与影响特定细胞类型的突变体之间的差异表达比较13。近年来的一些方法则通过溶解角质层来实现细胞核14或完整细胞8,9,15的分离。然而，细胞分离与细胞培养存在明显缺陷，即细胞被脱离其天然的发育或解剖环境——例如，失去了细胞间的信号交流以及与细胞外基质的接触，这些因素预期会影响基因表达谱15。此外，这些遗传工具和组织特异性标记具有物种特异性（即仅适用于C. elegans）。
激光显微切割（LMD）提供了一种在不破坏细胞天然环境的前提下分离组织的替代方法。对于进化发育生物学（EDB）而言，LMD 的重要意义在于：只要这些物种的基因组或全转录组序列已知，即可比较不同物种同源组织的转录组，而无需依赖物种特异性的遗传工具包。LMD 技术通过显微镜直接观察来定位目标组织，并利用集成在显微镜光学系统中的激光微束切割并获取（捕获）目标组织16。LMD 的局限性在于，该方法难以实现极高通量的应用（尽管本方案中所述尾尖组织的转录谱在约 70 个样本的情况下仍表现出良好的稳健性），某些样本可能难以完整分离，且切割精度受限于激光的精确度以及显微镜下的可视能力。
本实验方案的目的是介绍如何利用激光显微切割（LMD）结合单组织RNA测序技术，从线虫中获取特定发育阶段和特定组织的转录组数据。具体而言，本方案演示了利用激光显微切割技术分离秀丽隐杆线虫（C. elegans）四龄幼虫（L4）尾部尖端组织的方法。然而，该方法也可根据需要调整，用于其他组织以及不同物种。
在 C. elegans 中，无论雄性还是雌雄同体，均有4个细胞构成尾尖。在雄性的L4阶段（雌雄同体无此现象），尾尖细胞会改变其形态，并向前方和内侧迁移。这一过程也存在于部分但并非所有其他小杆线虫属物种中。因此，尾尖是研究性二型形态发生进化的良好模型。由于其位置特殊，尾尖也易于通过激光显微切割（LMD）进行分离。
为了从尾尖组织获得转录组谱，本方案采用CEL-Seq2技术，这是一种为单细胞设计的RNA测序方法17,18。该方法在激光显微切割（LMD）来源的组织中具有多项优势。CEL-Seq2具有高度的灵敏性和效率，利用独特的分子标识符（UMI）实现mRNA读段的直接定量，通过体外转录（in vitro transcription）确保线性扩增，并通过条形码技术实现不同组织样本的多重混合检测。CEL-Seq2唯一的局限性在于所获得的读段偏向于mRNA的3'端，因此大多数转录本异构体无法被区分。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;0.5 &amp;micro;M PEN 膜玻璃载片，无 RNase</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>用于激光显微切割（LMD）</td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L PCR 管（无核酸酶）</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>用于剪切线虫尾尖</td></tr><tr><td>配备 40x 物镜和微分干涉差（DIC）的复式显微镜</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于检查线虫年龄</td></tr><tr><td>台式加湿器</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备透射光源底座的解剖显微镜</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于所有线虫操作</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用作线虫挑取工具的手柄</td></tr><tr><td>玻璃载片和盖玻片</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于检查线虫年龄</td></tr><tr><td>LMD6 显微切割系统</td><td>Leica</td><td>多种</td><td>用于剪切尾尖</td></tr><tr><td>LoBind 0.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td></td><td></td><td>配方见 WormBook</td></tr><tr><td>甲醇 99.8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>用于固定线虫</td></tr><tr><td>NGM 生长培养基</td><td>US Biological</td><td>N1000</td><td>需添加缓冲液和盐：配方见 WormBook</td></tr><tr><td>P10 可调体积移液器</td><td>例如 Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 可调体积移液器</td><td>例如 Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 可调体积移液器</td><td>例如 Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1–10 &amp;micro;L 滤芯移液器吸头</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂铱合金丝</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td><td>用于制作线虫挑取工具</td></tr><tr><td>无菌且无核酸酶的 1 mL 离心管</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>向 M9 缓冲液中加入极少量以防止线虫粘附在移液器吸头上</td></tr><tr><td>带通气孔的 6 mm 塑料培养皿</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于 CEL-Seq2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation 系统，含高灵敏度 RNA 和 DNA 检测试剂</td><td>Aligent</td><td></td><td>自动化电泳系统</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA 纯化磁珠</td></tr><tr><td>磁珠结合缓冲液&amp;nbsp; 20% PEG8000, 2.5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 引物（见表 S1）</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>具有可编程加热盖和模块的热循环仪，适用于 200 &amp;micro;L 管。</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶 I（&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;）</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液 10 mM</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA 连接酶</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>外切核酸酶溶液</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>用于步骤 4.6.1</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 PCR Master Mix（含 HF 缓冲液）</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR 混合液，步骤 4.9.7</td></tr><tr><td>随机六聚体反转录引物 GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA&lt;br/&gt; NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>一种含有 6 个随机核苷酸的引物</td></tr><tr><td>RNA 断裂缓冲液</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA 断裂终止缓冲液</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物（RPI1&amp;ndash;RPI48）</td><td>Illumina、NEB 或 IDT</td><td></td><td>方案步骤 4.9.7 中的 RPIX，序列可从 Illumina 获取</td></tr><tr><td>RNAClean XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY 表面去污剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>或任何其他类似产品</td></tr><tr><td>RNaseH（&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;）</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>第二链合成缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>反转录酶</td></tr></tbody></table>

适用于多种物种的单组织激光显微切割技术

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

单细胞技术已彻底改变了特定细胞类型转录组的分析方法。然而，这些技术通常需要物种特异性的遗传&#34;工具包&#34;，例如驱动荧光蛋白在特定组织中表达的启动子。此外，通过破坏组织以分离单个细胞的实验方案会使细胞脱离其天然微环境（例如邻近细胞的信号传导），并可能导致应激反应或其他与天然基因表达状态的差异。在本实验方案中，激光显微切割（LMD）技术被优化用于分离单个线虫尾尖，以研究雄性尾尖形态发生过程中的基因表达。
激光显微切割（LMD）能够在无需细胞解离或物种特异性工具包的情况下分离动物的特定部分，因此适用于任何物种。随后，可对LMD分离的单一组织应用单细胞RNA测序文库构建方案（例如CEL-Seq2），并利用标准分析流程进行分析，前提是该物种具有注释良好的基因组或转录组。此类数据可用于探究在不同物种中该组织发育过程中所涉及的转录组在进化上是保守的还是存在差异。
局限性包括切割目标组织的能力以及样本量。功效分析显示，每种条件仅需70个尾尖即可达到80%的功效。需要对发育过程进行严格同步，以获得相同发育阶段的足够数量动物。因此，本文还描述了一种以1小时为间隔同步动物发育的方法。

在激光显微切割后，分别收集雄性和雌雄同体在4个时间点（L3期：孵化后22小时；L4期：孵化后24、26和28小时）的单个尾部尖端，采用CEL-Seq2方法进行RNA测序文库制备。CEL-Seq2引物含有独特的条形码，可使特定样本（本例中为单个尾部尖端）的测序读段通过生物信息学方法被识别。利用该方法共获得557个尾部尖端的测序数据（涵盖4个发育时间点，雌雄同体266个，雄性291个，每个性别和时间点59–78个尾部）。其中97%（即543个）尾部尖端成功回收了CEL-Seq2条形码（补充表S2）。大多数文库的回收率为99–100%；然而，其中一个雄性时间点的回收率为88%。值得注意的是，由于新冠疫情导致的延迟，来自22、24和28小时时间点的大约一半雄性尾部尖端样本在-80 °C下保存了约4个月。这表明，尽管在取样后尽快进行测序文库制备是理想做法，但解剖后的样本在文库制备前仍可较长时间保存。
CEL-Seq2 引物还在每条 mRNA 转录本上添加一个 UMI，从而能够去除 PCR 重复序列，并对样品中的基因表达进行精确量化。不同尾尖样本之间的 UMI...

本文描述了一种利用激光显微切割技术分离单个线虫组织用于RNA测序的实验方案。该方案无需物种特异性的遗传工具包，因而能够在单组织样本水平上比较不同物种之间的基因表达谱。

单细胞技术已经彻底改变了特定细胞类型转录组的分析方法。然而，这些技术通常需要物种特异性的……

我们将激光显微切割技术与一种名为CEL-Seq2的单细胞RNA测序方案相结合，以生成小规模个体组织样本的转录组数据集。该技术使我们能够研究那些无法通过传统细胞分选方法进行分析的组织或物种中的基因表达。此外，与批量RNA测序方法相比，该技术具有更高的特异性。本文中，我们以秀丽隐杆线虫（C.elegans）四龄幼虫期雄性和雌雄同体的四细胞尾尖为例，展示了该技术的应用。但这种方法的优势在于，它甚至可应用于非模式物种。本实验操作将由我实验室的博士生 Raya Jallad 女士和目前担任田纳西州查塔努加贝勒医学院首席生物医学科学家的 Antonio Herrera 博士进行演示。首先，将一到两毫升 M9 缓冲液轻轻吹打至培养皿壁上，切勿直接喷射。轻轻摇晃培养皿以使线虫脱离。将移液枪枪头紧贴培养皿边缘的琼脂壁，吸取并弃去所有液体及线虫，避免戳破琼脂。 本视频展示了移除成虫和幼虫后的培养皿。移除成虫和幼虫后，应仅剩下胚胎。孵育约一小时后，将开始出现L1期幼虫。然后将培养皿置于25摄氏度环境中。一小时后，从培养箱中取出培养皿。小心地向琼脂上滴加一毫升M9缓冲液，并轻轻旋转培养皿，以悬浮L1幼虫，但不使胚胎脱落。将离心管离心后，用移液器将L1幼虫直接加到已接种细菌的平板上。将线虫置于25摄氏度培养。在解剖显微镜下以30至50倍放大倍数，开始从同步化平板上分别挑取雄虫和雌雄同体虫至未接种细菌的独立平板中。雄性与雌雄同体可通过尾部形态和颜色加以区分：雄性尾部呈膨大状且颜色较浅，而雌雄同体尾部较尖且颜色较深。用1至2毫升M9缓冲液将线虫从培养皿中冲洗下来，移液枪头需预先用含0.01%去垢剂的M9缓冲液冲洗。将线虫转移至1毫升离心管中，离心1分钟，然后加入1毫升M9缓冲液。再次离心一分钟。加入1 mL冰浴的70%甲醇，充分混匀。用1 mL甲醇重复洗涤一次，充分混匀。离心1分钟，加入500 µL 70%甲醇。混匀后置于4°C条件下保存1小时至过夜。用移液器吸取20 µL固定后的线虫，滴加到聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片的涂层一侧。等待甲醇完全蒸发。取下载物台上的塑料护罩，点击带有向上箭头的卸载按钮以加载膜片载玻片。确保载玻片完全干燥后，将其翻转，使膜面朝下，然后插入载玻片。在更换样本窗口中单击“继续”。载物台支架将移动。然后重新安装塑料防护罩，在屏幕底部选择包含玻片的载物台支架，单击带有向下箭头的“卸载”按钮以加载试管。拉出托盘并取出管架。将四个500微升PCR管的管盖插入支架中，并将管子向下折叠。将管架放回托盘，并将托盘推回显微镜载物台上。在更换收集装置的弹出窗口中，选择 PCR 管，然后点击确定。点击屏幕左下方收集装置管盖区域中的空管位置，在显微镜控制面板中选择 TLBF，即透射光亮场照明。使用 2.5X 镜头，调节焦距，直至可见线虫及 PEN 膜表面结构。切换至20倍物镜，并将载物台移动到无蠕虫的区域。调节焦距，使膜上的泡状结构呈现黄色，以将激光聚焦到正确的焦平面，然后设置激光参数。对于尾尖，起始参数设置为功率45、光圈30、速度20。在激光控制面板中，选择校准并按照说明操作。接着，在屏幕下方的收集装置管盖处点击位置 A，在屏幕右侧选择单个形状，然后选择绘制并切割。随后选择点对点模式并绘制一条直线。点击开始切割，使激光穿透膜。找到一条蠕虫，切换至移动和切割模式。使用鼠标切断尾部。采集样本时，切换至“绘制并切割”模式，启用点对点功能并绘制图形，以完成膜片区域的切割。在屏幕底部的收集装置管盖处选择下一个试管，并切割下一段尾尖。完成四段尾尖切割后，点击带有向下箭头的“卸载”按钮，卸下试管架。在解剖显微镜下找到膜部分，并继续进行下游样品处理。此处采用CEL-Seq2进行RNA测序。将1.2 µL的CEL-Seq2引物主混合液直接移取至样品上方，并盖上管盖。用引物编号标记，并立即将管盖直接置于干冰上，以快速冷冻样品，从而防止RNA降解。重复此步骤，直至所有样品均已被收集。最后将试管储存于-70摄氏度条件下。在孵化后21至23小时，可通过解剖显微镜下尾部形态区分秀丽隐杆线虫（C. elegans）的L3雌雄同体与雄性个体。雌雄同体的尾部较细窄，而雄性尾部则膨大且呈透明状。这些图像展示了PEN膜片结构及线虫尾部的外观。此处显微镜下 20X 和 40X 物镜的焦距已调至正确位置。可见已解剖的尾部及部分切除的 PEN 膜。闭合切口后，膜片将落入载玻片下方的管盖中。图中显示了一个带有含尾尖组织的PEN膜部分的管盖。该图示表示不同时间点和性别的个体尾尖组织中经自然对数转换后的唯一分子标识符（UMI）计数。使用powsimR软件来确定在不同表达水平下检测差异表达基因（DE基因）所需的独立样本数量。此处的图形表示在四种不同模拟条件下，针对每种条件的不同样本量，检测两个条件下差异表达基因的真阳性率。虚线表示80%的真阳性率。此处还展示了相应的假阳性发现率及相同的四种模拟结果。虚线表示 10% 的错误发现率。图中显示，除表达水平极低的基因外，每种条件下 70 个尾尖样本量足以检测到差异表达基因。为实现适当的同步化，需确保培养板上仅有胚胎存在。为防止样品损失，应将引物混合液直接移液至帽盖内 PEN 膜的区域，并在关闭帽盖时格外轻柔。由于该方法不依赖物种，我们可利用此方案研究不同物种中同源结构的基因调控网络是如何演化的。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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