适用于多种物种的单组织激光显微切割技术

我们将激光显微切割技术与一种名为CEL-Seq2的单细胞RNA测序方案相结合，以生成小规模个体组织样本的转录组数据集。该技术使我们能够研究那些无法通过传统细胞分选方法进行分析的组织或物种中的基因表达。此外，与批量RNA测序方法相比，该技术具有更高的特异性。

本文中，我们以秀丽隐杆线虫（C.elegans）四龄幼虫期雄性和雌雄同体的四细胞尾尖为例，展示了该技术的应用。但这种方法的优势在于，它甚至可应用于非模式物种。本实验操作将由我实验室的博士生 Raya Jallad 女士和目前担任田纳西州查塔努加贝勒医学院首席生物医学科学家的 Antonio Herrera 博士进行演示。

首先，将一到两毫升 M9 缓冲液轻轻吹打至培养皿壁上，切勿直接喷射。轻轻摇晃培养皿以使线虫脱离。将移液枪枪头紧贴培养皿边缘的琼脂壁，吸取并弃去所有液体及线虫，避免戳破琼脂。

本视频展示了移除成虫和幼虫后的培养皿。移除成虫和幼虫后，应仅剩下胚胎。孵育约一小时后，将开始出现L1期幼虫。

然后将培养皿置于25摄氏度环境中。一小时后，从培养箱中取出培养皿。小心地向琼脂上滴加一毫升M9缓冲液，并轻轻旋转培养皿，以悬浮L1幼虫，但不使胚胎脱落。

将离心管离心后，用移液器将L1幼虫直接加到已接种细菌的平板上。将线虫置于25摄氏度培养。在解剖显微镜下以30至50倍放大倍数，开始从同步化平板上分别挑取雄虫和雌雄同体虫至未接种细菌的独立平板中。

雄性与雌雄同体可通过尾部形态和颜色加以区分：雄性尾部呈膨大状且颜色较浅，而雌雄同体尾部较尖且颜色较深。用1至2毫升M9缓冲液将线虫从培养皿中冲洗下来，移液枪头需预先用含0.01%去垢剂的M9缓冲液冲洗。将线虫转移至1毫升离心管中，离心1分钟，然后加入1毫升M9缓冲液。

再次离心一分钟。加入1 mL冰浴的70%甲醇，充分混匀。用1 mL甲醇重复洗涤一次，充分混匀。

离心1分钟，加入500 µL 70%甲醇。混匀后置于4°C条件下保存1小时至过夜。用移液器吸取20 µL固定后的线虫，滴加到聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片的涂层一侧。

等待甲醇完全蒸发。取下载物台上的塑料护罩，点击带有向上箭头的卸载按钮以加载膜片载玻片。确保载玻片完全干燥后，将其翻转，使膜面朝下，然后插入载玻片。

在更换样本窗口中单击“继续”。载物台支架将移动。然后重新安装塑料防护罩，在屏幕底部选择包含玻片的载物台支架，单击带有向下箭头的“卸载”按钮以加载试管。

拉出托盘并取出管架。将四个500微升PCR管的管盖插入支架中，并将管子向下折叠。将管架放回托盘，并将托盘推回显微镜载物台上。

在更换收集装置的弹出窗口中，选择 PCR 管，然后点击确定。点击屏幕左下方收集装置管盖区域中的空管位置，在显微镜控制面板中选择 TLBF，即透射光亮场照明。使用 2.5X 镜头，调节焦距，直至可见线虫及 PEN 膜表面结构。

切换至20倍物镜，并将载物台移动到无蠕虫的区域。调节焦距，使膜上的泡状结构呈现黄色，以将激光聚焦到正确的焦平面，然后设置激光参数。对于尾尖，起始参数设置为功率45、光圈30、速度20。

在激光控制面板中，选择校准并按照说明操作。接着，在屏幕下方的收集装置管盖处点击位置 A，在屏幕右侧选择单个形状，然后选择绘制并切割。随后选择点对点模式并绘制一条直线。

点击开始切割，使激光穿透膜。找到一条蠕虫，切换至移动和切割模式。使用鼠标切断尾部。

采集样本时，切换至“绘制并切割”模式，启用点对点功能并绘制图形，以完成膜片区域的切割。在屏幕底部的收集装置管盖处选择下一个试管，并切割下一段尾尖。完成四段尾尖切割后，点击带有向下箭头的“卸载”按钮，卸下试管架。

在解剖显微镜下找到膜部分，并继续进行下游样品处理。此处采用CEL-Seq2进行RNA测序。将1.2 µL的CEL-Seq2引物主混合液直接移取至样品上方，并盖上管盖。

用引物编号标记，并立即将管盖直接置于干冰上，以快速冷冻样品，从而防止RNA降解。重复此步骤，直至所有样品均已被收集。最后将试管储存于-70摄氏度条件下。

在孵化后21至23小时，可通过解剖显微镜下尾部形态区分秀丽隐杆线虫（C. elegans）的L3雌雄同体与雄性个体。雌雄同体的尾部较细窄，而雄性尾部则膨大且呈透明状。这些图像展示了PEN膜片结构及线虫尾部的外观。

此处显微镜下 20X 和 40X 物镜的焦距已调至正确位置。可见已解剖的尾部及部分切除的 PEN 膜。闭合切口后，膜片将落入载玻片下方的管盖中。

图中显示了一个带有含尾尖组织的PEN膜部分的管盖。该图示表示不同时间点和性别的个体尾尖组织中经自然对数转换后的唯一分子标识符（UMI）计数。使用powsimR软件来确定在不同表达水平下检测差异表达基因（DE基因）所需的独立样本数量。

此处的图形表示在四种不同模拟条件下，针对每种条件的不同样本量，检测两个条件下差异表达基因的真阳性率。虚线表示80%的真阳性率。此处还展示了相应的假阳性发现率及相同的四种模拟结果。

虚线表示 10% 的错误发现率。图中显示，除表达水平极低的基因外，每种条件下 70 个尾尖样本量足以检测到差异表达基因。为实现适当的同步化，需确保培养板上仅有胚胎存在。

为防止样品损失，应将引物混合液直接移液至帽盖内 PEN 膜的区域，并在关闭帽盖时格外轻柔。由于该方法不依赖物种，我们可利用此方案研究不同物种中同源结构的基因调控网络是如何演化的。