Name: 量化Cu（II）和肽残基在存在和不存在发色团的情况下的结合相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习使用电子吸收光谱和等温滴定量热法研究Cu(II)与肽和蛋白质的结合热力学。这些正交技术相互补充，可深入了解金属-肽相互作用的热力学机制，为生物化学和生物物理学研究提供可靠框架。

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SC 感谢怀特黑德暑期研究奖学金的支持。MJS 感谢旧金山大学的启动资金和教师发展基金。MCH 承认获得美国国立卫生研究院（NIH MIRA 5R35GM133684-02）和美国国家科学基金会（NSF CAREER 2048265）的资助。

1. 电子吸收光谱法：含缓冲液竞争的直接滴定
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>使用超纯水（电阻率 >18 MΩ）配制 pH 7.4 的 50 mM 2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇（bisTris）缓冲溶液。通过高亲和力树脂孵育至少 2 小时以去除痕量金属离子，随后进行过滤。</li>
		<li>将已知量的肽溶解或稀释于去金属离子缓冲液中。 
		注：当监测摩尔吸光系数较小的 d-d 跃迁吸收带时21，需使用较高浓度的肽。本实验中，缓冲液中 C-肽的终浓度为 300 µM（体积取决于比色皿大小）。C-肽通过固相肽合成法制备，具体方法见其他文献14。</li>
		<li>将已知质量的 CuCl2 溶解于超纯水中，配制成 10–15 mM 的溶液。 
		注：初始应将金属盐溶解于非缓冲水中，以防止沉淀。也可使用其他 Cu(II) 盐，但需注意阴离子应为弱配位性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验
	<ol>
		<li>打开紫外-可见分光光度计，使用前预热约 15–20 分钟。启动仪器配套软件，设置参数，如扫描范围（200–900 nm）、扫描速度（200 nm/s）及双光束基线校正（更多参数见补充文件）。</li>
		<li>在光路中不放置比色皿或样品，采集基线。</li>
		<li>在双光束分光光度计中使用两个匹配的比色皿，一个加入 115 µL 超纯水，另一个加入 115 µL 肽样品。确保比色皿内无气泡，以免干扰信号。</li>
		<li>将装有超纯水的比色皿置于参比光束，装有肽样品的比色皿置于样品光束。</li>
		<li>采集去金属（apo）肽的吸收光谱。</li>
		<li>向装有肽样品的比色皿中加入亚化学计量的 Cu(II) 溶液（0.5 当量，150 µM）。确保加入体积小于 3 µL，并记录该体积以供后续分析。</li>
		<li>轻柔吹打混匀溶液，避免产生气泡。让溶液反应并平衡 5 分钟后，记录吸收光谱。</li>
		<li>重复步骤 1.2.6 的 Cu(II) 分步加入操作，依次加入以下当量的 Cu(II)：1.0、1.5、2.0、3.0 和 5.0（即终浓度分别为 300、450、600、900 和 1,500 µM）。务必记录累计加入的 Cu(II) 体积及比色皿中总体积。 
		注：若需更高分辨率，可减小当量之间的间隔。</li>
		<li>取出样品比色皿，并按照制造商说明彻底清洗。</li>
		<li>加入不含肽的缓冲液，记录吸收光谱。重复步骤 1.2.5–1.2.8 的 Cu(II) 分步加入操作，每次加入后均记录相应当量下的吸收光谱。</li>
		<li>将所有光谱导出为 csv 文件以供处理。根据制造商说明彻底清洗比色皿，并关闭分光光度计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理
	<ol>
		<li>将所有光谱数据导入电子表格程序。</li>
		<li>从其余各光谱中减去仅含缓冲液（0 µM Cu(II)）的光谱，以消除缓冲液自身可能产生的吸光特征。</li>
		<li>对每条光谱进行归一化处理，以校正因加入 Cu(II) 溶液导致的稀释效应（见步骤 1.2.6）。归一化方法示例见补充文件公式（1）14，其中 vinitial 为加入比色皿的肽体积（115 µL），vCu(II) 为步骤 1.2.6 中加入的 Cu(II) 溶液体积，Absbuffer subtracted spectrum 为步骤 1.2.7 获得的数据。</li>
		<li>将所有光谱绘于同一图中，以识别变化区域。 
		&#8203;注：Cu(II) 配合物典型的 d-d 跃迁吸收带位于 500–750 nm 范围。由于 d-d 跃迁为八面体构型中的 Laporte 禁阻跃迁，其摩尔吸光系数较小，因此该光谱滴定可能具有挑战性21。若吸光度太弱，可采用另一种策略：使用生色配体，其与 Cu(II) 结合后产生电荷转移吸收带（见第 2 节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 电子吸收光谱法：染料配体与肽的竞争
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将1,10-菲咯啉（phen）溶解于超纯水中，得到终浓度约为1 mM的溶液。</li>
		<li>除第1.1节中所述的肽（步骤1.1.2）和Cu(II)（步骤1.1.3）的样品制备外，另在缓冲液中配制10 µM Cu(II)和40 µM phen的溶液（[Cu(phen)3]2+）。确保溶液体积足以填满比色皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验
	<ol>
		<li>启动电子吸收分光光度计，操作同步骤1.2.1和1.2.2，但将扫描范围设为200–400 nm。</li>
		<li>在两个匹配的比色皿中，一个加入115 µL超纯水，另一个加入115 µL [Cu(phen)3]2+溶液。将盛水的比色皿置于参比光路，盛[Cu(phen)3]2+溶液的比色皿置于样品光路。</li>
		<li>采集金属-配体配合物的吸收光谱。</li>
		<li>向[Cu(phen)3]2+溶液中加入化学计量比（≈1当量，≈10 µM）的肽。轻轻吹打混匀，注意避免引入气泡。记录所加肽的体积，以供后续分析使用。 
		注：使用容量为115 µL的比色皿时，加入3.83 µL 300 µM肽溶液，可得终浓度为9.7 µM的肽。</li>
		<li>孵育溶液5分钟以达到平衡。记录吸收光谱。 
		注：若金属-肽与金属-配体的结合亲和力相近，则需加入大量过量的肽。务必考虑所加肽的总体积，以便进行归一化校正。</li>
		<li>继续向[Cu(phen)3]2+溶液中分次加入肽，使加入的肽当量依次约为：2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、22和26。记录每次加入的肽体积，以便确定稀释后的浓度。</li>
		<li>取出样品，按照制造商说明彻底清洗比色皿。采集缓冲液的光谱，以及缓冲液中50 µM肽的光谱。</li>
		<li>将所有数据导出为csv文件以供处理，并按照制造商说明清洗比色皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理
	<ol>
		<li>在电子表格程序中载入光谱数据，并从其他光谱中减去缓冲液的光谱。</li>
		<li>根据补充文件中的公式（2）14对光谱进行归一化处理。</li>
		<li>利用[Cu(phen)3]2+在265 nm处的摩尔吸光系数（εmax = 90,000 M-1cm-1）22，确定每次加入肽后[Cu(phen)3]2+的浓度。</li>
		<li>对于每次加入的肽，通过从初始[Cu(phen)3]2+浓度（0 µM肽时）减去步骤2.3.2中测定的剩余[Cu(phen)3]2+浓度，计算Cu(II)-肽配合物的浓度。</li>
		<li>根据补充文件中的公式（3）14计算游离phen配体的浓度。</li>
		<li>使用补充文件中的公式（4）14计算游离肽的浓度，其中[peptide]stock表示加入比色皿中的未稀释肽储备液，V1表示加入的肽储备液体积，V2表示比色皿的总体积，[Cu2+-peptide]由步骤2.3.4确定。</li>
		<li>使用补充文件中的公式（5）23计算实验测得的结合亲和力（Kex）。</li>
		<li>根据补充文件中的公式（6）23将Cu(II)-肽的解离常数与Kex关联，其中Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9（见22）。从所有测定的解离常数中计算平均值和标准偏差。 
		&#8203;注：在phen:Cu(II)为4:1的条件下，溶液中存在[Cu(phen)3]2+、[Cu(phen)2]2+和[Cu(phen)]2+，肽将优先从结合最弱的物种[Cu(phen)]2+中螯合出Cu(II)22。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 等温滴定热力学
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>使用超纯水配制 15 mM 3-吗啉丙烷-1-磺酸（MOPS）缓冲溶液，pH 调至 7.4&#62;18 M&#937; 抗性）。通过高亲和树脂孵育至少 2 h 以去除痕量金属离子，随后使用 0.45 μm 瓶顶滤器进行真空过滤 &#181;m 膜</li>
		<li>溶解已知质量的 CuCl₂·2H₂O，用超纯水配制成 10 mM 的储备溶液2 在超纯水中溶解以制备溶液 &#8776;50-100 mM。将该Cu(II)溶液用缓冲液稀释，得到体积为1.0 mL、Cu(II)终浓度为1.4 mM的溶液。记录所用CuCl₂的准确体积。2 所用溶液。</li>
		<li>将肽溶液用缓冲液溶解或稀释至 450 &#181;L 的 154 &#181;M 肽溶液。确保加入与 3.1.2 步骤中相同比例的额外超纯水至肽溶液中，以降低稀释热并提高信噪比。</li>
		<li>样品制备完成后，确保溶液处于相同的pH值，必要时进行相应调整。</li>
		<li>可选步骤：对溶液进行脱气，以尽量减少等温滴定量热法（ITC）中引入的微小气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验
	<ol>
		<li>打开等温滴定量热仪（ITC），启动ITC软件以运行仪器。等待首次初始化完成，系统将提示重新校准滴定管；随后按照屏幕上的指示进行操作。</li>
		<li>从参比池中移去盖子，清除参比池中的任何水分，并用450 &#181;L 的脱气超纯水</li>
		<li>缓慢吸取超纯水至450 &#181;加载注射器的 L 标记处，注意不要将气泡引入注射器中。将加载注射器插入参比池，直至其 &#8776;距底部1 mm处缓慢注入部分溶液，直至150 &#181;L 保留在加样注射器中。快速上下移动加样注射器的活塞， &#8776;25 &#181;L 多次，以清除细胞表面附着的气泡。缓慢注入，直至推杆到达 100 &#181;L标记处，从而分配出总共350 &#181;将超纯水加入参考池中，并盖上参考池盖。</li>
		<li>去除样品池中的残留溶液，并加入450 &#181;使用装有10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的上样注射器清洗1 L，浸泡10分钟，以确保去除痕量金属离子，因为EDTA会结合这些痕量金属。</li>
		<li>移除含有结合的痕量金属离子的EDTA溶液，并用大量超纯水彻底冲洗上样注射器。</li>
		<li>按照制造商的说明清洗等温滴定量热仪，用超纯水冲洗样品池。</li>
		<li>用450 μL的溶液冲洗样品池以进行预处理 &#181;缓冲液至少冲洗3次。</li>
		<li>移除用于平衡样品池的缓冲液。使用加样注射器将肽溶液加入样品池中（遵循步骤3.2.3）。</li>
		<li>用200 μL的溶液冲洗滴定注射器 &#181;缓冲溶液的 L。为此，先取出活塞，然后使用移液器将缓冲液通过玻璃滴定注射器顶部的孔注入，使其流经注射器并从下方的针头排出。</li>
		<li>将活塞完全插入滴定注射器中。</li>
		<li>将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，缓慢向上拉动活塞，使金属溶液充满注射器并产生结果&#160;位于滴定注射器玻璃部分顶部的空腔内。将滴定注射器旋转至与地面平行，拔出推杆，轻轻将玻璃部分向地面方向倾斜，以尽量减少空腔体积。轻轻摇动滴定注射器，使溶液移至玻璃部分末端并填充大部分空腔，但需确保留有2-3 &#181;空体积剩余 L。保持注射器与地面平行，重新插入活塞。</li>
		<li>将滴定注射器竖直握住，将针头末端重新浸入金属溶液中，推动活塞直至针头不再有气泡排出。通过缓慢向上拉动活塞至略高于50 μL刻度处，完成滴定注射器的加样。 &#181;L 标记，同时保持针尖位于溶液中。</li>
		<li>小心将滴定管注射器的玻璃部分插入滴定管中，并拧紧至手指拧不动为止。当因活塞受压而有少量溶液从滴定管注射器针尖流出时，使用轻型精细擦拭纸小心吸去溶液，注意不要触碰针尖。</li>
		<li>将装有滴定注射器的滴定管插入样品池中，并牢固固定。</li>
		<li>在ITC软件中设置参数。从 仪器控制，设置 搅拌速率 （典型的搅拌速率范围为 150 至 350 RPM）以及 温度 实验将在此温度下进行（通常为25 &#176;C）。输入 注射器 和 细胞浓度 在 毫摩尔单位 在……之下 实验细节.</li>
		<li>在 实验方法 部分，选择 逐级滴定. 单击 设置 并指定 20次注射 的 2.5 &#181;L如果需要更高分辨率以观察结合事件，可增加注射次数并减少每次注射的体积。输入 时间间隔 每次注射之间留出足够长的时间，以确保信号达到平衡并恢复至基线水平，通常 300 秒.</li>
		<li>点击 运行 单击按钮以开始实验，并指定数据保存位置。</li>
		<li>实验结束后，清洗样品池和滴定注射器。</li>
		<li>所有实验至少重复三次，以确保数据采集的精确性。</li>
		<li>进行对照实验，将金属溶液滴定至缓冲溶液中（不含肽），以确保金属离子稀释热较小，且不存在未被计入的平衡体系。若稀释热较大，可考虑更换缓冲体系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理
	<ol>
		<li>启动等温滴定 calorimetry 分析软件并加载数据文件以进行分析。</li>
		<li>导航至 基线 切换并检查热图。注意热图中是否存在由气泡或其他伪影引起的外源性热量释放或吸收。查找非金属溶液注射所导致的尖峰。</li>
		<li>确保分析软件生成的基线跟随注射后并达到平衡的数据部分。如果出现偏离，则使用 基线枢轴点 调整基线。确保 积分区域 包含金属注射产生的峰，但遮蔽步骤2中热图里发现的任何气泡或伪影。从热图中减去基线。 
		注意：只有在收集了多个热谱图之后，才建议进行此类操作，因为实验者需要先明确哪些是真实数据，哪些是人为假象，以便调整基线和 积分区域 可能会极大地影响数据。</li>
		<li>导航至 建模 窗口以开始拟合数据，分析软件将显示每次加样后经积分并归一化浓度的数据。</li>
		<li>左键单击第一次注射的数据点，将其从拟合算法中移除。 
		注意：这种情况较为常见，因为在滴定剂与样品池溶液之间可能存在轻微混合，导致第一次注入时摩尔量分配不精确。</li>
		<li>在 模型 部分，选择 空白（恒定） 在 格式 下拉菜单，该菜单基于最后一次注射的焓变，将从每个数据点中扣除，以校正稀释热的影响。此外，选择 独立 （或该系统的最佳模型）在第二步 样式 下拉菜单以拟合数据。 
		注：对于标准的1:1结合相互作用，最常用的模型是独立模型。</li>
		<li>使用绿色按钮，通过两个模型对数据进行拟合 发挥 按钮与一个 &#931;. 
		注意：另一种用于处理ITC数据的软件是SEDPHAT24.</li>
		<li>在事后分析中考虑 Grossoehme 等人先前报道的所有竞争平衡.20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无竞争利益。

本文提供了一种用于定量测定 Cu(II) 与肽结合的亲和力及热力学参数的可靠方法。由于 Cu(II) 具有 d9 电子构型，其金属位点的 d-d 吸收带非常适合通过光谱进行监测。尽管其摩尔吸光系数较小，因而需要较高浓度的配合物才能获得可靠的信号，但将 Cu(II) 滴定至肽溶液中可快速获得结合化学计量比和近似结合亲和力的信息。然而，若金属被缓冲液和肽以相似的配位原子和几何构型所结合，则光谱差异可能难以分辨。为了定量测定结合亲和力，通常使用苯菲罗啉（phen）等生色配体，因其与金属离子之间存在对称性允许的电荷转移跃迁21。通过构建生色配体与非生色肽之间的竞争结合体系，并已知金属与该配体的结合亲和力，可直接测定金属-肽的结合亲和力。进一步利用电子吸收光谱法进行热力学分析则较为困难。若采用紫外-可见（UV-Vis）光谱等技术来量化结合焓变，必须在多个温度下测定结合亲和力，并进行范特霍夫（van't Hoff）分析。该分析假设结合过程的热容变化为零，但这一假设极少成立，因此仅能提供结合焓变的估算值20。
<p class...

生物学已进化出利用生命所需的金属离子多样化学性质的能力，以适应并存活于周围环境。据估计，25%至50%的蛋白质在结构和功能上依赖金属离子1金属离子的特定作用及其氧化还原状态与其配位的生物配体的组成和几何结构直接相关。此外，对于铜离子（Cu(II)）等具有氧化还原活性的金属离子，必须进行严格调控，以防止其与氧化剂发生相互作用。 通过 类芬顿化学反应生成活性氧（ROS）2,3,4理解其生物化学过程中结合模式与亲和力的作用机制，将有助于阐明该金属离子的生物学功能。
研究金属与肽结合相互作用的方法有多种，主要包括光谱学技术，也包括分子动力学计算机模拟，例如通过分子动力学模拟研究Cu(II)与β-淀粉样蛋白片段（Aβ）的相互作用5。核磁共振（NMR）是一种广泛使用且许多高校均可开展的光谱学技术。Gaggelli等人利用Cu(II)的顺磁性，通过观察邻近原子核的弛豫效应，确定了金属离子在肽上的结合位点6。电子顺磁共振（EPR）也可用于探究顺磁性金属离子的结合位置及其结合模式7。其他光谱学技术，如圆二色光谱（CD），可用于描述三肽体系等系统中Cu(II)的配位结构8；而质谱法可通过碎片化模式揭示金属离子与哪些残基配位以及其化学计量关系9,10。
其中一些技术（如核磁共振，NMR）无需标记，但需要高浓度的肽，这为研究带来了挑战。另一种常用的技术是荧光光谱法，已被用于研究酪氨酸或色氨酸的位置与 Cu(II) 淬灭之间的关系11,12。类似地，该技术也可用于显示由于 Cu(II) 结合所引起的空间结构变化13。然而，这些金属-肽结合研究存在的问题是：它们依赖于含有生色氨基酸（如酪氨酸）的体系，而并非所有肽都含有此类氨基酸；此外，这些研究通常假设金属离子遵循经典的结合模型，且该技术可能不适用于生理条件。事实上，目前已发现多种肽既不含此类生色氨基酸，也不遵循经典的结合模型，因此限制了上述技术的应用14,15。本文详细介绍了在生理相关条件下评估这些特殊情况下结合特性的研究方法。
生物配体可能呈现不同的质子化状态，从而影响金属离子的结合，例如组氨酸上的咪唑环。如果pH值不能保持恒定，实验结果可能会变得复杂或相互矛盾。因此，缓冲液是研究金属-蛋白质/肽相互作用的重要组成部分。然而，许多缓冲液已被证明会与金属离子发生有利的相互作用16,17。除了与目标生物分子竞争结合金属离子外，缓冲液可能含有与肽或蛋白质中配位原子相似的配位原子，难以区分。本研究重点关注电子吸收光谱法和等温滴定量热法（ITC）作为研究Cu(II)-肽相互作用的两种互补技术，并特别考虑了缓冲液的选择问题。
电子吸收光谱是一种快速且广泛应用的技术，可用于研究金属结合相互作用。使用紫外（UV）或可见光波长的光照射时，可导致金属中心的d-d跃迁吸收带，从而提供有关配体分类、金属几何构型以及表观结合亲和力的重要信息18,19。对于这些配合物，通过将金属离子直接滴定至蛋白质或肽溶液中，可定量测定其结合化学计量比和表观结合亲和力。在某些情况下，例如d5或d10电子构型，配合物不吸收光（即在光谱上无信号）。对于这类光谱学上“沉默”的过渡金属配合物，可通过使用一种竞争性配体来克服这些限制，该配体在与金属离子配位后会产生可检测的电荷转移吸收带。无论哪种情况，该方法仅能用于定量化学计量比和表观结合亲和力，若无近似假设，则无法提供关于结合焓的任何信息。
与电子吸收光谱法获得的信息相辅相成，等温滴定量热法（ITC）是一种直接且严格量化结合焓变的吸引人技术20。ITC 可直接测量结合过程中释放或消耗的热量，由于滴定过程在恒定压力下进行，所测得的热量即为所有平衡的焓变（ΔHITC）。此外，该方法还可量化结合事件的化学计量比（n）和表观结合亲和力（KITC）。基于这些参数，可进一步确定自由能（ΔGITC）和熵变（ΔSITC），从而提供结合事件的完整热力学图景。由于不依赖光吸收，ITC 特别适用于光谱学上“静默”的物种，例如 d5 或 d10 金属离子配合物。然而，由于量热法测量的是热量，任何未匹配的缓冲体系或未被计入的平衡都可能对准确测定金属离子结合热力学产生不利影响，因此必须高度重视并妥善处理这些因素20。若以适当严谨性操作，ITC 是测定金属-蛋白质/肽复合物热力学性质的一种可靠技术。
本文利用一种无生色团的铜结合肽C-肽，展示了两种技术的互补应用。C-肽是胰岛素成熟过程中产生的一种由31个残基组成的裂解产物（EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ）；该肽不含生色团残基，但已被证明能够以生理相关的亲和力结合Cu(II)14,15。Cu(II)结合位点由一个谷氨酸和一个天冬氨酸的侧链以及肽链的N-末端组成14,15。这些配位原子与许多常用缓冲体系中的配位原子非常相似。本文展示了电子吸收光谱中d-d跃迁和电荷转移带与等温滴定量热法（ITC）联用，用于定量测定C-肽结合Cu(II)的热力学参数。该研究Cu(II)与C-肽结合的方法可推广应用于其他金属离子及蛋白质/肽体系。

<table><tbody><tr><td>1,10-邻菲罗啉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>双-Tris缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式0.45微米膜过滤器</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>任何能够去除树脂且不引入污染物的过滤系统均可接受</td></tr><tr><td>氯化铜(II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>电子吸收分光光度计</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>其他合适的高灵敏度分光光度计也可接受</td></tr><tr><td>高亲和力树脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>等温滴定微量热仪（ITC）</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Low Volume</td><td></td></tr><tr><td>ITC分析软件</td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT（&lt;em&gt;Methods&lt;/em&gt;. &lt;strong&gt;2015&lt;/strong&gt;, 76: 137&amp;ndash;148）也可使用</td></tr><tr><td>ITC仪器控制软件</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>轻质精密擦拭纸</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>加样注射器</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td>配对石英比色皿</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>确保小体积比色皿的窗口与分光光度计光束高度匹配</td></tr><tr><td>MOPS缓冲液</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计软件</td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>电子表格程序</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>任何合适的电子表格程序均可使用</td></tr><tr><td>滴定注射器</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>只要电阻率&gt;18 M&amp;Omega;，任何水源均可</td></tr></tbody></table>

量化在有无发色团存在下cu(ii)与肽残基之间的结合相互作用

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

铜(II) 是生物系统中一种必需的金属元素，能够赋予与其相互作用的生物分子独特的化学性质。已有研究报道，铜(II) 可直接结合多种肽类，在从介导分子结构、电子转移特性到赋予催化功能等过程中发挥必要及病理性的生物学作用。定量测定这些 Cu(II)-肽复合物的结合亲和力与热力学参数 体外 可揭示结合过程的热力学驱动力、不同金属离子对肽的竞争作用或不同肽对Cu(II)的竞争作用，以及Cu(II)-肽复合物的稳定性和存在优势 体内然而，由于存在多种因素，对结合热力学进行量化可能具有挑战性，包括在滴定实验中需考虑所有竞争平衡，尤其是在缺乏能够分别代表肽、d区金属离子及其相互作用的明确光谱信号时。
本文提供了一套可靠的实验方法，用于精确量化 Cu(II)-肽的热力学参数。文章重点介绍了在有或无发色配体的条件下，利用电子吸收光谱法对 Cu(II) 进行光谱检测，以及采用无标记等温滴定 calorimetry（ITC）的方法。在这两种实验技术中，均描述了如何考虑所有竞争平衡过程的分析流程。尽管本文主要关注 Cu(II)，但所描述的实验体系不仅适用于 Cu(II)-肽相互作用，还可为在生理相关条件下准确量化其他金属-肽体系提供通用框架。

本研究旨在利用电子吸收光谱和等温滴定量热法（ITC）这两种互补技术，定量分析并验证Cu(II)与C肽结合的热力学特性。由于电子吸收光谱具有较强的稳健性，因此直接对300 µM C肽溶液进行Cu(II)滴定（图1）。加入150 µM Cu(II)后，600 nm处的吸收带立即增强，该吸收带归属于Cu(II)的d-d跃迁带，并随着Cu(II)浓度增加至300 µM持续增强。当Cu(II)浓度超过300 µM后，d-d带的吸收不再增加，表明结合已达到饱和，且Cu(II)与C肽形成1:1的络合物。此外，由于双-Tris与Cu(II)具有较高的结合亲和力（log K = 5.27）16，因此Cu(II)/C肽的结合亲和力下限应处于微摩尔范围（log K > 6），才能将金属离子从缓冲液中螯合出来。然而，在该体系中，由于摩尔吸光系数较小，对吸收带进行精确定量存在困难。
为了克服d-d跃迁带消光系数较小的问题，采用了上述的生色配体phen。将C肽滴加到约10 µM的[Cu(phen)<su...

本文重点介绍利用电子吸收光谱法和等温滴定热法来研究并量化 Cu(II) 与肽和蛋白质结合的热力学过程。

量化在有无发色团存在下Cu(II)与肽残基之间的结合相互作用

铜(II)是生物系统中一种必需的金属元素，能够赋予与其相互作用的生物分子独特的化学性质。它已……

该方法可使研究人员深入探究难以研究的体系，例如肽类和第一过渡系金属离子，而这些体系通常难以通过更常规的方法进行研究。此处的主要优势在于采用正交技术，因为这些技术能够相互补充，从而更深入地理解体系，并帮助我们避免遗漏任何现象。本视频中详细介绍的这一方法非常适用于研究其他体系。尽管我们以铜离子（Cu(II)）和一种肽为例进行展示，但该方法也可用于多种不同的金属-肽及金属-蛋白质相互作用研究。我认为最具挑战性的部分是为你的金属离子和肽选择一种合适的缓冲体系。建议查阅相关文献，参考他人此前所使用的缓冲液。演示该实验步骤的是我研究实验室的研究生 Sohee Choi。首先，打开电子吸收光谱仪，使用前需预热约15至20分钟。然后启动光谱仪软件，并设置参数，如扫描范围为200至900纳米，扫描速度为每秒200纳米，采用双光束基线校正。接下来，在光路中不放置比色皿或样品，采集基线。使用双光束分光光度计中的两个匹配的比色皿，一个比色皿中加入115 µL超纯水，另一个比色皿中加入115 µL肽样品，同时确保比色皿内无气泡，因为气泡会干扰信号。随后，将装有超纯水的比色皿置于参比光路，将装有肽样品的比色皿置于样品光路。然后收集无金属肽的吸收光谱。向装有肽样品的比色皿中加入亚化学计量的 Cu(II) 溶液，并记录加入体积以供后续分析。轻轻反复吹打混合溶液，避免产生气泡。平衡五分钟后，将比色皿重新放入样品池架中，记录吸收光谱。然后向肽溶液中逐次加入不同当量的Cu(II)溶液，记录加入比色皿的Cu(II)总体积。按照前述方法初始化软件后，在两个匹配的比色皿中，一个加入115 µL超纯水，另一个加入115 µL铜-邻菲罗啉络合物溶液。将装有水的比色皿放入参比光路，装有铜-邻菲罗啉络合物溶液的比色皿放入样品光路，然后采集该金属配体络合物的吸收光谱。随后，向铜-邻菲罗啉络合物溶液中加入化学计量的肽段，并用移液器轻轻吹打混合均匀，注意避免引入气泡。接着，将溶液孵育5分钟以达到平衡。将比色皿重新放入样品池支架中，并记录吸收光谱。随后，向铜-邻菲罗啉复合物溶液中分次加入不同当量的肽段 aliquot，并记录所加入肽段的体积，以便确定稀释后的浓度。首先打开等温滴定量热仪（ITC）并启动ITC软件以运行仪器。完成首次初始化后，重新校准滴定管位置，并按照屏幕上的提示进行操作。然后取下参比池的滴定管和盖子。接下来，将参比池中的水全部移除，并用450微升脱气超纯水冲洗三次。缓慢吸取超纯水至加样注射器的450微升刻度线处，注意避免将气泡引入注射器中。然后将加样注射器插入参比池，直至其距离池底约1毫米处，缓慢注入部分溶液，直至加样注射器中剩余150微升溶液为止。随后，将上样注射器的活塞快速上下移动约25微升数次，以去除细胞表面附着的任何气泡。然后缓慢注入，直至活塞到达上样注射器上的100微升刻度处，从而向参比池中加入总共350微升超纯水，并重新盖上参比池盖。从样品池中清除残留溶液后，使用上样注射器加入450微升10毫摩尔EDTA溶液，浸泡10分钟，以确保去除痕量金属离子，因为EDTA会结合这些痕量金属。彻底去除EDTA溶液后，用大量超纯水充分冲洗上样注射器。按照仪器制造商的说明，用超纯水冲洗样品池以清洁等温滴定量热仪（ITC）。从样品池中移除残留的水分，然后用450微升缓冲液至少冲洗三次，对样品池进行平衡处理。接下来，移除用于平衡样品池的残余缓冲液，并使用加样注射器将肽溶液加入样品池中。然后用200微升缓冲溶液冲洗滴定注射器：首先取出活塞，再用微量移液器将缓冲液从玻璃滴定注射器顶部的小孔注入，使液体流经注射器并从下方的针头排出。随后，将推杆完全插入滴定注射器中。然后将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，缓慢向上拉动推杆，使金属溶液充满注射器，导致滴定注射器玻璃部分顶部出现空隙体积。为消除该空隙体积，将滴定注射器旋转至与地面平行。然后取下活塞，并将滴定注射器的玻璃部分稍向地面倾斜。轻轻摇动滴定注射器，使溶液流入其玻璃部分并填充大部分空体积，但需确保仍保留 2 至 3 微升的空体积。保持注射器与地面平行，重新插入活塞。然后将滴定注射器竖直向上，将针头尖端再次浸入金属溶液中。接着推动活塞，直至针头不再有气泡排出，并在保持针头尖端始终浸没在溶液中的条件下，缓慢向上拉动活塞，使液面略高于50 µL刻度，完成滴定注射器的上样。将滴定注射器的玻璃部分小心插入滴定管中，并用手拧紧。随后，使用轻型精细擦拭纸吸收因活塞压缩而从滴定注射器针尖渗出的溶液，注意不要触碰针尖。接下来，将装有滴定注射器的滴定管插入样品池中，并牢固固定。设置ITC软件参数时，选择仪器控制，设定搅拌速率和温度。然后在实验详情下，输入注射器和样品池的浓度，单位为毫摩尔（millimolar）。接下来，在实验方法部分选择逐步滴定法。点击“设置”，指定进行20次注射，每次2.5 µL；如果需要更高的分辨率以观察结合事件，可增加注射次数并减少每次注射的体积。随后，输入每次注射之间的时间间隔，确保时间足够长，使信号能够达到平衡并恢复至基线水平，通常为300秒。然后点击运行按钮以开始实验，并指定数据保存的位置。将 Cu(II) 滴定至 C-肽中，结果表明，加入 150 微摩尔的 Cu(II) 后，在 600 纳米处的吸收带立即增强，该吸收带归属于 Cu(II) 的 d-d 跃迁带，并随着 Cu(II) 加入量增至 300 毫摩尔持续增强。当 Cu(II) 浓度超过 300 微摩尔后，d-d 跃迁带的吸收不再增加，表明结合已达到饱和，Cu(II) 与 C-肽以 1:1 的比例形成配合物，其 log K 值大于 6。将C-肽滴定至约10微摩尔的铜-菲咯啉复合物中，265纳米处电荷转移带的吸收降低，表明C-肽能够从菲咯啉配体中螯合Cu(II)，其log K值为7.4至7.8。ITC热谱图显示了将1.4毫摩尔Cu(II)滴定至154微摩尔C-肽的15毫摩尔MOPS缓冲液中的过程。测得结合亲和力的log K值为8，焓变值为8千焦每摩尔。吉布斯自由能为 -46 千焦每摩尔，熵变为 120 焦每摩尔每开尔文。在没有 C-肽的情况下，将 1.4 毫摩尔 Cu(II) 滴定至 15 毫摩尔 MOPS 缓冲液中的受控滴定实验显示，等温滴定量热图中无结合信号。我会说，务必确保所有物品清洁。如果前次实验中残留有金属离子或肽段，则可能显著影响化学计量比，并在结合实验中引入未知的竞争效应。圆二色光谱是研究金属-肽或金属-蛋白质相互作用的另一种方法，因为它可检测手性。质谱技术也可通过分析质量变化来研究这些复合物。许多研究金属离子与肽或蛋白质相互作用的实验室已采用这一系列技术。

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

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科研

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生物化学

量化Cu（II）和肽残基在存在和不存在发色团的情况下的结合相互作用

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学习使用电子吸收光谱和等温滴定量热法研究Cu(II)与肽和蛋白质的结合热力学。这些正交技术相互补充，可深入了解金属-肽相互作用的热力学机制，为生物化学和生物物理学研究提供可靠框架。

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