量化在有无发色团存在下 Cu(II) 与肽残基之间的结合相互作用

该方法可使研究人员深入探究难以研究的体系，例如肽类和第一过渡系金属离子，而这些体系通常难以通过更常规的方法进行研究。此处的主要优势在于采用正交技术，因为这些技术能够相互补充，从而更深入地理解体系，并帮助我们避免遗漏任何现象。本视频中详细介绍的这一方法非常适用于研究其他体系。

尽管我们以铜离子（Cu(II)）和一种肽为例进行展示，但该方法也可用于多种不同的金属-肽及金属-蛋白质相互作用研究。我认为最具挑战性的部分是为你的金属离子和肽选择合适的缓冲体系。建议查阅文献，了解此前其他研究者所使用的缓冲液类型。

演示该实验步骤的是我研究实验室的研究生Sohee Choi。首先，打开紫外-可见分光光度计，开机后预热约15至20分钟，然后启动分光光度计软件，设置参数，包括扫描范围为200至900纳米、扫描速度为每秒200纳米，并采用双光束基线校正。

接下来，在光路中不放置任何比色皿或样品，采集基线。使用双光束分光光度计中的两个匹配的比色皿，向其中一个加入115 µL超纯水，向另一个加入115 µL肽样品，同时确保比色皿中无气泡，因为气泡会干扰信号。随后，将装有超纯水的比色皿放入参比光束位置，将装有肽样品的比色皿放入样品光束位置。

然后收集无金属肽的吸收光谱。向装有肽样品的比色皿中加入亚化学计量的 Cu(II) 溶液，并记录加入体积以供后续分析。轻轻吹打混合溶液，避免产生气泡。

平衡五分钟后，将比色皿重新放入样品池架中，记录吸收光谱。然后向肽溶液中重复加入不同当量的Cu(II)等分试样，并记录加入比色皿中的Cu(II)总体积。按照前述方法初始化软件后，在两个匹配的比色皿中，一个加入115 µL超纯水，另一个加入115 µL铜-邻菲罗啉复合物溶液。

将装有水的比色皿放入参比光路，装有铜-邻菲罗啉络合物溶液的比色皿放入样品光路，然后采集该金属配体络合物的吸收光谱。随后，向铜-邻菲罗啉络合物溶液中加入化学计量的肽段，轻轻吹打混匀，确保混合充分，同时注意避免引入气泡。

接着，将溶液孵育5分钟以达到平衡。将比色皿重新放入样品池支架中，并记录吸收光谱。随后，向铜-邻菲罗啉复合物溶液中逐次加入不同当量的肽段 aliquot，并记录所加入肽段的体积，以便确定稀释后的浓度。

首先打开等温滴定量热仪（ITC）并启动ITC软件以运行仪器。完成首次初始化后，重新校准滴定管位置，并按照屏幕上的提示进行操作。然后取下参比池的滴定管和盖子。

接下来，将参比池中的水全部移除，并用450微升脱气超纯水冲洗三次。缓慢吸取超纯水至加样注射器的450微升刻度线处，注意避免将气泡引入注射器中。然后将加样注射器插入参比池，直至距离池底约1毫米处，缓慢注入部分溶液，直至注射器中剩余150微升溶液为止。

随后，将上样注射器的推杆快速上下移动数次，每次约25微升，以去除细胞表面附着的任何气泡。然后缓慢注入，直至推杆到达上样注射器上的100微升刻度处，从而向参比池中加入总共350微升超纯水，并重新盖上参比池盖。从样品池中清除残留溶液后，使用上样注射器加入450微升10毫摩尔EDTA溶液，浸泡10分钟，以确保痕量金属离子被完全去除，因为EDTA可与痕量金属结合。

彻底去除EDTA溶液后，用大量超纯水彻底冲洗上样注射器。按照制造商的说明，用超纯水冲洗样品池以清洁等温滴定量热仪（ITC）。从样品池中除去任何残留的水分，然后用450微升缓冲液至少冲洗三次，对样品游戏副本进行平衡处理。

接下来，移除用于平衡样品池的残余缓冲液，并使用加样注射器将肽溶液加入样品池中。然后，先取出活塞，用200微升缓冲溶液冲洗滴定注射器。使用微量移液器，将缓冲液从玻璃滴定注射器顶部的小孔注入，通过注射器，从下方的针头排出。

随后，将推杆完全插入滴定注射器中。然后将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，缓慢向上拉动推杆，使金属溶液充满注射器，导致滴定注射器玻璃部分顶部出现空隙体积。为消除该空隙体积，将滴定注射器旋转至与地面平行。

然后取下活塞，并将滴定注射器的玻璃部分稍微向地面倾斜。轻轻摇动滴定注射器，使溶液流入其玻璃部分并填充大部分空体积，但需确保仍保留 2 至 3 微升的空体积。

保持注射器与地面平行，重新插入活塞。然后将滴定注射器竖直向上，将针头尖端再次浸入金属溶液中。接着推动活塞，直至针头不再有气泡排出，并在保持针头尖端始终浸在溶液中的条件下，缓慢向上拉动活塞，使液面略高于50 µL刻度，完成滴定注射器的上样。

将滴定注射器的玻璃部分小心插入滴定管中，并用手拧紧至合适位置。随后，使用轻型精细擦拭纸轻轻吸去因活塞受压而从滴定注射器针尖渗出的溶液，注意不要触碰针尖。接下来，将装有滴定注射器的滴定管插入样品池中，并牢固固定。

设置ITC软件参数时，选择仪器控制，设定搅拌速率和温度。然后在实验详情下，输入注射器和样品池中物质的浓度，单位为毫摩尔（millimolar）。

接下来，在实验方法部分选择逐步滴定法。点击设置，指定进行20次注射，每次2.5 µL；如果需要更高的分辨率以观察结合事件，可增加注射次数并减少每次注射的体积。随后，输入每次注射之间的时间间隔，确保时间足够长，使信号能够达到平衡并恢复至基线水平，通常为300秒。

然后点击运行按钮以开始实验，并指定数据保存位置。将 Cu(II) 滴定至 C-肽中，结果表明，加入 150 微摩尔 Cu(II) 后，在 600 纳米处归属于 Cu(II) 的 d-d 跃迁带立即出现吸收增强，并随着 Cu(II) 浓度增加至 300 毫摩尔持续上升。当 Cu(II) 浓度超过 300 微摩尔时，d-d 跃迁带的吸收不再增加，表明结合已达到饱和，Cu(II) 与 C-肽以 1:1 的络合物形式结合，其 log K 值大于 6。

将C-肽滴定至约10微摩尔的铜-菲咯啉复合物中，265纳米处电荷转移带的吸收降低，表明C-肽能够从菲咯啉配体中螯合Cu(II)，其log K值为7.4至7.8。ITC热谱图显示了将1.4毫摩尔Cu(II)滴定至154微摩尔C-肽的15毫摩尔MOPS缓冲液中的过程。测得结合亲和力的log K值为8，焓变值为8千焦每摩尔。

吉布斯自由能为 -46 千焦每摩尔，熵变为 120 焦每摩尔每开尔文。在不存在 C-肽的情况下，将 1.4 毫摩尔 Cu(II) 缓慢滴定至 15 毫摩尔 MOPS 缓冲液中，在热图中未显示结合。我建议确保所有物品均保持洁净。

如果前次实验中残留有金属离子或肽段，则可能严重影响化学计量比，并在结合实验中引入未知的竞争效应。圆二色光谱是研究金属-肽或金属-蛋白质相互作用的另一种方法，因为它可检测手性。质谱技术也可通过分析质量变化来研究这些复合物。

许多研究金属离子与肽或蛋白质相互作用的实验室都已采用这一系列技术。