Name: 将人类牙齿中的类器官确立为机械研究和再生疗法的有力工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解如何利用人类牙齿类器官模型研究牙釉质形成过程及牙源性干细胞生物学。该技术为牙齿再生医学和疾病治疗靶点发现提供了可靠的研究工具。

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我们衷心感谢鲁汶大学医院口腔颌面外科（MKA）的所有工作人员以及患者，感谢他们在收集新鲜拔除的第三磨牙过程中提供的宝贵帮助。我们还要感谢Reinhilde Jacobs博士和Elisabeth Tijskens博士在样本采集方面给予的支持。本研究得到了鲁汶大学（KU Leuven，BOF）和弗兰德斯科学研究基金会（FWO-Flanders，G061819N）资助项目的资助。L.H. 为弗兰德斯科学研究基金会（FWO）博士研究员（1S84718N）。

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通讯作者需确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。

本方案描述了从人牙组织高效且可重复地生成类器官的方法。据我们所知，这是首个从人牙组织建立当前概念（上皮性）类器官的技术方法。这些类器官可长期扩增，并表现出牙上皮干细胞特性，重现了先前在牙囊（DF）的ERM区室中报道的DESCs7。此外，该类器官还复制了功能性DESC/ERM特征，包括启动成釉细胞分化过程7,25,26。研究结果具有高度稳健性，因为在不同患者的独立类器官系中均获得了可比较的结果19。
在执行该牙类器官方案时，需注意以下几个关键点。首先，在初始接种以及每次传代后，必须添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632，以防止单细胞发生失巢凋亡27。此外，在P0阶段的所有培养基更换过程中均需加入两性霉素B，以避免（口腔）真菌污染。第二，建议立即处...

牙齿在咀嚼食物、言语和心理福祉（自我形象）方面具有重要作用。1人类牙齿由矿化程度不同、密度和硬度各异的组织构成。牙釉质是牙冠的主要组成部分，也是人体中矿化程度最高的组织。在牙齿发育过程中，牙釉质形成（成釉作用）时，牙源性上皮干细胞（DESCs）会分化为成釉细胞（即釉质形成细胞）。一旦牙釉质形成，由于牙齿萌出初期成釉细胞发生凋亡而丢失，牙釉质极少能够被修复或再生。1目前，因外伤或细菌性疾病导致的牙釉质组织损伤主要通过使用合成材料进行修复；然而，这些材料存在诸多重要缺陷，如微渗漏、骨整合与固位能力较差、使用寿命有限，以及无法实现完全功能性修复等。2因此，建立一种稳定且可靠的人类DESCs培养体系，使其具备生成成釉细胞并产生矿化组织的潜能，将是牙科再生领域的一大重要进展。
关于人类DESC表型及其生物学功能的知识十分有限3,4,5有趣的是，有人提出人类牙齿的牙上皮干细胞（DESCs）可能存在于马拉瑟上皮剩余（ERM）中，这些细胞簇位于包围未萌出牙齿的牙囊（DF）内，并在牙齿萌出后仍存留于牙根周围的牙周膜中。1与牙髓共同培养的ERM细胞可分化为成釉细胞样细胞，并生成类釉质组织6然而，由于缺乏可靠的研究模型，对ERM细胞在釉质（再）生中具体作用的深入研究一直受到限制7当前的ERM 体外 培养系统受限于在常规使用的二维条件下细胞寿命有限且表型迅速丢失8,9,10,11,12因此，一个易于处理的 体外 迫切需要一种能够可靠地扩增、研究和诱导人源DESCs分化的系统。
在过去的十年中，一种强大的技术被用于培养上皮干细胞 体外 已成功应用于多种（人类）上皮组织，用于研究其生物学特性及疾病机制13,14,15,16该技术可使组织上皮干细胞在接种于模拟细胞外基质（ECM）的支架（通常为Matrigel）并置于模拟组织干细胞微环境信号和/或胚胎发生过程的特定培养基中培养时，自发发育形成三维细胞结构（即类器官）。类器官发育通常所需的生长因子包括表皮生长因子（EGF）和WNT信号通路激活剂。14,15,16所获得的类器官能够长期稳定地模拟原始组织的上皮干细胞特性，同时在保持其表型和功能特性的情况下具有高度可扩增性，从而克服了临床获取的原代人组织常受限的问题。建立类器官时，无需在培养前从异质性组织（即包含间充质细胞等其他细胞类型）中分离上皮干细胞，因为间充质细胞无法在细胞外基质（ECM）中贴附或生长，最终可自然形成纯上皮来源的类器官。13,16,17,18,19这一前景广阔且用途多样的技术已推动了来自多种人体上皮组织的类器官模型的开发。然而，源自人类牙齿、对牙齿发育、再生及疾病深入研究具有重要价值的牙源性类器官，迄今尚未建立。20,21我们最近成功开发出一种新的类器官模型，该模型起源于青少年患者拔除的第三磨牙（智齿）中的牙滤泡组织。19.
本文描述了从成人牙齿（即第三磨牙的牙乳头组织）建立上皮类器官培养物的实验方案（图1A）。所获得的类器官长期可扩增，并表达与牙源性上皮干细胞（ERM）相关的干性标志物。有趣的是，与大多数其他类器官模型不同，通常必需的表皮生长因子（EGF）在此类器官的稳健发育和生长过程中是冗余的。值得注意的是，这些具有干性的类器官表现出成釉细胞分化特性，从而模拟了体内（in vivo）发生的ERM/牙源性上皮干细胞（DESC）特征及相关过程。本文所描述的这一新型且独特的类器官模型，为探索DESC的生物学特性、可塑性及分化潜能提供了平台，并为迈向牙齿再生策略的第一步打开了大门。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>48 孔平底板</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（细胞培养级）</td><td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>AMELX 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15200018</td><td></td></tr><tr><td>B27（不含维生素 A）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>VWR</td><td>7202191</td><td></td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>CK14 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>分散酶 II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12（无铁）</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>高糖 DMEM 干粉</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 - 10ML</td><td></td></tr><tr><td>包埋工作站，220 至 240 Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，&amp;ge;99.8%（EtOH）</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2（= 碱性 FGF）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute 哺乳动物总 RNA 小量提取试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>包含溶于裂解缓冲液中的 1% &amp;beta;-巯基乙醇</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Niko Mechanisms</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632（ROCK 抑制剂，RI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（生长因子减少型；无酚红）</td><td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 注射器滤器，0.22&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基伊格尔（&amp;alpha;MEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG（Alexa 555）二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>P63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>防染笔（Pap Pen）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>标记笔</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA），16%</td><td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 G 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>移液器（P20、P200、P1000）</td><td>Eppendorf 或其他品牌</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管（3.5&amp;nbsp;mL）</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG（Alexa 488）二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190（p38i）</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>手术刀（手术刀片）</td><td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R&amp;D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>硅胶模具（加热块）</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO3）</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;NaO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>实时荧光定量 PCR 系统</td></tr><tr><td>Stericup-GP，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯的无菌 1000 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Greiner</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯的无菌 20 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Greiner</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>带或不带滤芯的无菌 200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 第一链合成预混液</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>组织处理仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>12505356</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂 + DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td><td>含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>5036-WN-500</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯，99%，用于生化与组织学</td><td>VWR</td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

建立人类牙齿类器官：推动机制研究与再生治疗的有力工具

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

牙齿在人类生活中具有重要作用，不仅关乎食物咀嚼和言语功能，也影响心理福祉。目前关于人类牙齿发育与生物学的知识仍十分有限，尤其是对牙源性上皮干细胞及其功能的了解甚少。我们成功建立了一种新型类器官模型，其起源于人类牙齿组织（即从拔除的智齿中分离的牙囊组织）。该类器官可长期稳定扩增，并在标志物表达及功能活性方面重现了拟议中的人类牙源性上皮干细胞区室特征。特别是，这些类器官能够启动成釉细胞分化过程，该过程与体内发生的成釉细胞分化相似 体内 在成釉过程中。这一独特的类器官模型不仅为研究人类牙齿发育和牙科病理学提供了强有力的工具，还可能为牙齿再生治疗开辟新途径。基于这一新型类器官模型，以生物牙替代缺失牙齿，可能成为当前合成材料种植牙标准疗法的一种极具吸引力的替代方案。

牙类器官的发育 
我们提供了一种详细的方案，用于从智齿拔除后获得的人类牙囊（DF）组织中建立类器官培养体系（图1A）。分离的牙囊组织通过酶消化和机械法进行解离。所获得的细胞在基础培养基（BMM）中培养，培养基成分经经验性优化，以促进类器官的最佳发育与生长（牙类器官培养基；TOM）19。
类器官通常在DF细胞接种后2周内形成（P0；图2A）。这些类器官可长期扩增（目前已达11代）（图2B，显示为P4代）。每滴BMM中接种约20,000个细胞（P0代及后续传代均如此）可获得最佳类器官密度（图2C）；而接种细胞数量过高则会导致类器官生长不佳（即密度过高时类器官较小），因生长空间不足（图2D）。最终优化的培养...

我们提出一种从人类牙齿开始建立上皮类器官培养的方案。这些类器官具有强大的可扩增性，并能重现牙齿上皮干细胞的特性，包括其成釉细胞分化能力。这一独特的类器官模型为研究人类牙科（干细胞）生物学提供了有前景的工具，并有望应用于牙齿再生策略。

牙齿在人类生活中具有至关重要的作用，不仅关乎食物咀嚼和言语功能，也影响心理健康发展。关于人类牙齿发育的知识……

这种新型的人牙源性类器官模型为解析人类牙源性干细胞生物学提供了首个强有力的工具，并为牙齿再生应用带来了新的前景。目前，该牙类器官模型是唯一能够可靠且稳健地培养和扩增人类牙上皮干细胞的可用工具。该类器官培养方案不仅可用于建立来自健康牙齿的研究模型，还可用于建立来自病变牙齿（如牙源性肿瘤和细菌影响）的研究模型。对这类疾病模型的研究可能揭示新的治疗靶点。该类器官模型在解析人类牙齿釉质形成过程中具有重要作用，并可能实现牙齿部分结构（如釉质）的再生构建。本次实验操作将由本研究团队的博士生 Lara Hemeryck 进行演示。首先，将带有相关牙囊的第三磨牙采集至置于冰上的采集液中，并将试管内容物转移至培养皿。用镊子夹住牙齿，使用手术刀小心分离牙囊组织。将牙囊组织短暂放入70%乙醇的第一孔中20秒，以洗去残留血液，随后将其转移至下一个乙醇孔中继续处理20秒，再进一步转移至第三个乙醇孔。用磷酸盐缓冲液清洗三次后，再将牙囊组织在剩余的三个牙囊收集培养基孔中清洗，总时间不超过20分钟。将清洗后的牙囊组织转移至新的培养皿中。取其中一个牙囊组织的一小块用于多聚甲醛固定，并将其置于含有500微升收集培养基的微量离心管中，最多保存6小时。将剩余的牙囊组织切成小块，转移至含有4毫升预热解离液的15毫升离心管中，于37摄氏度水浴中孵育2小时。每隔15分钟，用玻璃移液管反复吹打牙囊组织与解离液，以加速组织解离。当观察不到组织块时，改用拉细并经火焰抛光的巴斯德移液管继续解离操作。在此期间，准备含有 100 微升 DNase 的 10 毫升培养基 A，并向每管分离的牙囊组织中加入 5 毫升该培养基。在室温下孵育 1 分钟。用 1 毫升培养基 A 冲洗滤膜。在此步骤中合并来自同一患者的多管分离牙囊组织，将滤过的细胞悬液在 4 摄氏度下以 200 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。用1毫升无血清的限定培养基重悬沉淀，将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。使用自动细胞计数仪计算细胞浓度，并计算可接种的孔数。最终混合物由细胞悬液和基底膜基质按30比70的比例组成。移除适当体积的上清液，并缓慢重悬，以获得冰上预冷的基底膜基质与细胞悬液70比30的混合比例用于铺板。一旦细胞在基底膜基质中重悬，应将微量离心管置于冰上，以防止基底膜基质凝固。用移液器将20微升基底膜基质液滴加到预热的48孔培养板中央。将培养板倒置，置于37摄氏度、1.9%二氧化碳的培养箱中孵育20分钟以使其凝固。向牙类器官培养基中添加Rho相关激酶抑制剂和两性霉素B，并将培养基在37摄氏度水浴中预热。从培养箱中取出48孔板。将其直立放置，并用移液器向每孔中加入250 µL已预热的培养基，使培养基覆盖含有细胞的基底膜基质液滴，然后将培养板放回二氧化碳培养箱中。为更换培养基，将培养板倾斜45度角。轻柔地移除之前的培养基，注意避免触碰基底膜基质液滴，并每隔两到三天加入 250 微升新鲜的预热牙类器官培养基。进行类器官传代时，从含有类器官的孔中移除培养基，并合并最多四个汇合的孔。收集类器官时，每孔直接向基底膜基质液滴中加入 400 微升冰浴的无血清限定培养基，反复吹打液体直至整个液滴完全脱离。若合并孔内样本，将第一孔中的400微升液体转移至下一孔，以冲下含有类器官的液滴。将冲下的类器官集合体转移至1.5微升微量离心管中，并重复加入无血清限定培养基，直至收集完所有孔中的类器官结构。在4摄氏度下以200 × g离心5分钟。从离心管中移除上清液，并将沉淀重悬于预热的 TrypLE Express 分装液中。加入 400 微升冰冷的无血清限定培养基以灭活酶，于 4 摄氏度下以 200 × g 离心 5 分钟。移除上清液。用预冷的无血清限定培养基预润洗枪头，并在无菌条件下重悬类器官沉淀。对于低代次传代方法，将沉淀重悬于200微升预冷的无血清限定培养基中。将完全排空的移液枪头紧贴微量离心管底部，以减小其直径。用移液器上下吹打五分钟，以机械方式破坏类器官。对于高代次方法，用P1000枪头将沉淀重悬于700 µL预冷的无血清限定培养基中。将P200枪头套在此P1000枪头上，并用预冷的无血清限定培养基预先润洗。通过调节移液器的体积设定来防止气泡形成。吸取至少90%含有类器官的培养基体积，并上下吹打五分钟，以机械方式解离类器官。类器官通常在牙囊细胞接种后两周左右形成。类器官可长期扩增，最多可达11代。每基底膜基质液滴接种约20,000个细胞可获得类器官的最佳密度；而接种细胞数量过高则会导致类器官生长空间不足，密度过于密集，从而产生次优的类器官出芽生长，且类器官形态相似。所形成的类器官呈现致密外观，并含有核质比高的细胞。此外，类器官表达ERM标志物细胞角蛋白14，证实其上皮来源，以及其他被提出的ERM标志物，如P63、CD44和整合素α-6。类器官还表达SOX2，这是小鼠中一种公认的DESC标志物。有趣的是，釉基质的主要成分釉原蛋白也在类器官中表达。类器官在传代过程中保持其ERMM干性表型，这通过标志物的稳定表达得以证实。为了实现类器官的最佳长期生长，必须采用推荐的传代方法，即低代次或高代次传代方法。类器官形成后，可用于进一步研究成釉过程及目前在牙科研究中尚未实现的釉基质沉积。该技术能够探索牙上皮干细胞生物学、釉质形成过程以及与牙间充质的相互作用，这种相互作用对于牙齿的正确形成至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

将人类牙齿中的类器官确立为机械研究和再生疗法的有力工具

不断生长的小鼠门齿为研究牙源性上皮干细胞（DESCs）再生牙体组织提供了模型。建立一种稳定、可靠地从小鼠门齿中分离并扩增这些细胞的系统 体外...

从小鼠成年门齿中分离与培养牙源性上皮干细胞

本方案描述了对从人牙囊中提取的牙源性干细胞进行瞬时基因工程改造的方法。所采用的非病毒性修饰策略可为改进治疗用干细胞产品提供基础。...

人牙囊干细胞的分离、鉴定及基于微小RNA的遗传修饰

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。...

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。...

使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

本方案介绍了一种在微重力条件下培养成釉细胞样细胞并实现其三维生长的方法，以维持细胞的细长极化形态及牙釉质特异性蛋白的表达。同时描述了牙周组织工程构建物和肺器官在微重力条件下的培养条件。...

微重力条件下牙源性和呼吸系统细胞与器官的增殖

牙囊包含上皮细胞群和间充质细胞。通过使用特定的培养基，从异质的牙囊细胞群中筛选出上皮细胞群。上皮细胞在无血清培养基中存活并形成克隆集落。...

从人牙囊中分离上皮细胞

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。...

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。...

用于糖尿病性角膜病变的腺病毒基因治疗：对人器官培养角膜和角膜缘上皮细胞伤口愈合及干细胞标志物表达的影响

了解如何利用人类牙齿类器官模型研究牙釉质形成过程及牙源性干细胞生物学。该技术为牙齿再生医学和疾病治疗靶点发现提供了可靠的研究工具。

建立人类牙齿类器官：推动机制研究与再生治疗的有力工具

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