Name: 使用光学镊子探测肌动蛋白丝束中的肌球蛋白系综力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习使用光学镊子测量肌动蛋白丝束中肌球蛋白系综力学的方法。该技术可精确探测马达蛋白动力学，为细胞骨架研究提供模块化实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由密西西比大学研究生理事会研究奖学金（OA）、密西西比大学莎莉·麦克唐纳-巴克斯代尔荣誉学院（JCW、JER）、密西西比空间资助联盟（资助编号 NNX15AH78H，JCW、DNR）以及美国心脏协会（资助编号 848586，DNR）提供支持。

1. 蚀刻盖玻片
<ol>
	<li>在1,000 mL烧杯中，将100 g KOH溶解于300 mL 100%乙醇中。用磁力搅拌器搅拌，直至大部分KOH溶解。 
	注意：浓KOH溶液可引起皮肤灼伤并损坏衣物。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。</li>
	<li>将盖玻片逐个放入盖玻片清洗架中。 
	注：清洗架设计有狭缝，可将单个盖玻片分隔开，以便对盖玻片的每一面进行蚀刻和冲洗，底部设有排水孔，且材质需能耐受强腐蚀条件。此类清洗架可定制或商业购买。</li>
	<li>准备并标记三个1,000 mL烧杯：一个装有300 mL乙醇，另两个各装300 mL反渗透（RO）水。 
	注：此处RO水来自实验室纯水系统，若无本地纯水设备，也可购买市售RO水。</li>
	<li>将四个烧杯均置于超声波清洗仪中，超声脱气5分钟。</li>
	<li>将装有盖玻片的清洗架浸入KOH与乙醇混合液的烧杯中，超声处理5分钟。</li>
	<li>将盖玻片清洗架从KOH/乙醇混合液烧杯转移至仅含乙醇的烧杯中，上下浸入烧杯中，直至无液滴成珠现象。 
	注：操作时应小心，避免扰动盖玻片或将清洗架用力投入烧杯，以免盖玻片脱落或引起化学试剂飞溅。</li>
	<li>小心地将盖玻片清洗架从乙醇烧杯转移至盛水烧杯中，上下浸入，直至无液滴成珠现象。</li>
	<li>将盖玻片清洗架浸入尚未使用的另一杯水中，再次超声处理5分钟。</li>
	<li>用洗瓶向盖玻片清洗架喷水，直至水流在盖玻片表面平滑流下。再用乙醇重复此步骤。</li>
	<li>将清洗架置于90 °C烘箱中干燥20分钟。将蚀刻处理后的盖玻片清洗架存放于密闭容器中，室温保存，以防使用前污染。</li>
</ol>
2. 肌动蛋白丝的聚合
<ol>
	<li>配制溶液 T
	<ol>
		<li>在 50 mL 圆底离心管中，加入 3.94 g Tris-HCl 和 0.147 g CaCl2。加入反渗水（RO 水）至总体积为 50 mL，并充分混匀。 
		注：溶液 T 的终浓度分别为 500 mM Tris-HCl 和 20 mM CaCl2。</li>
		<li>将离心管标记为溶液 T，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 TC 缓冲液
	<ol>
		<li>在 50 mL 圆底离心管中，混合 40 mL 反渗水和 1.5 mL 溶液 T。逐滴加入浓 KOH，调节 pH 至 8.0。加水定容至 50 mL，并验证 pH 值。如有需要，进行 pH 调整。 
		注：终浓度的 TC 缓冲液含有 5 mM Tris-HCl 和 0.2 mM CaCl2，pH 为 8。</li>
		<li>将离心管标记为 TC，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 FC 缓冲液
	<ol>
		<li>在 100 mL 缓冲液瓶中加入 85 mL 反渗水、10 mL 溶液 T、3.73 g KCl 和 0.041 g MgCl2。逐滴加入浓 KOH 调节 pH 至 7.5。加水定容至 100 mL，并验证 pH 值。 
		注：终浓度的 FC 缓冲液含有 500 mM Tris-HCl、500 mM KCl、2 mM MgCl2 和 2 mM CaCl2，pH 为 7.5。</li>
		<li>将离心管标记为 FC，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制通用肌动蛋白缓冲液（GAB）。
	<ol>
		<li>在微量离心管中混合 485 μL TC 缓冲液、10 μL 10 mM ATP 和 5 μL 50 mM DTT。 
		注：终缓冲液条件为 5 mM Tris-HCl、0.2 mM CaCl2、0.5 mM DTT 和 0.2 mM ATP。</li>
		<li>标记为 GAB，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制肌动蛋白聚合缓冲液（APB）。
	<ol>
		<li>在微量离心管中混合 455 μL FC 缓冲液、25 μL 100 mM ATP 和 20 μL 50 mM DTT。 
		注：终缓冲液条件为 50 mM Tris-HCl、500 mM KCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、2 mM DTT 和 5 mM ATP。</li>
		<li>将离心管标记为 APB，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复溶肌动蛋白
	<ol>
		<li>通过向 1 mg 冻干肌动蛋白小瓶中加入 100 μL 去离子水来复溶兔骨骼肌肌动蛋白。通过轻柔吹打充分混匀。分装为每份 5 μL，速冻，并将 10 mg/mL 肌动蛋白分装样品于 -80 °C 保存。</li>
		<li>通过加入 20 μL 反渗水复溶生物素标记的兔骨骼肌肌动蛋白。分装为每份 5 μL，速冻，并将 1 mg/mL 生物素化肌动蛋白分装样品于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未标记肌动蛋白的聚合及罗丹明鬼笔环肽稳定化
	<ol>
		<li>解冻一支 10 mg/mL 肌动蛋白小瓶，并置于冰上。</li>
		<li>新鲜配制 GAB 缓冲液，向肌动蛋白分装样品中加入 100 μL GAB，通过轻柔吹打混匀。冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>在孵育期间新鲜配制 APB。孵育结束后，向肌动蛋白溶液中加入 11 μL APB，以启动肌动蛋白聚合为丝状结构。通过轻柔吹打充分混匀。冰上放置 20 分钟。</li>
		<li>向新聚合的肌动蛋白丝溶液中加入 5 μL 罗丹明标记的鬼笔环肽。避光冰上静置 1 小时。</li>
		<li>将罗丹明标记肌动蛋白小瓶用铝箔包裹，避光于 4 °C 保存。 
		注：建议在最多 1 周内使用这些肌动蛋白丝。可通过快速成像仅含肌动蛋白丝的流动池，并每日观察丝状结构的一致性，来确认肌动蛋白丝的质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素化肌动蛋白的聚合及 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽稳定化
	<ol>
		<li>解冻一支 10 mg/mL 肌动蛋白和一支 1 mg/mL 生物素化肌动蛋白小瓶，并置于冰上。</li>
		<li>新鲜配制 GAB 缓冲液。</li>
		<li>将两支小瓶（步骤 2.8.1）按 10:1 的肌动蛋白:生物素化肌动蛋白比例混合。向肌动蛋白混合液中加入 100 μL GAB，通过轻柔吹打充分混匀。冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>在孵育期间新鲜配制 APB。</li>
		<li>孵育结束后，向肌动蛋白溶液中加入 11 μL APB 以启动聚合。通过轻柔吹打充分混匀。冰上孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入 5 μL Alexa Fluor 488 标记的鬼笔环肽，避光冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>将生物素化肌动蛋白小瓶用铝箔包裹，避光于 4 °C 保存。 
		&#8203;注：这些肌动蛋白丝最多可在 1 周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肌球蛋白和微珠的制备
<ol>
	<li>重组肌球蛋白II
	<ol>
		<li>使用标准微量离心机短暂离心（约5秒），使冻干的骨骼肌肌球蛋白II沉降至管底。</li>
		<li>加入100 μL用RO水配制的1 mM DTT，将肌球蛋白重悬至浓度为10 mg/mL。</li>
		<li>取10 μL浓度为10 mg/mL的肌球蛋白原液，加入90 μL用RO水配制的1 mM DTT中，进行10倍稀释。分装为小体积（1–5 μL）等份，速冻后于-80 °C保存。 
		注意：可通过已发表的标准滑动丝状肌动蛋白实验验证肌球蛋白活性46,47。详见讨论部分的简要描述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗链霉亲和素包被的微珠
	<ol>
		<li>将20 μL的1 μm链霉亲和素微珠稀释于80 μL RO水中。以9,600 × g离心，用100 μL RO水重悬，重复洗涤四次。</li>
		<li>在40%振幅下超声处理2分钟，将洗涤后的微珠置于4 °C旋转器上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流通池制备
<ol>
	<li>在50 mL离心管中加入30 mL 100%乙醇，再加入200 μL 0.1% w/v的聚-L-赖氨酸（poly-l-lysine）水溶液，充分混匀，制备聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。</li>
	<li>将刻蚀盖玻片放入PLL溶液中，浸泡15分钟。用镊子取出盖玻片，注意仅接触其边缘，避免触碰表面（见图1A-C）。用手套包裹手指，捏住盖玻片边缘进行操作。</li>
	<li>使用过滤空气管线吹干盖玻片，直至表面无乙醇残留，且无任何残留物。</li>
	<li>在显微镜载玻片中央粘贴两条双面胶带，两条胶带间距为3–4 mm。将超出载玻片边缘的多余胶带撕去或剪除。</li>
	<li>将PLL包被的盖玻片垂直置于胶带上，方向与载玻片长轴垂直（形成“T”形），以构建流体通道。</li>
	<li>使用小管充分按压盖玻片，使其与胶带和载玻片紧密贴合，直至胶带变为透明（图1A）。确保胶带中无气泡，以免导致流体通道泄漏。 
	&#8203;注意：该流动池可容纳10–15 μL体积的液体。</li>
</ol>
5. 肌动球蛋白束的制备
<ol>
	<li>在不同的离心管中，通过将0.5 μL相应的标记肌动蛋白与300 μL APB混合，将每种类型的肌动蛋白丝（罗丹明标记和生物素化488标记）稀释600倍。向每管中额外加入5 μL相应标记的鬼笔环肽，并在冰上避光孵育15分钟。</li>
	<li>向生物素化肌动蛋白溶液中加入氧气清除系统：1 μL浓度为500 mg/mL的β-D-葡萄糖、1 μL浓度为25 mg/mL的葡萄糖氧化酶和1 μL浓度为500单位/mL的过氧化氢酶。加入1 μL 100 mM ATP和1 μL 100倍稀释的洁净链霉亲和素磁珠。用移液枪头轻轻搅拌。将该悬浮液置于4 °C旋转器上，同时继续组装其余的肌动蛋白-肌球蛋白束。</li>
	<li>向PLL流动池中加入15 μL稀释后的罗丹明标记肌动蛋白（图1D）。用吸水纸从流动池另一端吸去多余溶液，但切勿让流道变干。在湿度 chamber 中孵育10分钟。 
	注：湿度 chamber 可用空的移液枪头盒制作，盒底加入水，并用铝箔覆盖盒盖以避光。</li>
	<li>在APB中配制1 mg/mL的酪蛋白溶液。</li>
	<li>向流动池中加入15 μL 1 mg/mL酪蛋白，以防止后续组分的非特异性结合（图1E）。在湿度 chamber 中孵育5分钟。</li>
	<li>将所需浓度的肌球蛋白加入第5.2步制备的生物素化肌动蛋白与磁珠悬浮液中。用移液枪头轻轻搅拌，然后立即向流动池中加入15 μL该混合液（含所需浓度的肌球蛋白）（图1F、G）。孵育20分钟。用指甲油密封流动池的开口端，以防止成像和光镊实验过程中的蒸发。 
	注：1 μM的肌球蛋白溶液浓度可产生显著的束化效果，可作为该检测方法优化的起始参考浓度（见 图2）。</li>
</ol>
6. 使用光镊（NT2 Nanotracker2）进行力测量
注意：尽管以下方案专门针对 NT2 系统，但该检测也可用于其他具备荧光功能的光镊系统，包括自行搭建的系统。其总体工作流程保持一致，即先将载玻片表面调至焦平面，进行微球校准，然后通过寻找荧光标记的肌动蛋白束来采集数据。对于 NT2 系统，补充图 S1、补充图 S2、补充图 S3、补充图 S4、补充图 S5、补充图 S6 和补充图 S7 提供了光镊系统及软件界面的详细信息。
<ol>
	<li>打开控制箱和激光器（补充图 S1）。</li>
	<li>通过点击桌面上的 JPK Nanotracker 图标，启动光镊计算机软件。</li>
	<li>点击中央的 Logitech 按钮，唤醒遥控器（补充图 S2）。</li>
	<li>拨动开关，开启荧光模块（补充图 S3）。</li>
	<li>旋转滤光片转盘至明场成像位置（补充图 S4）。</li>
	<li>系统准备就绪后，点击屏幕左下角的“激光功率”按钮，将激光功率设为 50 mW，并让其稳定 30 分钟（补充图 S5）。</li>
	<li>在软件中依次点击 照明、相机、物镜 和 载物台移动 按钮，调出这些窗口以便在实验过程中进行观察和操作。点击 开/关 按钮开启显微镜照明，并通过点击并拖动滑条至最右侧，将照明强度调至最大（补充图 S5）。</li>
	<li>打开样品区域，从显微镜载物台上取下样品架。插入流动池，用金属样品夹固定，并确保带有盖玻片的载玻片位于底部。</li>
	<li>在底部物镜中心加入 30 μL 去离子水。注意移液枪尖不要接触镜头。重新插入样品载物台。 
	注意：由于 NT2 系统使用水浸物镜作为捕获物镜，浸没介质可能因用户配置中所用捕获物镜的不同而有所差异。</li>
	<li>使用屏幕上的控制箭头或遥控器上的 L2 按钮，提升下部物镜，直至水滴接触盖玻片（补充图 S5）。</li>
	<li>使用屏幕上的箭头或遥控器上的 R2 按钮，将上部物镜下降至距流动池约一半距离处。在上部物镜正下方的流动池顶部加入 170 μL 去离子水。继续降低上部物镜，直至其打破水面张力并形成弯月面。</li>
	<li>使用遥控器上的方向键移动显微镜载物台，直至到达流道旁的胶带边缘。关闭样品门。 
	注意：关闭样品门时若听到&#34;咔嗒&#34;声，表示激光快门现已打开。此为安全功能，仅当样品门关闭时才允许快门开启。</li>
	<li>在屏幕上使用 物镜 窗口，通过点击屏幕控件中的上箭头，提升名为 激光物镜 的底部物镜，使胶带边缘对焦。同样地，点击下箭头调节上部物镜（补充图 S5）。 
	注意：双箭头可使物镜或载物台移动更快。选择胶带边缘进行对焦，是因为它是一个靠近盖玻片表面、易于定位的大尺寸结构。胶带内的气泡也可作为对焦参考。但如果用户已有自动对焦程序或偏好的内部方法，则此步骤非必需。</li>
	<li>胶带对焦后，部分关闭光镊顶部的虹彩光圈。将上部物镜下移，直至可见光圈的多边形轮廓。将这些边缘调至清晰，重新打开光圈，然后点击 锁形 图标耦合两个物镜（补充图 S5）。</li>
	<li>找到一个自由漂浮的微球，点击 捕获快门 按钮，打开快门，使捕获激光照射到样品上。点击屏幕上的 捕获 光标并拖动，以移动捕获激光的位置。捕获成功后，对微球进行校准，以关联电压测量值与力和位移。</li>
	<li>点击 校准 按钮。根据功率谱分析调整校准程序，并在软件中对 X、Y 和 Z 方向的拐角频率进行拟合（补充图 S6）。</li>
	<li>点击 设置。输入微球直径（1,000 nm），并输入软件窗口左下角显示的载物台温度（见 补充图 S6）。</li>
	<li>点击 捕获 1。点击 X 信号。点击 运行 以执行拐角频率拟合。在窗口内点击并拖动，优化函数拟合。点击 使用该值 以获取灵敏度和刚度值。点击 接受数值。对 Y 和 Z 信号重复上述步骤。关闭窗口（见 补充图 S6）。 
	注意：用户已充分验证的其他光镊系统或自建系统的微球校准方法（如能量均分法或拖曳力法）也可接受57,58。</li>
	<li>通过在盖玻片表面寻找结合于肌动蛋白纤维（AF）上的微球，找到肌动蛋白-肌球蛋白束。</li>
	<li>当检测到周围无其他漂浮微球干扰的目标微球时，通过荧光成像观察其周围的肌动蛋白纤维，确认是否存在束状结构。</li>
	<li>通过观察荧光标记的肌动蛋白纤维是否共定位，确认束的存在。打开白光光源，使用合适的滤光片组，通过旋转转盘进行成像（Alexa Fluor 488 和罗丹明激发分别使用 488 nm 和 532 nm 激发滤光片组）。见 补充图 S4。 
	注意：进行对照实验以验证单根肌动蛋白纤维的荧光强度，有助于识别由单根 488 标记和单根罗丹明标记纤维组成的束，或适用于用户所选的任何荧光染料组合。</li>
	<li>确认后，点击 捕获快门 按钮，捕获连接在束顶部纤维上的微球。</li>
	<li>使用屏幕控件点击 示波器 按钮以记录数据（补充图 S7）。若仅需实时观察测量结果而不保存数据，点击 开始。若要保存所有数据，点击 自动保存。若要开始记录测量值，点击 开始记录。通过下拉菜单选择 X 信号或 Y 信号，以确定实时显示的数据类型（位置、力、X 方向、Y 方向）。请注意，X 方向为屏幕上的从左到右，Y 方向为从下到上。见 补充图 S7。 
	注意：数据将以 .out 文件格式保存，包含每个方向的时间、电压、位移和力信息。这些文件可导出至其他软件进行可视化和分析。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

一个 体外 使用光镊结合荧光成像的研究方法，用于探究肌球蛋白复合体与肌动蛋白丝相互作用的动力学过程。通过肌肉肌球蛋白II构建肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白束结构，其中束底部及盖玻片表面使用罗丹明标记的肌动蛋白，束顶部则使用488标记且生物素化的肌动蛋白丝。兔骨骼肌来源的肌动蛋白在通用肌动蛋白缓冲液（GAB）和肌动蛋白聚合缓冲液（APB）中进行聚合与稳定。GAB与APB必须每日在实验室内使用ATP、FC缓冲液和TC缓冲液新鲜配制。肌肉肌球蛋白II用于形成肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白三明治结构。鬼笔环肽用于肌动蛋白丝的荧光染色及稳定性维持。 体外.
肌球蛋白活性可通过标准的滑动微丝实验进行验证，该方法此前已有报道46,47。肌球蛋白II及其亚片段可以多种取向结合到盖玻片表面，且与使用重酶解肌球蛋白的实验相比，尾部结构域的存在可能会减缓微丝的滑动速度46,<sup cl...

分子马达对生命至关重要，可将化学能转化为机械功1,2,3。肌球蛋白马达通过在肌动蛋白丝上类似轨道行走的方式与之相互作用，肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学过程执行肌肉收缩、细胞运动、胞质分裂过程中的收缩环以及细胞内物质运输等关键功能3,4,5,6,7,8。由于肌球蛋白具有多种关键功能，其与肌动蛋白网络的功能障碍可能导致疾病发生，例如肌球蛋白重链的突变可导致肥厚型心肌病（HCM）中的心脏过度收缩9,10,11,12,13,14。在肌肉收缩过程中，单个肌球蛋白马达通过协同工作形成集合体，提供实现肌动蛋白丝（AFs）相对滑动所需的机械能4,15,16,17,18。肌球蛋白马达在肌动蛋白丝之间形成横桥，并利用其机械化学循环引起的构象变化，共同向排列整齐的肌动蛋白丝的尖端方向移动17,18,19,20,21。
定量方法的开发 体外 使用光镊等技术在单分子水平上进行运动性分析，已促进获取关于单个肌球蛋白马达功能的前所未有的细节信息，包括测量单分子力的产生和步长大小22,23,24,25,26,27,28,29,30. Finer 等人开发了 &#34;三珠&#34; 或 &#34;哑铃&#34; 利用光镊实验探究单个肌球蛋白II分子产生力的力学机制23,31由于肌球蛋白II在肌动纤维（AFs）收缩过程中以协作团队形式发挥作用，但在单分子（SM）水平上不具备持续性，因此必须将光镊实验的取向从经典的马达蛋白结合小球方法重新调整。32为了构建哑铃型实验装置，使用两个光镊捕获一段AF，并将其置于固定在盖玻片上的珠粒所结合的肌球蛋白马达上方，通过测量AF在光阱中的运动来检测单个马达产生的力输出。23.
然而，单分子力测量以及使用单一马达蛋白/单一细丝的实验构型并不能全面反映系统层面的力生成机制，因为许多马达蛋白（包括肌球蛋白II）并非孤立工作，其功能也通常并非各部分功能的简单加和15,16,17,32,33,34,35,36。要更深入理解肌球蛋白与肌动蛋白细丝网络之间的协同作用，需要构建更为复杂的结构，使多个马达蛋白与多根细丝相互作用15,32。哑铃式实验构型已被用于研究小规模马达蛋白群体的力生成，其方法包括将多个肌球蛋白连接至微球，或在表面固定肌球蛋白粗丝，使其与悬浮的肌动蛋白细丝发生相互作用4,23,34,37,38,39,40。
其他小型集合体检测方法包括一种体外（in vitro）细丝滑动实验，其中肌球蛋白马达被包被在盖玻片表面，利用与肌动蛋白细丝（AF）结合的微珠来探测一组马达所产生的力4,35,36,38,39,40,41,42,43。在这两类实验中，肌球蛋白均被固定于刚性表面——微珠或盖玻片——并仅使用一条肌动蛋白细丝。在这些情况下，马达无法自由移动或彼此间进行通信，且将肌球蛋白刚性固定也无法模拟其在肌节中协同工作的顺应性、层级化环境32。先前的研究表明，肌球蛋白II能够感知其所处环境，并通过调节诸如力生成能力和占空比等特性，适应变化的黏弹性或马达浓度条件41,44,45。因此，有必要开发一种光镊捕获实验，以促进并捕捉马达间的通信以及系统的顺应性，从而更真实地揭示肌球蛋白II集合体力生成的机制基础。
在此，我们开发了一种耦合分层结构的方法 体外 通过形成肌动蛋白-肌球蛋白束或“三明治”结构，其中多个肌球蛋白马达在两根肌动蛋白丝之间相互作用，结合光镊技术进行检测。这种模块化的检测构型能够直接探究分子和环境因素如何影响肌球蛋白群体的力生成。此外，通过研究这些肌动蛋白-肌球蛋白复合体的力生成机制，有望帮助建立模型并深入理解大规模细胞活动（如肌肉收缩）如何从分子水平逐级放大并实现。9,10,13.

<table><tbody><tr><td>肌动蛋白（生物素标记）：骨骼肌</td><td>细胞骨架</td><td>AB07-A</td><td>生物素标记的肌动蛋白</td></tr><tr><td>肌动蛋白，兔骨骼肌来源</td><td>细胞骨架</td><td>AKL99-A</td><td>肌动蛋白</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>肌动蛋白稳定剂及 Alexa Fluor 488 荧光染料</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>用于肌动蛋白组装和肌球蛋白运动</td></tr><tr><td>β-D-葡萄糖</td><td>Fisher scientific</td><td>MP218069110</td><td>用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分</td></tr><tr><td>印迹级封闭剂（酪蛋白）</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>用于阻断表面非特异性结合</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>氯化钙，用于调控肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>用于构建流动池</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>用于清洗盖玻片的试剂</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>用于蚀刻盖玻片及调节缓冲液 pH</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>用于构建流动池</td></tr><tr><td>肌球蛋白 II 蛋白：兔骨骼肌来源</td><td>细胞骨架</td><td>MY02</td><td>从兔骨骼肌中分离的全长肌球蛋白马达蛋白</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>光镊仪器</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>促进肌动蛋白丝在盖玻片玻璃表面的黏附</td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>细胞骨架</td><td>PHDR1</td><td>肌动蛋白稳定剂及罗丹明荧光染料</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠，1 &amp;mu;m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>光镊操作手柄</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>用于缓冲液配制</td></tr></tbody></table>

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

肌球蛋白是一类运动蛋白，可通过水解ATP沿肌动蛋白丝（AF）轨道行进，在细胞运动和肌肉收缩等细胞过程中发挥关键作用。为了理解其产生力的机制，肌球蛋白II已在单分子（SM）水平以及多分子协同作用的层面得到研究。 体外 使用光镊等生物物理方法。
这些研究表明，当从三珠结构中的单分子水平研究转变为刚性珠或盖玻片表面滑动结构中多个马达蛋白协同工作时，肌球蛋白产生力的行为可能存在显著差异。然而，这些检测方法无法评估肌球蛋白在类似于细胞内的黏弹性结构层级中所表现出的群体动力学行为。我们开发了一种利用光镊的方法，用于研究肌球蛋白群体与多条肌动蛋白丝相互作用时产生力的力学机制。
这些肌动蛋白-肌球蛋白束可在分层且具有顺应性的环境中促进对马达蛋白间通信及整体力输出的研究。该检测方法具有可定制性，允许改变实验条件，以理解对肌球蛋白整体、肌动蛋白丝束或周围环境的修饰如何导致不同的力输出结果。

含有肌动球蛋白束系统的流动池采用标准设计，由显微镜载玻片和蚀刻盖玻片组成，二者之间通过双面胶带形成的通道隔开（图1）。实验体系自盖玻片开始，按照方案中所述的分步添加方式进行构建。最终的实验体系包含作为模板的罗丹明标记肌动蛋白丝；所需浓度的肌球蛋白（代表性结果中使用了1 μM，见图2和图3）；生物素化、Alexa Fluor 488标记的肌动蛋白丝；1 μm链霉亲和素磁珠；氧气清除系统；ATP；以及APB缓冲液。每个流动池中会形成多个束状结构，上述肌动蛋白浓度可使各束之间保持足够的间距，避免发生非预期的相互作用。这也有利于在单个流动池内获取多个力测量数据，从而提高数据采集效率。力谱在同一个流动池内以及不同流动池之间应具有良好的可重复性。
尽管上述方案主要针对商用光镊装置，但本文所介绍的流动池及实验方法也可轻松应用于其他商用仪器或自制的光镊系统，只要该系统配备显微镜或显微镜载物台，并具备荧光成像能力即可。按照...

肌动球蛋白束的形成 体外 并介绍了使用光镊测量肌球蛋白集合力生成的方法，同时对此进行了讨论。

肌球蛋白是一类运动蛋白，可通过水解ATP沿肌动蛋白丝（AF）轨道移动，在细胞运动和肌肉收缩等细胞过程中发挥重要作用……

使用本方案研究肌动蛋白行为具有重要意义，因为它使研究人员能够利用光镊的高精度来探究马达蛋白群体的动力学特性。该技术的主要优势在于，能够在肌动蛋白的结构层级背景下测量肌球蛋白的力学特性，而不同于许多光镊实验中常用的传统的单马达-单丝状结构取向。本方案的另一优势在于其模块化设计，允许用户根据所选的层级化细胞骨架系统对实验进行定制化调整。首先，在载玻片中部贴上两条双面胶带，两条胶带之间相距三到四毫米。然后，撕掉或剪去载玻片边缘多余的胶带部分。接着，将经PLL包被的盖玻片垂直于载玻片长轴方向放置在胶带上，以形成一个通道。使用小管将盖玻片压紧在胶带和显微镜载玻片上，充分按压直至胶带变得透明，确保胶带中无气泡，因为气泡可能导致流动通道泄漏。向 PLL 流动池中加入 15 µL 稀释的罗丹明标记肌动蛋白，并通过毛细作用引吸除去多余溶液，但切勿让流动通道变干。随后，在湿度培养箱中孵育 10 分钟。接下来，用肌动蛋白聚合缓冲液配制浓度为1毫克/毫升的酪蛋白溶液，并加入15微升该溶液以防止后续组分的非特异性结合。然后在湿盒中孵育5分钟。随后，向已制备的生物素化肌动蛋白与微珠悬浮液中加入所需浓度的肌球蛋白，并用移液器枪头轻轻搅拌。然后，立即向流动池中加入15微升悬浮液以及所需浓度的肌球蛋白，并孵育20分钟。接着，用指甲油密封流动池的开放两端，以防止成像和光镊实验过程中液体蒸发。系统准备就绪后，点击屏幕左下角的激光电源按钮，开启激光至50毫瓦，并使其稳定30分钟。在软件中依次点击照明、相机、物镜和载物台移动按钮，以调出这些窗口，便于在实验过程中进行观察和操作。通过点击“开/关”按钮并将滑块向右拖动至最右侧，将显微镜照明打开并设置为最大功率。打开样品区域，从显微镜载物台上取下样品架。然后安装流动池，并使用金属样品架将其固定，确保盖玻片位于底部。随后，向底部物镜中心加入 30 µL 去离子水，并重新插入样品台。接着使用遥控器上的 L2 按钮抬升下层物镜，直至水滴接触盖玻片。接下来，使用遥控器上的 R2 将顶部物镜下降至距流动池约一半距离的位置。然后，在顶部物镜正下方的流动池顶部直接加入 170 微升反渗透水，并继续降低顶部物镜，直至其打破水的表面张力并形成弯月面。随后，使用遥控器上的方向键移动显微镜载物台，直至到达邻近流动通道的胶带边缘，然后关闭样品门。在屏幕上的目标窗口中，使用屏幕控件点击上方箭头将名为“Laser Objective”的底部物镜向上移动，或点击下方箭头移动顶部物镜，以调节至胶带边缘并实现聚焦。找到一个悬浮的微珠后，点击光阱快门按钮，打开快门，使捕获激光照射到样品上，从而捕获微珠。然后，点击屏幕上的光阱光标并拖动，以移动捕获激光的位置。捕获小球后，通过点击校准按钮来校准小球。然后，点击“设置”，在软件窗口左下角找到的小球直径和载物台温度值输入相应位置。接着，点击“光阱1”，再点击“X信号”，并通过点击“运行”执行拐角频率拟合。然后在窗口内单击并拖动以优化函数拟合。之后，单击“使用该结果获取灵敏度和刚度值”，然后接受这些数值。最后，关闭窗口。通过在盖玻片表面寻找结合于肌动蛋白纤维（AFs）上的微珠，并观察荧光标记的肌动蛋白纤维是否共定位，来定位肌球蛋白-肌动蛋白束。打开白光光源，转动物镜转换器并使用适当的滤光立方体对每根肌动蛋白纤维进行成像。确认后，点击光镊快门按钮，捕获连接在束状结构顶部纤维上的微珠。然后，使用屏幕上的控件点击示波器按钮以记录数据。若要查看测量结果而不记录数据，请点击“开始”，然后点击“自动保存”以保存所有数据。若要记录测量结果，请点击“开始记录”，并通过下拉菜单选择“X 信号”或“Y 信号”来确定哪些数据将实时显示。在构建的体外肌动蛋白结构层级中，骨骼肌肌球蛋白马达产生的力-时间曲线表现出持续的力上升，直至在两到五分钟内达到平台期。然而，也观察到一些肌动蛋白-肌球蛋白束不产生任何净力，其力-时间曲线表现为基线噪声，或在90秒内未表现出显著的净力增加，这可能是由于马达浓度较低或纤维排列方向不利所致。该实验方案的建立将为构建更复杂的体外细胞骨架检测体系铺平道路，从而自下而上地进一步模拟细胞分裂和肌肉收缩等大规模细胞活动。

probing-myosin-ensemble-mechanics-actin-filament-bundles-using

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用光学镊子探测肌动蛋白丝束中的肌球蛋白系综力学

本指南逐步介绍了新型重力力谱仪的原理、操作方法及典型实验结果。...

展示新型重力力谱仪在拉伸和测量纤维状蛋白质中的应用

本文介绍了一种表达和纯化肌球蛋白5a的实验流程，并讨论了如何利用群体和单分子水平的体外荧光显微镜检测方法对其进行表征，以及如何修改这些方法以适用于非肌肉肌球蛋白2b的表征。...

基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。...

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

本方案介绍了一种利用光镊研究RNA-蛋白质相互作用的完整实验流程。文中概述了多种可能的实验装置，包括光镊与共聚焦显微镜联用的设置。...

利用光镊研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。...

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

学习使用光学镊子测量肌动蛋白丝束中肌球蛋白系综力学的方法。该技术可精确探测马达蛋白动力学，为细胞骨架研究提供模块化实验方案。

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

探索更多视频