Name: 高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微镜在化学成像中的应用的直接比较 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习高光谱相干反斯托克斯拉曼散射与受激拉曼散射显微镜技术，比较两者在化学成像中的空间分辨率、对比度和光谱分辨率差异，为生物学研究选择最佳无标记成像方法。

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本研究得到了普渡大学化学系启动基金的支持。

1. 高光谱 CRS 成像的仪器设置
注意：产生相干拉曼散射（CRS）信号需要使用高功率（即3B类或4类）激光器。在如此高峰值功率下工作时，必须遵守安全规程，并始终佩戴适当的个人防护装备（PPE）。实验前请查阅相关安全文档。本方案重点介绍光路设计、飞秒脉冲的啁啾调节以及成像条件的优化。本超光谱CRS显微镜的一般光学布局如图1所示。此处展示的配置是CRS显微镜多种现有配置之一。本方案所使用的CRS显微镜系统基于双输出飞秒激光源和激光扫描显微镜构建。
<ol>
	<li>确保激光光源提供两束飞秒脉冲序列（脉宽120 fs），重复频率为80 MHz，其中一束波长固定在1,045 nm，用作斯托克斯光束，另一束波长可在680至1,300 nm范围内调谐，用作泵浦光束。通过光路延迟差对输出脉冲进行同步。使用显微镜框架构建成像平台。</li>
	<li>设计光路
	<ol>
		<li>为控制样品处的激光功率，对每束激光使用半波片和偏振分束器（PBS）组合。</li>
		<li>在斯托克斯激光光路中安装一个声光调制器（AOM）。使用焦距为150 mm的透镜将光束聚焦进入AOM，并对0级衍射光进行重新准直th 使用焦距为400 mm的透镜进行有序输出。</li>
		<li>使用相同的透镜组合（150 mm 和 400 mm 焦距）扩泵浦光束，使泵浦光束尺寸与斯托克斯光束匹配。</li>
		<li>将400 mm焦距透镜分别置于泵浦光束和斯托克斯光束路径中的独立一维平移台上，以精细调节光束发散角，并在光束进入显微镜前优化光束尺寸。</li>
		<li>使用安装在电动平移台上的直角反射镜引导泵浦光束，以调节光学延迟。如果斯托克斯光束需要光学延迟，则将这些组件置于其光路中。</li>
		<li>使两束光在截止波长约为1,000 nm（位于泵浦光与斯托克斯光波长之间）的二向色镜处合束，使得斯托克斯光透过该二向色镜，而泵浦光被其反射。将共线合束后的激光导入显微镜。</li>
		<li>为使泵浦光束和斯托克斯光束产生啁啾，在其光路中放置玻璃棒。详见步骤1.5。</li>
		<li>为确认光路准直和光束尺寸，在二向色镜后和显微镜前使用虹膜光阑。具体而言，在靠近二向色镜的位置和远离二向色镜的位置各安装一个光阑，以确认光路准直良好且光束重叠。在准直过程中，使用红外观察卡或红外观察仪观察光束。</li>
		<li>使用快速光电探测器和示波器近似测量泵浦光与斯托克斯光脉冲之间的光学延迟。通过采样激光脉冲序列来触发示波器。</li>
		<li>阻断泵浦光束，采样斯托克斯光束。放大其中一个脉冲，并在其上放置垂直光标，以在示波器上标记其时间位置。</li>
		<li>解除泵浦光束的遮挡，遮挡斯托克斯光束。移动延迟平台，直至样品处的泵浦脉冲与标记位置在时间上对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激光扫描显微镜
	<ol>
		<li>对于直立显微镜配置，将合并的激光束通过潜望镜系统提升至适当高度后，再导入二维振镜扫描镜。</li>
		<li>在显微镜前测量激光光束尺寸，并在振镜后设置合适的透镜组，以扩展激光光束，使其尺寸最佳匹配物镜入瞳的大小。</li>
		<li>使用两个透镜构建一个4f系统，使物镜的后光阑与两个检流计镜的中心处于共轭平面。或者，使用两个独立的一维检流计镜，并配合两套4f透镜系统进行激光扫描。</li>
		<li>在冷凝器之后，设计一个2英寸的翻转镜以反射激光束用于信号采集。在透射光路中放置一个直径为2英寸的透镜，以完全收集并聚焦透射信号至探测器。</li>
		<li>使用截止波长为776 nm的二向色镜将CARS信号引导至PMT，同时允许透射的SRS信号由PD检测。在PMT前使用带通滤光片（655/30 nm）以滤除残余的激发激光脉冲。在PD前使用短通滤光片（980 nm短通）以阻止斯托克斯光束进入探测器。</li>
		<li>对于CARS信号检测，在PMT之后和将信号送入数据采集系统之前，连接一个前置放大器和一个电流-电压转换器。调节PMT电压以优化信号和图像对比度。</li>
		<li>使用函数发生器在1-10 MHz频率下对声光调制器（AOM）进行调制，并将同一频率用作锁相解调的参考信号。在数据采集前，使用锁相放大器提取受激拉曼散射（SRS）信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集与显示
	<ol>
		<li>使用数字数据采集（DAQ）卡配合接线端子板进行数据采集。</li>
		<li>使用数据采集设备（DAQ）的模拟输出来控制检流计镜，使用模拟输入进行信号采集。</li>
		<li>使用基于 LabVIEW 编写的实验室软件，该软件具有同步多通道显示功能，可用于实时查看和保存图像（参见 补充文件).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>啁啾飞秒光源并测量光谱分辨率 
	注意：为了利用光谱聚焦实现良好的光谱分辨率，需使用玻璃棒引入色散，将飞秒激光脉冲展宽至皮秒量级。为获得最佳光谱分辨率，泵浦光束的啁啾速率需与斯托克斯光束相等。对于该激光系统，通过将约120 fs的输出激光脉冲分别展宽至泵浦光束3.4 ps、斯托克斯光束1.8 ps，可实现最佳光谱分辨率。该展宽通过采用“4+1”组合方式（四根置于合束光路中，一根仅置于斯托克斯光束中）的150 mm玻璃棒（SF-57）组合实现，如下所述，此配置应可达到15 cm⁻¹的光谱分辨率。-1 光谱分辨率。脉冲持续时间可使用自相关仪进行测量。
	<ol>
		<li>仅将一根150 mm玻璃棒插入斯托克斯光束光路中。</li>
		<li>在二向色镜分光后的泵浦光/斯托克斯光束路径中插入两根150 mm的玻璃棒。为增强啁啾效应，可在玻璃棒一端放置一片介质镜，使合并的激光束在两根玻璃棒中实现双通。</li>
		<li>为测量光谱分辨率，准备一个标准化学样品（例如二甲基亚砜 [DMSO]），将其压在两片玻璃盖玻片之间，然后扫描延迟台，直至获得最大信号。</li>
		<li>移动光学延迟器 1,000 µm 红移方向。然后，采集200帧图像 10 µm/step 向蓝移方向采集高光谱图像序列。</li>
		<li>要将帧数转换为波数，请使用对称拉曼峰（2,913 cm⁻¹）进行线性回归-1）和不对称（2,994 cm⁻¹-1DMSO 的 C-H 伸缩振动及其对应的帧编号40.</li>
		<li>使用XPM信号测量光谱聚焦强度分布。半闭合聚光镜光圈，并将焦点移至空白盖玻片处。采集与高光谱SRS相同数量的步数。为测量CARS非共振背景，将焦点对准玻璃盖玻片，并采集与高光谱CARS测量相同数量的步数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化图像的信噪比（SNR）
	<ol>
		<li>为系统校准准备化学样品。按照步骤3.1中所述的样品制备程序进行操作。 
		注意：DMSO 是一种理想选择，因为它是实验室中常见的化学品，具有强烈的拉曼信号，且其 C-H 对称峰与非对称峰之间分离度良好。</li>
		<li>将样品置于显微镜载物台上，根据物镜或聚光镜的需要，加入水或浸油。适当移动视野中DMSO液滴的边缘，并调节物镜以获得最佳焦距。使用科勒照明法对中聚光镜。41完全打开聚光镜上的光圈。</li>
		<li>将泵浦光束波长调节至800 nm（斯托克斯光为1,045 nm），以匹配2,913 cm⁻¹的振动频率-1 CH3 峰值。通过调节半波片，将泵浦光束和斯托克斯光束在进入显微镜前的功率均设置为约30 mW（样品平面处功率约为10 mW）。</li>
		<li>对于SRS，将锁相放大器的增益设置为约10，时间常数为 7 µs （当使用 10 µs 像素驻留时间）。确保时间常数小于像素驻留时间。SRS信号的AUX输出使用Demod R。</li>
		<li>对于CARS，将PMT输出信号送至前置放大器和电流-电压转换器，使用数据采集卡（DAQ）采集转换器的输出信号。</li>
		<li>在采集软件中设置图像采集参数。使用200 x 200的像素数，扫描尺寸约为100 x 100 µm2确保图像中同时包含DMSO液滴和空白区域。</li>
		<li>扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。在监控实时图像的同时，扫描电动延迟台的斯托克斯/泵浦光束。调节延迟直至信号达到最强。</li>
		<li>将DMSO液滴移动至覆盖整个视野，并检查DC信号最大值是否位于图像中心（信号依赖于泵浦光束）。必要时调整泵浦光束的位置 通过 成像软件中的电压偏移或镜面反射。</li>
		<li>在完成直流（DC）优化后，调节斯托克斯（Stokes）光束的反射镜，同时调整阈值以使交流（AC）信号达到最大，并显示约50%的饱和度。检查饱和区域是否位于图像中心。若未居中，仅微调斯托克斯光束的反射镜。在对准过程中实时监测信号，以获得对准质量的实时反馈。</li>
		<li>为确定信噪比（SNR），选择DMSO图像中的一个小区域并测量其平均值。对于噪声，选择图像空白区域中的一个小区域，测定其平均均值和标准差。用信号的均值减去噪声的均值，再将结果除以空白区域的标准差。</li>
		<li>如果计算得到的信噪比不够高（SRS通常为800-1,000） &gt;10,000（在0.4 V PMT电压和该功率组合下），需检查并重新优化光束重叠、光束尺寸和延迟台位置，微调声光调制器（AOM），并调整函数发生器的调制频率，直至获得预期的信噪比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 图像分析与数据处理
<ol>
	<li>信噪比（SNR）分析
	<ol>
		<li>打开 ImageJ 软件。导入保存的 DMSO 样品 .txt 文件时，点击 文件 | 导入 | 文本图像 | 打开。</li>
		<li>图像导入后，按下 CTRL+Shift+C 调出亮度与对比度功能（B&amp;C）。为找到样品的最大信号，持续点击 B&amp;C 中的 自动 按钮，直至 DMSO 样品的某一区域出现饱和。</li>
		<li>在 ImageJ 界面上选择 椭圆 选区工具，圈选 DMSO 饱和区域中的一个小区域。选中后，按下 M 键测量所选区域的平均值和标准差。</li>
		<li>为测量背景信号，调整 B&amp;C 功能中的滑块，直到空白区域的信号可见。使用 椭圆 选区工具，圈选与步骤 2.1.3 中大小相同的背景区域，确保所选区域不含 DMSO。按下 M 键测量所选区域的统计值。</li>
		<li>根据步骤 1.6.10 计算信噪比（SNR）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理高光谱 CRS 图像
	<ol>
		<li>按照步骤 2.1.1 导入 .txt 文件。导入后，点击 图像 | 图像栈 | 工具 | 拼接转图像栈…，将文件转换为图像栈。</li>
		<li>滚动浏览拼接图像，直到第一个 DMSO 峰可见。在 DMSO 区域选择一个区域，点击 图像 | 图像栈 | 绘制 Z 轴剖面图，绘制强度随帧数变化的光谱图。为提取原始光谱数据，点击“列表”并复制剖面数据。</li>
		<li>为将恢复的光谱转换为波数单位，执行步骤 1.5.5 中所述的线性回归。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>谱分辨率测量的拟合方法 
	注意：使用洛伦兹（Lorentzian）函数对 SRS 和 CARS 光谱进行拟合28。
	<ol>
		<li>打开拟合软件，将线性回归数据复制粘贴至程序中。拟合 SRS 数据时，选中数据并将其绘制为散点图。</li>
		<li>调出散点图后，点击 分析 | 峰与基线 | 多峰拟合 | 打开对话框，调出峰分析器。调出后，确认输入为当前图像，并将峰函数更改为洛伦兹函数（Lorentz）。</li>
		<li>在图中双击两个 DMSO 峰，以高亮需要拟合的区域。接着点击 打开 NLfit，调出 拟合 窗口。点击 拟合至收敛 按钮，然后点击 确定，查看拟合系数的表格化汇总（见公式 (3))。 
		注意：以下公式显示了软件中洛伦兹函数的格式。A1/2 为拟合峰的振幅，w1/2 为拟合峰的宽度，x01/02 为拟合峰的中心位置。自变量为 x，因变量为 y。 
		<img alt="双洛伦兹公式，光谱拟合，方程分析，吸收光谱模型。" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq3v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">     (3)</li>
		<li>对于 CARS 光谱拟合，点击 分析 | 拟合 | 非线性曲线拟合 | 打开对话框。选择 类别：新建，以定义 CARS 的新函数。使用下述定义的双峰 CARS 拟合函数进行 CARS 光谱拟合（见公式 (4))。 
		<img alt="统计拟合方程，光谱分析公式中的高斯与洛伦兹项。" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq4v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> (4)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>空间分辨率的测定 
	注意：在执行此步骤前，必须明确特定放大倍数下的像素尺寸、像素数量与步长（µm）之间的换算关系。可通过使用直径已知且大于预期成像分辨率的样品，测量其线轮廓，并拟合高斯函数以确定半高全宽（FWHM）值来实现。可使用分辨率测试靶标或聚合物微球等均匀样品。
	<ol>
		<li>获取直径小于 200 nm 的细胞或聚合物颗粒的图像。</li>
		<li>使用 ImageJ 在图像中最小的颗粒上绘制一条直线。</li>
		<li>按下 K 键绘制强度分布剖面图。</li>
		<li>在弹出窗口中点击 列表，并将信息复制到拟合软件中。</li>
		<li>在拟合软件中绘制剖面图，并使用高斯拟合（点击 分析 | 拟合 | 非线性曲线拟合 | 打开对话框 | 类别：基本函数；函数：高斯）。</li>
		<li>拟合后读取峰宽值，并结合像素与实际尺寸的换算关系，获得显微镜的实际分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 超光谱 CRS 成像样品的制备
<ol>
	<li>成像载玻片和化学样品的制备
	<ol>
		<li>将一段双面胶贴在盖玻片上，并从胶带中间切出一小块矩形区域，以形成用于放置样品的开放区域。</li>
		<li>用移液器吸取1–2 µL纯DMSO，并将液滴置于该空缺区域的中央。</li>
		<li>小心地盖上顶部盖玻片，轻轻按压盖玻片边缘以密封样品腔室，同时确保DMSO样品不接触胶带边缘。</li>
		<li>对于灵敏度实验，用重水（D2O）对DMSO进行系列稀释，得到50%–0%的浓度范围。取每种溶液1–2 µL，按上述方法制备压片样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>将细胞接种于35 mm玻璃底培养皿（或更大尺寸）中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育过夜或更长时间，直至细胞融合度达到约50%–80%。</li>
		<li>直接对活细胞进行成像，或使用10%甲醛溶液固定细胞后进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案介绍了多模态相干拉曼散射（CRS）显微镜的构建方法，以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）与受激拉曼散射（SRS）成像的直接比较。在显微镜构建过程中，关键步骤包括空间与时间上的光束重叠以及光束尺寸优化。建议在进行生物成像前，使用DMSO等标准样品优化信噪比并校准拉曼位移。CARS与SRS图像的直接比较表明，CARS具有更高的空间分辨率，而SRS则提供更优的光谱分辨率和更清晰的化学对比度。CARS与SRS的检测限相似。
CARS 和 SRS 成像采用高能量脉冲激光进行激发。这使得该平台能够整合其他非线性光学成像模式，如多光子激发荧光、谐波产生和瞬态吸收，以实现额外的化学对比度28,39。
CARS 和 SRS 已被广泛用于高化学选择性地研究脂质组成。然而，这些技术的应用不仅限于脂质的定量分析。SRS 已被应用于药物分布42、蛋白质合成<sup class...

拉曼散射现象最早于1928年由C. V. Raman观察到1。当入射光子与样品相互作用时，可能发生自发的非弹性散射事件，其中光子的能量变化与被分析化学物质的振动跃迁相匹配。该过程无需使用化学标记物，因此成为一种多功能、无标记的化学分析工具，同时可最大限度地减少对样品的干扰。尽管具有上述优势，自发拉曼散射的散射截面较低（通常比红外[IR]吸收截面低1011倍），这导致分析需要较长的采集时间2。因此，提高拉曼散射过程的灵敏度对于推动拉曼技术在实时成像中的应用至关重要。
显著增强拉曼散射灵敏度的有效方法之一是利用相干拉曼散射（CRS）过程，该过程通常使用两束激光脉冲激发分子的振动跃迁3,4。当两束激光之间的光子能量差与样品分子的振动模式相匹配时，将产生强烈的拉曼信号。用于成像的两种最常见的CRS过程是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）5。在过去的二十年中，技术的发展已使CARS和SRS显微技术成为对生物样品中化学变化进行无标记定量分析和解析的有力工具。
基于CARS显微技术的化学成像可追溯至1982年，当时Duncan等人首次应用激光扫描获取CARS图像6。随着激光扫描多光子荧光显微技术的广泛应用，CARS显微技术的现代化进程大大加快7。Xie课题组早期利用高重复频率激光器的研究，推动CARS发展成为一种高速、无标记的化学成像平台，可用于生物样品中分子的表征8,9,10。CARS成像面临的主要问题之一是存在非共振背景信号，这会降低图像对比度并扭曲拉曼光谱。为此，研究人员已做出诸多努力，旨在抑制非共振背景11,12,13,14,15，或从CARS光谱中提取共振拉曼信号16,17。另一项显著推动该领域发展的进步是高光谱CARS成像技术，该技术可实现每个图像像素的光谱映射，从而提高化学选择性18,19,20,21。
受激拉曼散射（SRS）是一种比共聚焦反斯托克斯拉曼散射（CARS）更晚发展的成像技术，尽管其发现时间更早22。2007年，研究人员首次报道了使用低重复频率激光源实现的SRS显微成像23。随后，多个研究团队展示了利用高重复频率激光器实现的高速SRS成像24,25,26。与CARS相比，SRS显微技术的主要优势之一是不存在非共振背景信号27，尽管SRS仍可能受到交叉相位调制（XPM）、瞬态吸收（TA）、双光子吸收（TPA）和光热效应（PT）等其他背景干扰28。此外，SRS信号与样品浓度呈线性关系，而CARS的信号强度与浓度呈二次关系29。这一特性简化了化学定量分析和光谱解混过程。多色及高光谱SRS技术已发展出多种形式30,31,32,33,34,35,36，其中光谱聚焦是目前化学成像中最常用的方法之一37,38。
CARS 和 SRS 均需要将泵浦光和斯托克斯激光束聚焦到样品上，以匹配分子的振动跃迁，从而实现信号激发。CARS 和 SRS 显微镜在许多方面也具有共性。然而，这两种过程背后的物理机制以及这些显微技术中涉及的信号检测存在差异3,39。CARS 是一种参量过程，不涉及光子与分子之间的净能量耦合3。而 SRS 则是一种非参量过程，会导致光子与分子系统之间的能量转移27。在 CARS 中，会生成一个新的反斯托克斯频率信号，而 SRS 则表现为泵浦光与斯托克斯激光束之间的能量转移。
CARS 信号满足公式（1）28。
<img alt="相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）方程，光强公式，I_CARS 方程。" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">     (1)
同时，SRS 信号可表示为公式（2）28。
<img alt="受激拉曼散射公式，ΔISRS ∝ Im(χ(3)) Ip Is，与光信号分析相关。" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">    (2)
其中，Ip、Is、ICARS 和 ΔISRS 分别表示泵浦光束、斯托克斯光束、CARS 信号和 SRS 信号的强度。χ(3) 为样品的三阶非线性光学 susceptiblity，是一个由实部和虚部构成的复数值。
这些方程描述了相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）的光谱特征以及信号与浓度之间的依赖关系。由于物理机制的不同，这两种显微技术采用了截然不同的检测方案。CARS 的信号检测通常涉及对新生成的光子进行光谱分离，并使用光电倍增管（PMT）或电荷耦合器件（CCD）进行检测；而对于 SRS，则通常通过光学调制器对泵浦光和斯托克斯光之间的能量交换进行高速强度调制，并利用光电二极管（PD）结合锁相放大器进行解调来测量该信号。
尽管近年来在CARS和SRS两个领域已有大量技术进展和应用发表，但在同一平台上对这两种相干拉曼散射（CRS）技术进行系统性比较的研究尚未见报道，尤其是在高光谱CARS和SRS显微成像方面。在灵敏度、空间分辨率、光谱分辨率和化学分辨能力方面进行直接比较，将有助于生物学家选择最适合化学定量分析的技术方法。本实验方案提供了基于飞秒激光系统和光谱聚焦技术，构建同时具备高光谱CARS和SRS双模态成像功能平台的详细步骤。本文在前向探测模式下对这两种技术的光谱分辨率、检测灵敏度、空间分辨率以及细胞成像对比度进行了比较。

<table><tbody><tr><td>二维振镜扫描系统</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>声光调制器</td><td>Isomet</td><td>M1205-P80L-0.5</td><td></td></tr><tr><td>声光调制器驱动器</td><td>Isomet</td><td>532B-2</td><td></td></tr><tr><td>数据采集卡</td><td>National Instruments</td><td>PCle 6363</td><td>定制滤光片（980 sp）</td></tr><tr><td>延迟线平台</td><td>Zaber</td><td>X-LSM050A</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Millipore Sigma</td><td>151882-100G</td><td></td></tr><tr><td>用于光束合束的二向色镜</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP1000</td><td></td></tr><tr><td>用于信号分离的二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF776-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>MiliporeSigma</td><td>200-664-3</td><td></td></tr><tr><td>MIA PaCa-2 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1420</td><td></td></tr><tr><td>飞秒激光系统</td><td>Spectral Physics</td><td>InSightX3+</td><td></td></tr><tr><td>用于CARS的滤光片</td><td>Chroma</td><td>AT655/30m</td><td></td></tr><tr><td>用于SRS的滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET980sp</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棒</td><td>Lattice Electro Optics</td><td>SF-57</td><td></td></tr><tr><td>半波片</td><td>Newport</td><td>10RP02-51; 10RP02-46</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2020</td><td>National Instruments</td><td></td><td>这是图像采集软件</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>显微镜机身</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Origin Pro 2019b</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>这是光谱拟合软件</td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TBS2204B</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td></td></tr><tr><td>PMT探测器</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>PMT电压放大器</td><td>Advanced Research Instrument Corp.</td><td>PMT4V3</td><td></td></tr><tr><td>偏振分束立方体</td><td>Thorlabs</td><td>PBS255</td><td></td></tr><tr><td>接线端子板</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr></tbody></table>

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术是目前应用最广泛的相干拉曼散射成像技术。高光谱SRS和CARS成像可在每个像素点提供拉曼光谱信息，从而更有效地分辨不同化学成分。尽管这两种技术均需要两束激发激光，但它们的信号检测方式和光谱特性存在显著差异。本实验方案的目标是在同一平台上实现高光谱SRS和CARS成像，并对这两种显微技术在不同生物样品成像中的表现进行比较。采用光谱聚焦方法，利用飞秒激光器获取光谱信息。通过标准化学样品，在相同的激发条件下（即样品处的激光功率、像素驻留时间、物镜、脉冲能量），比较SRS与CARS的灵敏度、空间分辨率和光谱分辨率。同时并列对比CARS与SRS在生物样品成像中的对比度差异。对CARS与SRS性能的直接比较将有助于为化学成像选择最优的成像模式。

光谱分辨率的比较 
图2比较了使用DMSO样品时，高光谱受激拉曼散射（SRS）（图2A）与相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）（图2B）显微技术的光谱分辨率。对于SRS光谱，采用两个洛伦兹函数（见实验方案步骤2.3）对光谱进行拟合，并利用2,913 cm-1峰得到14.6 cm-1的分辨率。对于CARS，则使用带有高斯背景的双峰拟合函数（见实验方案步骤2.3）进行拟合，获得17.1 cm-1的光谱分辨率。这些结果表明，在相同的测量条件下，SRS的光谱分辨率优于CARS。CARS光谱分辨率降低主要归因于非共振背景的参与。此外，发现SRS和CARS的对称峰（2,913 cm-1）与非对称峰（2,995 cm-1）的峰强比存在显著差异。这是由于信号与三阶非线性光学 susceptibilit y之间的相关性不同所致，如公...

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS 能提供更优的对比度和光谱分辨率，而两种方法的灵敏度相似。

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术是最广泛使用的相干拉曼散射成像……

本方案比较了两种应用最广泛的高光谱相干拉曼散射技术，即相干反斯托克斯拉曼散射和受激拉曼散射过程，有助于生物学家为其生物学应用选择最佳的成像模式。利用内源性振动特征，相干拉曼光谱技术能够在无需外源性标记的情况下绘制化学信息和生物样本的分布图。相干拉曼显微技术已拓展了我们对细胞代谢、分布成像、药物分布、疾病诊断以及化学变化定量分析的理解。该技术需要在光学和光谱学方面具备充分的训练。我建议在使用此技术前，先阅读几篇综述文章，并接受专家的培训。首先，通过将一片双面胶带贴在盖玻片上，并从胶带中间裁剪出一个较小的矩形区域，从而为样品的放置留出一个开放区域，以制备成像载玻片。用移液器吸取1至2微升纯DMSO，将液滴加至空腔中央。小心放置上层盖玻片，并轻轻按压盖玻片边缘以密封样品室，注意确保DMSO样品不与胶带边缘接触。对于灵敏度实验，用重水配制DMSO的系列稀释液，浓度范围为50%至0%。取每种溶液1至2微升，按前述方法制备压片样品。将样品置于显微镜载物台上，根据物镜或聚光镜的需要，加入水或浸油。适当移动视野中DMSO液滴的边缘，调节物镜以获得最佳焦距，然后使用科勒照明法居中调节聚光镜，并完全打开聚光镜上的光圈。接下来，将泵浦光束的波长调至800纳米，以针对2913波数的CH3峰，并通过调节半波片，将泵浦光束和斯托克斯光束的功率均设置为显微镜前约30毫瓦。进行受激拉曼散射（SRS）时，将锁相放大器的增益设为约10，时间常数设为7微秒，确保该时间常数小于像素驻留时间。使用200×200的像素数和约100×100平方微米的扫描尺寸设置图像采集参数及采集软件，确保图像中同时包含DMSO液滴和空白区域，然后扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。接下来，在监控实时图像的同时，扫描斯托克斯泵浦光束中的电动延迟器，调节延迟直至信号达到最大。移动DMSO液滴以覆盖整个视野，并检查DC信号的最大值是否位于图像中心，因为信号依赖于泵浦光束。通过调节镜片位置或成像软件中的电压偏移来调整泵浦光束的位置。在完成DC优化后，调节斯托克斯光束的镜片，直至交流（AC）信号达到最大，同时调整阈值使显示饱和度约为50%，并确保饱和区域位于图像中心。如果未达到理想效果，仅需微调斯托克斯光束中的反射镜，并在对准时通过实时监测信号来获取对准质量的实时反馈。进行信噪比分析时，打开 ImageJ 软件，依次点击“文件”、“导入”，然后从下拉菜单中选择“文本图像”和“打开”选项，导入已保存的 DMSO 样品文本文件。图像导入后，按下 Control+Shift+C 调出亮度与对比度功能，然后在亮度与对比度功能中反复点击“自动”按钮，直至 DMSO 样品区域呈现饱和状态，以确定样品的最大信号值。接下来，点击 ImageJ 界面中的椭圆选择工具，圈选饱和 DMSO 区域的一小部分。选中后，按 M 键测量所选区域的平均值和标准差。在测量背景时，调整“亮度与对比度”功能中的滑块，直到可以观察到空白区域的信号，然后点击椭圆选择工具并圈选背景区域，确保所选区域不含 DMSO。随后，按 M 键以测量所选区域的统计值。接下来，通过测量噪声的平均值、信号的平均值以及标准偏差，按照之前演示的方法计算信噪比（SNR）。为了处理高光谱 CRS 图像，单击“文件”菜单，依次选择“导入”、“文本图像”，然后选择“打开”选项来导入文本文件。导入后，单击图像，然后依次选择堆栈、工具和“将拼贴转换为堆栈”选项，将文件转换为图像堆栈，随后滚动拼贴画面直至可见第一个DMSO峰。在DMSO区域选择一个范围，单击图像，然后依次选择堆栈和“Z轴轮廓分析”选项，绘制强度随帧数变化的谱图。接下来，单击列表并复制轮廓数据，以提取原始光谱数据。为了将重建的光谱转换为频率单位，使用DMSO的对称与非对称CH伸缩振动峰及其对应的帧号进行线性回归。DMSO的光谱分辨率通过高光谱受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像进行测量，结果显示分辨率分别为14.6和17.1波数，表明SRS具有更高的光谱分辨率。在0.1%和0.01%浓度下获取了DMSO的SRS光谱，其中2913波数处的峰在0.1%浓度下可被分辨，而在0.01%浓度下则无法分辨，表明检测限介于0.1%至0.01%DMSO之间。相位恢复后的CARS光谱显示，0.1% DMSO的2913波数峰可以被清晰分辨，而0.01% DMSO则无法分辨，表明检测限介于这两个浓度之间。MIA PaCA-2细胞的SRS和CARS强度分布结果显示，SRS信号的分辨率为398.6纳米，而CARS信号的分辨率提高了1.2倍，达到330.3纳米。在不同光学延迟位置下获取的MIA PaCA-2细胞SRS和CARS图像显示，SRS中脂滴呈现为明亮的点状结构且信号最强，而CARS的对比度则显著降低。然而，通过将光谱聚焦调整至37波数的红移，可同时提升SRS和CARS的脂质对比度。SRS光谱显示，脂滴在2850波数处的信号强度明显高于其他细胞器，而CARS光谱则表现出较小的红移。为了优化相干拉曼散射信号，首先应找到样品的焦平面，然后调节光延迟，最后微调反射镜，直至信号达到最大值。其他泵浦-探测技术（如瞬态吸收）本质上已集成到 CRS 平台中。该技术在测量强光吸收性非荧光分子的吸收动力学方面功能强大。此方法使研究人员能够以无标记的方式观察小分子，并具有高化学细胞活性。它还允许研究人员观察脂质代谢、细胞内动态变化以及药物分布的变化。

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高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微镜在化学成像中的应用的直接比较

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。...

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。...

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D2O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。...

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。...

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

可视化髓鞘化是许多研究神经系统研究人员的重要目标。CARS...

相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

学习高光谱相干反斯托克斯拉曼散射与受激拉曼散射显微镜技术，比较两者在化学成像中的空间分辨率、对比度和光谱分辨率差异，为生物学研究选择最佳无标记成像方法。

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

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