高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较
2022年4月28日
本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS 能提供更优的对比度和光谱分辨率，而两种方法的灵敏度相似。
本方案比较了两种应用最广泛的高光谱相干拉曼散射技术，即相干反斯托克斯拉曼散射和受激拉曼散射过程，有助于生物学家为其生物学应用选择最佳的成像模式。利用内源性振动特征，相干拉曼光谱技术能够在无需外源性标记的情况下绘制化学信息和生物样本的分布图。相干拉曼显微技术已拓展了我们对细胞代谢、分布成像、药物分布、疾病诊断以及化学变化定量分析的理解。
该技术需要在光学和光谱学方面具备充分的训练。我建议在使用此技术前，先阅读几篇综述文章，并接受专家的培训。首先，通过将一片双面胶带贴在盖玻片上，并从胶带中间裁剪出一个较小的矩形区域，从而为样品的放置留出一个开放区域，以制备成像载玻片。
用移液器吸取1至2微升纯DMSO，将液滴加至空腔中央。小心放置上层盖玻片，并轻轻按压盖玻片边缘以密封样品室，注意确保DMSO样品不与胶带边缘接触。对于灵敏度实验，用重水配制DMSO的系列稀释液，浓度范围为50%至0%。取每种溶液1至2微升，按前述方法制备压片样品。
将样品置于显微镜载物台上，根据物镜或聚光镜的需要，加入水或浸油。适当移动视野中DMSO液滴的边缘，调节物镜以获得最佳焦距，然后使用科勒照明法居中调节聚光镜，并完全打开聚光镜上的光圈。接下来，将泵浦光束的波长调至800纳米，以针对2913波数的CH3峰，并通过调节半波片，将泵浦光束和斯托克斯光束的功率均设置为显微镜前约30毫瓦。
进行受激拉曼散射（SRS）时，将锁相放大器的增益设为约10，时间常数设为7微秒，确保该时间常数小于像素驻留时间。使用200×200的像素数和约100×100平方微米的扫描尺寸设置图像采集参数及采集软件，确保图像中同时包含DMSO液滴和空白区域，然后扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。接下来，在监控实时图像的同时，扫描斯托克斯泵浦光束中的电动延迟器，调节延迟直至信号达到最大。
移动DMSO液滴以覆盖整个视野，并检查DC信号的最大值是否位于图像中心，因为信号依赖于泵浦光束。通过调节镜片位置或成像软件中的电压偏移来调整泵浦光束的位置。在完成DC优化后，调节斯托克斯光束的镜片，直至交流（AC）信号达到最大，同时调整阈值使显示饱和度约为50%，并确保饱和区域位于图像中心。
如果未达到理想效果，仅需微调斯托克斯光束中的反射镜，并在对准时通过实时监测信号来获取对准质量的实时反馈。进行信噪比分析时，打开 ImageJ 软件，依次点击“文件”、“导入”，然后从下拉菜单中选择“文本图像”和“打开”选项，导入已保存的 DMSO 样品文本文件。图像导入后，按下 Control+Shift+C 调出亮度与对比度功能，然后在亮度与对比度功能中反复点击“自动”按钮，直至 DMSO 样品区域呈现饱和状态，以确定样品的最大信号值。
接下来，点击 ImageJ 界面中的椭圆选择工具，圈选饱和 DMSO 区域的一小部分。选中后，按 M 键测量所选区域的平均值和标准差。在测量背景时，调整“亮度与对比度”功能中的滑块，直到可以观察到空白区域的信号，然后点击椭圆选择工具并圈选背景区域，确保所选区域不含 DMSO。
随后，按 M 键以测量所选区域的统计值。接下来，通过测量噪声的平均值、信号的平均值以及标准偏差，按照之前演示的方法计算信噪比（SNR）。为了处理高光谱 CRS 图像，单击“文件”菜单，依次选择“导入”、“文本图像”，然后选择“打开”选项来导入文本文件。
导入后，单击图像，然后依次选择堆栈、工具和“将拼贴转换为堆栈”选项，将文件转换为图像堆栈，随后滚动拼贴画面直至可见第一个DMSO峰。在DMSO区域选择一个范围，单击图像，然后依次选择堆栈和“Z轴轮廓分析”选项，绘制强度随帧数变化的谱图。接下来，单击列表并复制轮廓数据，以提取原始光谱数据。
为了将重建的光谱转换为频率单位，使用DMSO的对称与非对称CH伸缩振动峰及其对应的帧号进行线性回归。DMSO的光谱分辨率通过高光谱受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像进行测量，结果显示分辨率分别为14.6和17.1波数，表明SRS具有更高的光谱分辨率。在0.1%和0.01%浓度下获取了DMSO的SRS光谱，其中2913波数处的峰在0.1%浓度下可被分辨，而在0.01%浓度下则无法分辨，表明检测限介于0.1%至0.01%DMSO之间。
相位恢复后的CARS光谱显示，0.1% DMSO的2913波数峰可以被清晰分辨，而0.01% DMSO则无法分辨，表明检测限介于这两个浓度之间。MIA PaCA-2细胞的SRS和CARS强度分布结果显示，SRS信号的分辨率为398.6纳米，而CARS信号的分辨率提高了1.2倍，达到330.3纳米。在不同光学延迟位置下获取的MIA PaCA-2细胞SRS和CARS图像显示，SRS中脂滴呈现为明亮的点状结构且信号最强，而CARS的对比度则显著降低。
然而，通过将光谱聚焦调整至37波数的红移，可同时提升SRS和CARS的脂质对比度。SRS光谱显示，脂滴在2850波数处的信号强度明显高于其他细胞器，而CARS光谱则表现出较小的红移。为了优化相干拉曼散射信号，首先应找到样品的焦平面，然后调节光延迟，最后微调反射镜，直至信号达到最大值。
其他泵浦-探测技术（如瞬态吸收）本质上已集成到 CRS 平台中。该技术在测量强光吸收性非荧光分子的吸收动力学方面功能强大。此方法使研究人员能够以无标记的方式观察小分子，并具有高化学细胞活性。
它还允许研究人员观察脂质代谢、细胞内动态变化以及药物分布的变化。
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概述
本方案比较了两种应用最广泛的高光谱相干拉曼散射技术：相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）。该研究有助于生物学家为生物学应用选择最佳的成像模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 成像技术
背景
- 相干拉曼光谱可对生物样本中的化学信息进行成像。
- 该技术无需外源性标记，利用内源性振动特征实现检测。
- 该方法有助于深入理解细胞代谢过程和药物分布情况。
- 为有效使用该技术，建议接受光学与光谱学方面的专业培训。
研究目的
- 比较CARS和SRS技术。
- 帮助研究人员选择最佳的成像方式。
- 评估两种方法的分辨率、灵敏度和成像对比度。
使用的方法
- 将CARS与SRS集成于同一显微镜平台进行比较。
- 评估空间分辨率、对比度及光谱分辨率。
- 利用固有的振动特征进行成像。
- 使用双面胶带制备用于样品放置的成像载玻片。
主要结果
- CARS 展现出更优的空间分辨率。
- SRS 提供了更佳的对比度和光谱分辨率。
- 两种技术表现出相似的灵敏度。
- 该发现为生物学研究中成像技术的选择提供了指导。
结论
- 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）在成像方面均具有独特优势。
- 了解这些差异对于生物应用至关重要。
- 有效的实施需要充分的培训和准备工作。
常见问题
行业重要性概述
高光谱SRS与CARS显微技术的直接比较助力生物制药研究&D团队可选择最佳的化学成像模式，用于生物样本的无标记分析。该技术能够高置信度地绘制细胞代谢、药物分布及化学变化图谱，且无需外源性标记。在发现阶段对成像平台进行战略性选择，可减少机制上的不确定性，并提升下游转化研究的预测价值。
生物制药中的战略应用&D
早期发现与靶点验证
- 能够在与疾病相关的系统中检测细胞代谢和化学成分。
- 通过无标记的药物分布和代谢变化成像，支持功能靶点的验证。
- 通过直接可视化生物样本中的化学特征，助力机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为化合物筛选和表型检测制备经过验证的无标记成像系统。
- 提供定量、可重复的光谱和空间输出，用于检测标准化。
- 实现对化合物对细胞化学和结构影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过原位量化化学变化，将成像结果与转化生物标志物发现相对应。
- 支持非破坏性、高分辨率成像，实现从早期发现到临床前验证的连续性。
- 通过阐明候选分子的生物学效应，降低推进决策中的风险。
流程与工作流整合
高光谱SRS和CARS显微技术通过在多个流程阶段实现高通量、无标记的化学成像，融入从发现到临床前研究的连续进程。
- 发现生物学：通过直接化学成像支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的成像结果，用于检测方法开发和化合物筛选。
- 分析：提供光谱和空间测量数据，用于比较不同生物状态及化合物效应。
- 转化研究：通过非破坏性成像促进生物标志物的匹配以及临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，适用于多种生物模型和研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证和化合物分析中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过可重复、定量的输出结果和可扩展的实验方案，实现成像工作流程的标准化。
- 战略价值：在研发早期明确生物学效应，从而优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于可靠的化学成像数据，实现风险调整后的候选分子优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备光学、光谱学和相干拉曼成像方面的科学专业知识。
- 需要先进的仪器设备和分析基础设施，用于高光谱成像和数据处理。
- 需要跨团队统一成像方案和数据分析工作流程的标准。
- 可适用于多种生物模型，但可能需要针对特定样本类型进行优化。
- 实际限制包括需要专业培训以及光学组件的精确对准。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:00
Preparation of Samples for Hyperspectral CRS Imaging
1:55
Instrumental Setup for Hyperspectral CRS Imaging
4:18
Image Analysis and Data Processing
6:51
Results: Comparing the Resolution, Sensitivity, and Imaging Contrasts of SRS and CARS
8:54
Conclusion
