解剖、固定和可视化 果蝇 蛹

该方案意义重大，因为它允许您在果蝇蛹的结部上进行免疫组织化学，即使在它们以前受伤并进行实时成像之后，也不会破坏组织的结构。该技术允许您利用已经可用的各种抗体染色剂，对上皮中的细胞，结构和蛋白质进行染色。我们已经将这种技术用于免疫化学和DNA染色。

然而，这种解剖可以用作其他技术的起点，例如原位杂交。这个方案可能很困难，因为蛹小而精致，所以它需要稳定的手来进行解剖。而且随着经验的积累，它变得更容易，所以在重要的蛹之前练习不重要的蛹。

首先在P5阶段使用解剖镜小心地去除三到四个蛹，并将它们收集在胶带旁边的显微镜载玻片上。接下来，将蛹分开至少一个宽度，放在胶带上，腹侧向下。现在，将一滴胶水放在parrafin薄膜上，或离心管盖中。

接下来，将0.1至10微升移液器吸头的末端浸入胶水滴中，并在盖玻片上轻敲移液器尖端两次，距离角落一厘米乘一厘米，形成一行粘合胶，大约是蛹长度的一半。接下来，预设一个P2移液器在两微升，一个P200移液器在200微升的体积，并用吸头适合它们。现在，在头部侧面附近插入镊子，并轻轻地取出尽可能多的瞳孔，从前部到后部工作。

接下来，用一对钝镊子抓住蛹发育中的腿，小心翼翼地将蛹从箱子里拉出来。将蛹放在盖玻片的角落。用钝镊子抓住后腹部或发育中的翅膀处的蛹。

将蛹的腹侧抬起并放置下来，放入粘合胶水的线中。快速填充P2移液器，用两微升单强度PBS，含有0.1毫摩尔钙，并将其保持在空气中，排出刚好足以在尖端形成一个小气泡。触摸溶液的小气泡，到胸部底部的蛹的一侧，然后在另一侧重复该过程。

接下来，用200微升单强度PBS，用0.1毫摩尔钙填充P200移液器，然后将移液器的尖端放在胸部，并将内容物排出以完全浸没蛹，剩余的胶粘胶会立即固化。现在，去除大约100微升的PBS溶液，使蛹几乎不被淹没，然后立即进入下一步。要剖析公仔，抓住一把微解剖剪刀，将手柄的一侧支撑在惯用手的食指和中指上，使惯用手的拇指施加切割力。

接下来，用非惯用手的无名指将剪刀的颈部稳定在非惯用手的中指上，同时支撑盖玻片。现在，在背腹部中间剪一下，形成一个大约0.2至0.5毫米的小孔。为了分离背侧组织，从后部到前部通过外皮进行0.5至0.75毫米的小切口，最后，这些将包围背侧组织。

此外，重复蛹另一侧的后部到前部切口。旋转解剖阶段，以便在必要时通过头部进行干净切割。通过查看插孔是否易于移动来确定插孔是否已被隔离。

在盖玻片的中心添加约200微升单强度PBS，并通过轻轻地将移液器吸头从新液滴拖动到原始液滴，将其连接到原始解剖液滴。使用一对钝镊子，轻轻地将隔离的公仔推或拖动到盖板的中心滑动并旋转，使内侧朝上。用钝镊子按住鼻梁，按压腹部或头部部分。

使用一对锋利的镊子和从200微升移液管中轻轻排出单强度PBS，去除任何剩余的脂肪身体，肌肉带或血液提升，以完全暴露单层上皮。一旦组织清洁，使用200微升移液器去除尽可能多的PBS溶液，使用解剖仪进行监测，以避免吸入公室。在最大程度地去除液体后，使用吸收性组织，小心地擦去剩余的胶水，瞳孔胴体和盖玻片上的其他碎屑。

现在，加入150至200微升4%PFA，并在室温下固定20分钟。根据解剖速度，在第一个蛹固定在单独的盖玻片上时，可以再解剖一到三个蛹。取出PFA，并用单强度PBS更换，清洗一次公仔30秒。

如果继续进行抗体染色，则在单强度PBS或PBST中进行三次五分钟的洗涤，以在抗原是细胞内时使组织通透。样品可以储存在单强度PBS中，0.02%叠氮化钠在加湿室中过夜。染色后，准备一个新的盖玻片，称为顶部，带有支撑。

通过使用由顶部中间的22 x 22盖滑（相距约一厘米）制成的垫片，创建大约200微米的间隙。要粘附，用一层薄薄的指甲油将垫片的接缝涂在离中心最远的地方，然后让它干燥。从样品中取出尽可能多的水溶液，并立即将两滴防褪色贴样介质涂在样品上。

如有必要，使用干净的锋利镊子将镊子定位在防褪色安装介质液滴中心。将盖玻片与公套一起放在大约10×40毫米的泡沫支撑物上，以提升样品，使其不会粘附在工作表面上。在解剖仪下，将顶部缓慢降低到样品上。

一旦防褪色安装介质与顶部相遇，轻轻释放，并让毛细管作用将顶部向下拉动。将另一块泡沫放在顶部，并使用标准显微镜载玻片作为砝码，以轻轻地哄住样品盖玻片，顶部和垫片之间的防褪色安装介质。5-10分钟后，使用吸收性组织通过轻轻触摸盖玻片的边缘来吸走任何多余的防褪色安装介质。

轻轻地将指甲油涂抹在盖玻片的每个角落，将它们粘在一起。为防止盖玻片移动并损坏背部组织，请先避免涂覆边缘，一旦角落的指甲油变干，涂漆盖板的所有边缘都滑动以密封。该协议允许使用抗体和细胞染色剂对固定样品进行成像。

该协议可用于以前受伤和实时成像的样本。对实时和固定图像的比较表明，该方案保留了组织结构和形态。该协议允许对解剖的notum有不同的看法。

顶端视图是可视化角质层下方的上皮细胞边界和细胞核的理想选择。基底视图可更好地显示伤口边缘的基部结构。切除过程中，确保不要弯曲或翘曲鼻孔。

通过避开侧边来切割一块扁平的碎片。切勿切太靠近腹侧，否则在安装过程中会变形。在解剖瞳孔后，可以应用许多其他技术，例如电子显微镜和横截面。

这些技术可以允许对以前成像的结构进行非常详细的研究。