Name: 解剖、固定和可视化 果蝇 蛹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习果蝇蛹解剖、固定和可视化技术，用于免疫组织化学分析。该方法可完整保存组织原始结构，适用于完整及受损样本，助力发育生物学研究。

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作者感谢 M. Shane Hutson 博士建立了用于蛹期创伤的激光消融系统，并感谢他在本实验方案的开发过程中所做出的贡献和提供的反馈意见。本研究工作由 APM 和 M. Shane Hutson 获得的 1R01GM130130 项目资助。JW&#160;由 2T32HD007502-21 项目资助。

Drosophila melanogaster（果蝇）在25 °C条件下饲养于标准的玉米粉-糖蜜培养基中。实验所用为EGFP标记的组蛋白H2A蛹（w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a），果蝇来自公共品系保藏中心（见材料表）。
1. 蛹的固定
<ol>
	<li>应用2&#34; 将双面胶带条贴到显微镜载玻片上。</li>
	<li>在25 °C培养的试管中鉴定出白色预蛹，并用记号笔在试管外标记其位置。将试管放回25 °C继续培养。 
	注意：白色预蛹的特征是其静止不动、体色呈白色且气门外翻。这些特征在蛹壳形成后0-1小时（APF）或P1期出现。8.</li>
	<li>12-15 小时后，在解剖显微镜下小心移除 3-4 只指定的蛹（不要压破），并将其收集到载玻片上胶带旁。 
	注意：蛹现处于 P5 阶段，其前端可见外翻的头囊8.</li>
	<li>将蛹腹面朝下放置在胶带上，各蛹之间至少间隔一个蛹的宽度。</li>
	<li>在石蜡膜上滴一滴粘合胶（参见 材料表）或离心管盖中。将 0.1–10 µL 移液器吸头（无移液器）末端浸入一滴粘合胶中。将吸头轻触 24 mm × 60 mm（1.5 厚度）盖玻片两次，位置距角落 1 cm × 1 cm，形成一条长度约为蛹体一半的胶线。</li>
	<li>将0.2–2 µL（P2）移液器预设为2 µL，将200 µL（P200）移液器预设为200 µL，并装上吸头，使其准备好吸取1x PBS + 0.1 mM Ca2+，这将使粘合剂在接触时迅速固化。</li>
	<li>插入镊子（参见 材料表) 靠近头部侧面，从前往后轻轻取下外壳9尽可能移除大部分虫茧。用一对钝头镊子夹住蛹体正在发育的腿部，小心地将蛹从其虫茧中抽出。 
	注意：蛹腹面出现的小型破裂不会对本实验操作造成不利影响。</li>
	<li>将蛹放置在盖玻片的角落。</li>
	<li>用钝头镊子夹住蛹的腹部后端或正在发育的翅膀，提起后将蛹的腹面朝下放入胶粘剂的线条中。</li>
	<li>用P2移液器迅速吸取2 µL含0.1 mM Ca的1x PBS2+, 并悬于空中，轻轻排出适量液体，使枪头尖端形成一个小气泡（0.25–0.5 µL）。</li>
	<li>用溶液的小气泡轻触蛹胸部基部的一侧，然后重复该操作&#160;另一侧。 
	注意：这将使少量粘合胶凝固，以固定蛹的位置。通常，并非所有溶液都会被使用。</li>
	<li>用P200移液器吸取200 µL含0.1 mM Ca的1x PBS2+然后将移液器尖端置于胸部上方，排出液体以完全浸没蛹体。剩余的粘合胶会立即固化。</li>
	<li>移除约 100 µL PBS 溶液，使蛹体刚好浸没，随后立即进行下一步操作。 
	&#8203;注意：对于未损伤的样品，从步骤 1.1 开始；对于已损伤并部分解剖的样品，从步骤 1.5 开始。损伤 通过 激光消融技术此前已有描述14,21固定、解剖和封片步骤需在解剖显微镜下进行。</li>
</ol>
2. 解剖盾片
<ol>
	<li>用惯用手的食指和中指夹住显微解剖剪的一侧手柄，拇指施加剪切力来操作剪刀（图2A、B）。</li>
	<li>用非惯用手的中指稳定剪刀颈部，同时用无名指固定盖玻片。</li>
	<li>在腹部背侧中部剪开一个小孔，直径约0.2–0.5 mm。通常会有少量血淋巴流出，这是成功穿刺的良好标志。</li>
	<li>从后端向前端方向，在体壁上做一系列0.5–0.75 mm的小切口，环绕背侧组织将其完整分离。为获得尽可能平整的组织样本，避免切得过深至腹侧；仅需去除胸部的背侧“穹顶”部分，以及头部和腹部的小段组织。</li>
	<li>在蛹体另一侧重复从前向后的切开操作。</li>
	<li>必要时旋转解剖载台，以便干净利落地切断头部。 
	注意：此时背侧体壁（即盾片）应已与蛹体其余部分分离。若组织看似已分离但难以移动，可在盾片下方再做几处小切口以助其松动。</li>
	<li>在盖玻片中央加入约200 µL的1×PBS，并用移液器枪头轻轻从新液滴向原始解剖液滴方向拖动，在两者之间形成液体通道。</li>
	<li>使用一对钝头镊子，轻柔地将分离出的盾片推或拖至盖玻片中央，并调整方向使其内侧面朝上。切勿将组织移出液滴。 
	注意：必须将盾片从原始解剖位置移开，以避免后续成像时残留的粘合胶遮挡样本。</li>
	<li>用钝头镊子压住盾片的腹部或头部区域以固定组织。使用尖头镊子和/或从200 µL移液器中轻柔吹出1×PBS，清除残留的脂肪体、肌肉带或血淋巴（如有），充分暴露单层上皮组织，使后续染色更加均匀。解剖完成的盾片应如图3A所示。</li>
	<li>组织清理干净后，使用200 µL移液器尽可能吸除PBS溶液（连同碎片及蛹的腹侧部分），同时在解剖镜下观察，避免吸走盾片。</li>
	<li>当大部分液体被移除后，用吸水纸小心擦去盖玻片上残留的粘合胶、蛹体及其他残留物。 
	注意：若盖玻片上残留少量粘合胶，只要其厚度低于背侧组织本身，就不会造成影响。</li>
	<li>加入150–200 µL 4%多聚甲醛（溶于1×PBS中），室温固定20分钟。根据解剖速度，可在第一个蛹固定期间继续解剖1个或更多&#160;蛹体。</li>
	<li>移除多聚甲醛，更换为1×PBS，清洗盾片一次，持续30秒。</li>
	<li>若后续进行抗体染色，且抗原位于细胞内，则需用1×PBS或1×PBST（补充文件1）清洗5分钟，重复3次，以实现组织通透。</li>
	<li>将样本置于含0.02% NaN3的1×PBS中，在湿盒内过夜保存；若计划进行组织染色，则在封闭液中（补充文件1）4℃孵育过夜。</li>
</ol>
3. 背部染色
注意：使用抗体或细胞染料染色时，请遵循以下步骤。组织切片不得从溶液中取出，否则可能导致组织卷曲。因此，应调整染色方案，使其完全在盖玻片上进行，并将样本置于湿化 chamber 中，所有步骤超过 5 分钟的均需如此。&#160;在洗涤过程中，可在解剖显微镜下观察样本，以避免意外吸走组织。
<ol>
	<li>为观察细胞边界，加入200 µL抗FasIII一抗（小鼠IgG2a，见材料表），用封闭缓冲液&#160;+ 0.02% NaN3按1:8稀释，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用200 µL 1x PBS + 0.02% NaN3在室温下洗涤3次，每次1小时，以去除多余的一抗。</li>
	<li>加入200 µL二抗（Cy3标记的抗小鼠IgG2a，1:200稀释）溶于封闭缓冲液&#160;+ 0.02% NaN3中，室温孵育2小时。</li>
	<li>用200 µL 1x PBS + 0.02% NaN3在室温下洗涤3次，每次1小时，以去除多余的二抗。</li>
	<li>为观察细胞核，将样品置于1 µg/mL DAPI溶液中孵育45分钟，以确保染料充分穿透肌肉条带；此类组织若使用含DAPI的封片剂进行固定，染色效果不佳。</li>
	<li>用200 µL 1x PBS + 0.02% NaN3在室温下洗涤3次，每次5分钟，以去除多余的DAPI，随后将样品置于200 µL 1x PBS + 0.02% NaN3中4 °C过夜，或立即封片。</li>
</ol>
4. 背部体壁的制片与观察
<ol>
	<li>染色后，准备一个新的 24 × 60 盖玻片（上盖玻片），并配有支撑物。 
	注意：由于notum呈圆顶状，若将其完全压平会导致组织皱缩变形。在两个盖玻片之间留出间隙可使notum保持其正常形态。</li>
	<li>使用由 22 × 22 盖玻片（No. 0 厚度，约 100 µm 厚）制成的垫片，在上盖玻片中央以指甲油将垫片粘附于相距约 1 cm 处，从而形成约 200 µm 的间隙。</li>
	<li>粘附时，将垫片放置在上盖玻片上，并在垫片的远端边缘&#160;涂上一层薄而稀的指甲油，待其自然干燥。 
	注意：应仅使用稀薄、流动性好的指甲油；过稠的指甲油会在盖玻片与上盖玻片之间增加不必要的额外空间。</li>
	<li>尽可能彻底移除样本中的水溶液。</li>
	<li>立即在样本上滴加两滴（约 100 µL）抗荧光淬灭封片剂（参见 材料表）。</li>
	<li>如有必要，使用洁净且锋利的镊子将notum调整至抗荧光淬灭封片剂液滴的中央位置。</li>
	<li>将带有notum的盖玻片置于约 10 × 40 mm 的支撑物上（例如从盖玻片盒内的包装泡沫中剪下的一小块薄泡沫），以抬高样本，防止其粘附于工作台面。</li>
	<li>在解剖显微镜下，缓慢将上盖玻片放下覆盖样本。当抗荧光淬灭封片剂接触到上盖玻片时，轻轻松开，让毛细作用自然将上盖玻片拉下。 
	注意：在最初几秒内，可轻微调整盖玻片位置，而不会损伤notum。</li>
	<li>在上盖玻片上方再放置一块泡沫，并使用标准显微镜载玻片作为重物，轻柔地促使抗荧光淬灭封片剂在样本盖玻片、上盖玻片及垫片之间均匀分布。</li>
	<li>5–10 分钟后，用吸水纸轻轻接触盖玻片边缘，吸除多余的抗荧光淬灭封片剂。</li>
	<li>轻轻在盖玻片的每个角落涂抹指甲油以固定两者。待其干燥后，再将盖玻片所有边缘涂满指甲油进行密封。避免一开始就密封全部边缘，否则容易导致盖玻片移位，从而损伤背侧组织。</li>
	<li>通过荧光显微镜（参见 材料表）从背侧和/或腹侧观察notum。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤 
优化以下三个步骤将显著提高本方案的成功率。首先，在步骤 1.5 中，应用于盖玻片的粘合胶应尽量少。若粘合胶过多，蛹体会被包裹在一层厚厚的固化胶中，导致无法进行解剖；若胶体覆盖了背部体壁本身，还会遮挡样品的光线。其次，在步骤 2.3–2.6 期间，应仅去除背部体壁的顶部穹顶部分，尽可能避免损伤侧向组织。若保留了侧向组织，在封片过程中其受压会导致背部体壁中部向内弯曲，常常使其超出高数值孔径物镜的工作距离范围。第三，在清洁步骤 2.9 中，必须格外小心，避免损伤单层上皮组织。如果组织出现大面积缺失或无法检测到信号，该步骤很可能是主要原因。
故障排除 
问题1：封片后，在解剖过程中蛹从双面胶带上脱落。这是一个常见问题，尤其对于初学者而言。最佳解决方法是确保蛹壳外部完全干燥且无食物残渣。使用钝头镊子清除食物残渣，并将蛹壳在空气中干燥10-15分钟，有助于其更好地粘附于胶带。或者，在解剖过程中可用非优势手配合钝头镊子将蛹体压紧在胶带上以固定。如果问题仍然存在，可在蛹壳后端基部涂抹一小滴5-10 µL的指甲油，待其硬化，通常足以固定最难处理的蛹体。
问题2：在步骤2.3期间背板发生塌陷，或穿透体壁的初始切口不顺畅。如果难以穿透体壁，可能是由于固定步骤中使用的粘合胶过多。将解剖后的蛹置于较少的粘合胶中可改善此问题。此外，需确保显微解剖剪足够锋利。钝剪刀无法有效切割体壁，并容易导致其向内塌陷。一旦血淋巴从蛹体内溢出，应确保其中一侧剪刀刃能够进入蛹体内部，且不引起背板变形。若背板塌陷且剪刀刃无法进入蛹体，应持续进行剪切操作，直至剪刀刃成功进入蛹体内部。
问题3：在步骤2.4中，剪刀夹住或拖拽表皮。如果剪刀开始夹住或拖拽表皮，通常可换至蛹的另一侧继续操作，以“松解”表皮。若使用过于钝化的显微解剖剪，将难以在表皮上实现整齐切割，因此必须使用锋利的剪刀。
问题4：染色过程中（步骤3.1-3.6）样品被意外吸出。由于解剖的notum呈透明状，难以观察。可在盖玻片下方放置深蓝色或黑色背景以增强对比度（旧的移液器吸头架效果良好）。此外，所有溶液更换操作均可在解剖显微镜下进行。
问题5：未检测到信号或信号呈斑片状分布。在排除染色特异性问题后，若未检测到信号或信号呈斑片状，则步骤2.9（清洗）很可能是原因所在。信号缺失或呈斑片状可能源于清洗过程中上皮组织的损伤或脱落。相反，若未彻底去除肌肉带或脂肪体细胞，这些结构可能阻碍染料和抗体向背板组织的扩散，从而导致信号减弱。如果组织已受损，建议在清洗过程中操作更轻柔。如果染色可见但呈斑片状分布，则建议加强清洗力度或延长清洗时间，以尽可能去除肌肉和脂肪体。此外，在更充分清洗的基础上，延长染色时间也有助于解决此问题。
问题6：成像过程中胸背组织出现扭曲或起皱现象。组织扭曲和起皱来源于两个方面。首先，在封片过程中挤压胸背组织会导致其发生屈曲和变形。最佳解决方案是尽可能去除侧向组织，使组织穹顶尽可能短，从而能够恰好置于盖玻片间隔物之间。其次，若在解剖过程中胸背组织发生弯曲，则在封片时该弯曲无法恢复平直，因此必须格外小心，避免在解剖过程中造成胸背组织变形。在将表皮从蛹体其余部分剪离时，最容易意外造成胸背组织弯曲。此时，操作者往往倾向于将解剖剪以一定角度倾斜于蛹体进行操作，而非始终保持剪刀在样本平面内。然而，倾斜的剪刀会导致表皮被剪开时向上屈曲，而非保持平整。
现有方法、局限性及未来应用 
Wang 等人20 报道了一种可用于分离蛹表皮的类似解剖方案。该技术要求蛹体保留在其蛹壳内，并用解剖刀迅速将其切成两半。此方法不适用于此前已进行活体成像的样本，因为活体成像需要移除大部分蛹壳。由于蛹体缺乏刚性，若在蛹壳外进行切半操作会导致组织损毁，这促使了本实验方案的建立。本文详述的技术可实现背胸片的分离与固定，且可作为多种后续实验方法的第一步，例如冷冻切片、原位杂交或电子显微镜观察等。
该技术存在一些局限性。首先，解剖、固定和染色胸背板比在胸背板中对荧光标记蛋白进行活体成像更为耗时，后者仅需简单的解剖以去除蛹壳9,23。其次，与其他黑腹果蝇（Drosophila）组织的解剖相比，该解剖操作更为困难，原因是组织薄而脆弱，且表皮具有疏水性。若仅需观察黑腹果蝇上皮中的蛋白质，对固定后的胚胎、幼虫翅盘或卵巢进行免疫组织化学染色则更为简便。然而，该技术一旦掌握，便可将活体成像的优势与固定和染色技术相结合，成为一种功能强大的研究工具。
与活体成像相比，解剖/固定技术具有一些优势。通过基底（内部）视角可以更清晰地分辨基底结构（图5L,J）。最重要的是，活体成像受限于必须通过基因手段提供的荧光染料，通常需要耗时较长的遗传杂交方案。相比之下，本方案允许使用染色、免疫组织化学以及其他需要解剖和固定的实验技术。这显著增加了组织中可检测信号的数量，同时可能缩短获得实验结果所需的时间。

Drosophila melanogaster的蛹背片在过去十年中越来越多地用于活体成像研究，因为该阶段的动物既保持不动又具有透明的角质层1,2,3,4,5,6,7。然而，蛹背片的解剖和固定较为困难，导致难以在活体成像实验的基础上进行抗体染色和细胞染色。本研究的总体目标是建立一种可重复的实验方案，用于对新样本或先前已进行活体成像的样本进行蛹背片的解剖与固定，以开展抗体染色和细胞染色。
幼虫开始变态时，表皮从幼虫角质层分离，形成坚硬的蛹壳。8幼虫体轴结构被分解，新的成虫体轴结构随之发育形成。在此期间，蛹处于静止状态，适合进行活体成像。一个常被成像的组织是蛹的背胸片（pupal notum），这是一种在胸部背侧形成的成虫单层上皮组织。背胸片在去除&#160;一种简单的解剖方法&#160;去除蛹壳9然后可将整个动物进行封片，对notum进行数小时乃至数天的活体成像，使其成为研究上皮细胞在发育、稳态维持以及损伤后行为的理想组织10,11,12,13,14然而，由于notum较为脆弱，且表面覆盖着一层薄而透明的疏水性成虫表皮，因此在解剖和固定时具有较大难度。这种疏水性表皮在将notum从身体其他部分分离后，容易在水溶液中发生卷曲。因此，有关notum解剖与固定的报道极为罕见，且相关解剖步骤常未被详细描述15,16,17,18由于文献中缺乏详细的实验方案，对于研究人员而言，这几乎是无法克服的困难。 黑腹果蝇 研究人员可结合蛹的染色与活体成像进行互补研究。
该技术旨在可重复地解剖和固定先前进行过活体成像的样品，包括经过激光损伤的样品。由于活体成像需要去除蛹壳，因此该解剖技术首先去除蛹的前端蛹壳，这与以往将蛹固定或沿蛹壳切开的方案不同4,19,20。notum 是一种脆弱的组织，损伤可能进一步加剧其脆弱性。因此，为了支撑这一精细组织，在始终浸没于水性环境的条件下，将 notum 及部分头部和腹部的表皮（上皮及附着的透明成体角质层）从蛹的其余部分解离下来。该方法可降低组织卷曲而无法使用的情况发生。本技术已成功对损伤后30分钟（图1E-H）以及损伤后3小时（图1I-L）的损伤 notum 组织进行了染色。预计该方案在 notum 发育或伤口修复的整个过程中均有效。本技术将有助于希望结合蛹期 notum 活体成像能力与丰富可用的免疫组织化学试剂的研究人员。

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; Scotch 永久性双面胶带</td><td>Scotch 3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>0.1–10 &amp;micro;L uTIP 移液器吸头</td><td>Biotix</td><td>M-0011-9FC</td><td></td></tr><tr><td>22 × 22 mm No. 0 厚度盖玻片</td><td>Thomas Scientific</td><td>1207Z28</td><td></td></tr><tr><td>24 × 60 mm 盖玻片</td><td>Corning</td><td>2980-246</td><td></td></tr><tr><td>3M VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>在实验方案中称为 &quot;粘合胶&quot;</td></tr><tr><td>抗 FasIII 一抗 小鼠 IgG2a</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>7G10</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Chemical</td><td>c79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 标记的 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG2a</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-206</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 细尖镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>No. 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 细尖镊子：钝头</td><td>Fine Science Tools</td><td>No. 11254-20</td><td>频繁使用且未磨锐的镊子，或用磨刀石磨钝的镊子</td></tr><tr><td>Fisherbrand 双面磨砂载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Lumencor</td><td>Celesta 90-10512</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：EGFP 标记组蛋白 H2A</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>24163</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管泡沫塞 &quot;Flugs&quot;</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>加湿培养盒：内衬浸水滤纸并用铝箔包裹的小容器</td><td>Cole-Parmer</td><td>759075D</td><td>可使用盛放 Cole-Parmer 比色皿（759075D）的聚苯乙烯泡沫盒，加入 50 mL 水，制成优良的加湿培养盒。</td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>在实验方案中称为 &quot;吸水纸&quot;</td></tr><tr><td>Nikon Ti2 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）16%</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>塑料离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-114</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher Scientific</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>立体解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>STEMI 2000</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>全新或刚磨利的剪刀</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>在实验方案中称为 &quot;抗荧光淬灭封片剂&quot;</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>不适用于蛹背片样本。</td></tr><tr><td>X-Light V2 转盘共聚焦系统</td><td>Crest Optics</td><td>V2 L-FOV</td><td></td></tr></tbody></table>

解剖、固定与可视化 果蝇 蛹背片

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

蛹的 黑腹果蝇 在变态期间数天内不活动，在此期间它们会发育出具有薄而透明成体表皮的新身体。它们的不活动性和透明性使其成为理想的 体内 活体成像实验。许多研究集中于蛹期背侧上皮单层&#160;notum 因其易于接近且相对较大而被广泛使用。除了用于上皮力学和发育研究外，notum 还是研究伤口愈合的理想组织。在损伤后，整个上皮修复过程可通过活体成像在 6–12 小时内完整记录。尽管 notum 在活体成像中应用广泛，但极少有已发表的研究使用固定的 notum 样本。固定与染色是几乎所有其他果蝇（Drosophila）组织常用的处理方法，可充分利用种类繁多的简单细胞染料和抗体。然而，蛹期 notum 组织脆弱，在从虫体分离后容易卷曲和变形，这使得其难以与活体成像形成互补。本方案提供了一种简便的方法，用于对完整或经激光损伤后的蛹期 notum 进行固定和染色。该技术通过将蛹的腹面粘附于盖玻片上以固定虫体，随后小心剥离 notum 组织，并进行固定和染色处理。notum 上皮组织可封片于载玻片上或夹在两片盖玻片之间，以便从组织的背侧或腹侧进行成像。

该技术在未受伤的胸部背板上效果良好（图1A-D），可用于研究组织的发育与稳态过程，例如多倍体机械感受刚毛细胞的形成18，或上皮细胞从前向后的流动10。本方案同样适用于激光消融后的胸部背板（图1E-L），可在活体中利用内源性荧光蛋白（如组蛋白2-EGFP）实时分析细胞对损伤的响应（图1B,F,J）。通过免疫组织化学染色（步骤3）可进一步揭示多种结构特征，例如Fasciclin III可用于标记细胞边界（图1C,G,K）。此外，还可使用DAPI等定量染色方法（图1A,E,I）评估DNA含量的变化，包括损伤诱导的多倍化现象22。
本方案的优势在于可用于长期活体成像实验之后。由于蛹处于静止状态，可进行数小时的成像观察（图4A，B）。重要的是，该方案在解剖后不会对伤口上皮的整体结构或形态造成显著改变（图4B，C）。因此，可对组织内的特征进行长期成像，随后进一步通过免疫组织化学或细胞染色进行深入分析。
由于组织的不透明性，对其深层进行成像十分复杂，而果蝇（Drosophila）体表覆盖有蜡质的角质层8，使得深层成像更加困难。然而，利用本技术可将解剖后的胸部背板置于两张盖玻片之间，从而能够从任一侧对上皮单层进行成像：可通过角质层观察其顶端面（图5A-D），和/或观察朝向体腔的上皮基底面（图5E-H）。这两种不同视角非常适合于观察组织内不同的结构。例如，顶端视角适用于观察位于角质层下方的上皮细胞边界和细胞核（图5A-D）。而在基底视角下，这些顶端信号较难观察（图5E-H）。然而，在伤口边缘可观察到基底结构（图5J、L 黄色、白色箭头）。由于基底视角的遮挡较少，这些基底结构的信号明显更明亮。 
<img alt="细胞伤口愈合实验；显微镜图像；DAPI、Histone2EGFP、FasII；延时成像结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：解剖后固定并染色的黑腹果蝇蛹背片。（A-D）未受伤的背片。（E-H）激光消融后30分钟的损伤背片。（I-L）激光消融后3小时的损伤背片。（A,E,I）DAPI染色显示细胞核。（B,F,J）转基因表达的Histone2-EGFP在活体成像中使用，固定和染色后仍可见。（C,G,K）抗FasIII抗体染色显示，抗体染色在固定后的背片上效果良好。（D,H,L）合并图像。图像使用转盘共聚焦显微镜以40倍物镜采集，展示的是Z轴堆栈的最大强度投影，Z轴步长为0.3 µm。A-D包含263个Z轴切片，E-H包含195个切片，I-L包含53个切片。橙色虚线表示伤口边缘。L图中的比例尺为25 µm，适用于A-L所有图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜载玻片制备、实验操作、左右手视角、显微分析、实验室设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：背胸片解剖时的手部摆放位置。（A-B）持显微解剖剪时左右手的摆放视角。为防止手部抖动，应将剪刀颈部抵住非优势手的中指。剪刀需与显微镜载玻片保持平行，以避免背胸片组织发生扭曲。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学结果；两种晶型的显微镜图像，可见1 mm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：正确分离的notum 与卷曲的notum (A解剖并清理后的蛹背板已展开，准备进行固定。B蛹背板从1x PBS中取出后发生自卷曲，导致无法使用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析；组蛋白2GFP荧光显微镜成像，损伤前与损伤后，活体与固定样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：固定前与固定后的图像总体相似。 对表达核定位Histone2-EGFP的蛹期notum进行成像，(A) 激光消融前的活体样本，以及(B) 激光消融后3小时。(C) 随后将notum组织取出、解剖并按本方案所述进行固定，固定后再进行成像。伤口位置以红色星号标记。所有图像均使用转盘共聚焦显微镜，配备40倍物镜采集，Z轴步长为0.3 µm。图中显示的是损伤前34个Z轴层面（A）、损伤后3小时48个Z轴层面（B）以及解剖、固定和染色后103个Z轴层面（C）的最大强度投影图像。C图中的比例尺为25 µm，适用于A-C图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DAPI、组蛋白2EGFP和FasIII荧光信号的顶端和基底面显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：损伤背胸片的顶端和基底面成像。 所有图中展示的是同一个受损蛹期背胸片。损伤部位以红色星号标记，橙色虚线表示伤口边缘。(A-D) 从表皮外侧（顶端）对背胸片进行成像。(E-H) 从内部基底侧对背胸片进行成像。(I-L) 上排图显示背胸片的X-Z截面图像，顶端朝上，上皮层由白色三角形标示。橙色线表示下排图中所示X-Y切片的顶端-基底方向平面；在下排图中，橙色线则表示上方X-Z图像的切片平面。(I) 从顶端成像的背胸片——顶端切片。上方X-Z视图精确显示了顶端上皮层（白色三角形），该视图等同于活体成像视图。(J) 从顶端成像的背胸片——基底切片，部分被顶端组织遮挡。基底侧可见其他组织，由黄色箭头（可能为肌带）和白色箭头（可能为血细胞）指示。(K) 从基底侧成像的背胸片——顶端切片，部分被基底组织和伤口痂（中央深色区域）遮挡。(L) 从基底侧成像的背胸片——基底切片。此视图最清晰地显示了由黄色和白色箭头标示的基底组织。A,E：DAPI染色；B,F：组蛋白-EGFP；C,G：FasIII染色。图像使用20倍物镜配合转盘共聚焦显微镜采集，Z轴切片间隔为0.9 µm。A-D为19个Z切片的最大强度投影，E-H为17个Z切片的最大强度投影。D、H、L中的25 µm标尺分别适用于A-D、E-H和I-L。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：溶液与缓冲液的配制。 以下溶液的配制方法详述如下：1xPBS、1x PBST、封闭液和多聚甲醛固定液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本实验方案详细介绍了黑腹果蝇（Drosophila）蛹背胸片固定组织的制备与观察方法。该方法适用于完整或损伤的组织，且能保持组织原有的结构特征。本文描述了组织解剖、固定和染色的全部操作步骤。

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的蛹在变态期间数天内保持静止不动，在此期间发育出具有薄而透明...的新身体

本方案具有重要意义，因为它允许您对黑腹果蝇蛹的盾片进行免疫组织化学染色，即使这些样本此前已受过损伤并进行过活体成像，也不会破坏组织的结构完整性。该技术使您能够充分利用现有多种多样的抗体染色方法，对盾片上皮中的细胞、结构和蛋白质进行标记。我们已将此技术应用于免疫染色及DNA染色。然而，该解剖步骤也可作为其他技术的起点，例如原位杂交。此方案可能具有一定难度，因为蛹体积较小且结构脆弱，因此需要稳定的手法才能完成解剖操作。随着经验积累，操作会逐渐变得容易，建议在重要样本之前先在非关键的蛹上进行练习。首先，使用解剖显微镜小心地取出三到四个处于 P5 阶段的蛹，并将它们收集在载玻片上靠近胶带的位置。接着，将蛹腹面朝下放置在胶带上，各蛹之间至少间隔一个蛹的宽度。然后，将一滴粘合胶滴加在石蜡膜上或离心管盖内。接下来，将一支10微升至0.1微升移液器吸头的末端浸入一滴黏合胶中，然后将吸头轻触距离盖玻片一角1厘米处（盖玻片尺寸为1厘米×1厘米）两次，形成一条黏合胶线，长度约为蛹体的一半。随后，将P2移液器预设至2微升，P200移液器预设至200微升，并装上吸头。接着，用镊子从头部侧面附近插入，从前往后轻轻尽可能多地去除蛹壳。接着，用一对钝头镊子夹住蛹正在发育的腿部，小心地将蛹从其茧中抽出。将蛹放置在盖玻片的一角。用钝头镊子夹住蛹的腹部后端或正在发育的翅。将蛹的腹面抬起并向下放入粘合胶线中。迅速用含有0.1毫摩尔钙的两微升单倍浓度PBS填充P2移液器，将其悬在空中，轻轻排出液体，使移液器尖端形成一个小气泡。将溶液的小气泡接触蛹胸部基部的一侧，然后在另一侧重复此操作。接下来，用200微升含0.1毫摩尔钙的单倍浓度PBS填充P200移液枪，然后将移液枪吸头置于蛹的胸部上方，排出液体以完全浸没蛹体，此时残留的粘合胶将立即固化。随后，移除约100微升PBS溶液，使蛹体刚好处于轻微浸没状态，然后立即进入下一步操作。为解剖背片，取一把显微解剖剪，将剪刀手柄的一侧抵住惯用手的食指和中指，使拇指施加剪切力。接下来，将剪刀的颈部靠在非优势手的中指上，同时用该手的无名指固定盖玻片。然后，在腹部背侧中部剪开，形成一个直径约0.2至0.5毫米的小孔。为分离背侧组织，从后向前在表皮上进行长约0.5至0.75毫米的小切口，最终这些切口将环绕背侧组织一周。此外，在蛹的另一侧重复进行从后向前的切割。必要时旋转解剖台，以确保能够干净利落地切过头部。通过观察背胸板是否可轻易移动，来判断其是否已分离。 向盖玻片中央加入约 200 微升单倍浓度的 PBS，并通过将移液器吸头从新液滴轻轻拖动至原始解剖液滴，在两者之间形成一个通道。使用一对钝头镊子，轻轻推动或拖动分离的背部体壁组织至盖玻片中央，并旋转使其内侧面朝上。用钝头镊子压住组织的腹部或头部区域，将其固定。使用一对尖头镊子，以及从200微升移液器中轻轻挤出的单倍磷酸盐缓冲液（PBS），清除残留的脂肪体、肌肉带或血淋巴，以充分暴露单层上皮组织。待组织清洁后，用200微升移液器尽可能吸除PBS溶液，同时在解剖显微镜下观察，避免吸走背板（notum）。在尽可能去除液体后，使用吸水纸小心擦去盖玻片上残留的黏合胶、蛹壳残骸及其他碎屑。现在加入 150 至 200 微升 4% PFA，在室温下固定 20 分钟。根据解剖速度，可在第一只蛹于单独盖玻片上固定期间，继续解剖另外一至三只蛹。去除 PFA，更换为单倍浓度 PBS，清洗背片一次，每次 30 秒。若进行抗体染色，请用单倍浓度的 PBS 或 PBST 进行三次五分钟的洗涤，以对细胞内抗原进行组织通透。样品可在含 0.02% 叠氮化钠的单倍浓度 PBS 中于湿盒内过夜保存。染色完成后，准备一个新的盖玻片，称为顶盖玻片，并配有支撑物。在盖片顶部中央位置，使用由 22×22 盖玻片制成的间隔物，在相距约 1 厘米处形成一个约 200 微米的间隙。为固定间隔物，用薄层指甲油涂抹远离中心一侧的接缝处，然后使其干燥。尽可能去除样本中的水溶液，并立即在样本上滴加两滴抗荧光淬灭封片剂。如有必要，使用洁净锋利的镊子将notum置于抗荧光淬灭封片剂液滴的中央。将带有notum的盖玻片放置在约10 × 40 毫米的泡沫支撑物上，以抬高样本，防止其粘附于工作台面。在解剖显微镜下，缓慢将盖玻片压平并覆盖在样本上。当抗荧光淬灭封片剂接触到盖片时，轻轻松开，让毛细作用将盖片自然下拉。在盖片上放置另一块泡沫，并用标准的显微镜载玻片作为重物，轻柔地促使抗荧光淬灭封片剂在样品盖玻片、顶层盖片和间隔片之间均匀分布。5-10 分钟后，用吸水纸轻轻接触盖玻片边缘，吸除多余的抗荧光淬灭封片剂。轻轻将指甲油涂抹在盖玻片的每个角落，以将它们粘合在一起。为防止盖玻片移动而损伤背侧组织，应避免先涂布边缘；待角落的指甲油干燥后，再将盖玻片所有边缘涂满指甲油以密封。本方案适用于对固定样品进行成像，并可结合抗体和细胞染料进行染色。该方案可用于先前已受伤并进行过活体成像的样品。活体图像与固定后图像的比较表明，该方案能够保持组织结构和形态。该方案可实现对解剖后的notum进行不同角度的观察。顶部视角适用于观察角质层下方的上皮细胞边界和细胞核，而底部视角则能更清晰地显示伤口边缘的基底结构。解剖过程中务必避免弯曲或扭曲胸片。切割时应避开侧边，取平坦的部分。不要过于靠近腹侧切割，否则在装片过程中会发生变形。解剖出蛹体背片后，可应用多种其他技术，如电子显微镜观察和横切面制样。这些技术可实现对先前已成像结构的深入细致研究。

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