Name: 建立人肺类器官和近端分化以产生成熟的气道类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解如何从原代人肺组织高效建立人肺类器官，并通过近端分化方案生成熟气道类器官。该培养系统可稳定扩增一年以上，为研究呼吸道生物学和病理学提供接近生理水平的可靠模型。

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感谢香港大学李嘉诚医学院全景科学中心和电子显微镜单元在共聚焦成像和流式细胞术方面提供的协助。本工作部分得到了香港特别行政区政府食物及卫生局健康与医学研究基金（HMRF，17161272 和 19180392）、研究资助局一般研究基金（GRF，17105420）以及创新科技署 Health@InnoHK 项目的资助。

本文所述所有使用人体组织的实验均经香港大学/医院管理局港岛西联网机构审查委员会批准（编号：UW13-364 和 UW21-695）。在采集组织前，已从患者处获得知情同意。
1. 人类肺类器官的衍生
<ol>
	<li>实验材料的准备
	<ol>
		<li>通过在高级DMEM/F12培养基中添加2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，制备基础培养基。</li>
		<li>通过在基础培养基中添加10% R-spondin 1条件培养基、10% Noggin条件培养基、1× B27补充剂、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸、10 mM烟酰胺、5 µM Y-27632、500 nM A-83-01、1 µM SB202190、5 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）-7、20 ng/mL FGF-10和100 µg/mL Primocin，制备人肺类器官扩增培养基（见材料表）。 
		注意：R-spondin 1和Noggin条件培养基可用市售的重组R-spondin 1（500 ng/mL）和Noggin（100 ng/mL）替代。</li>
		<li>将24孔悬浮培养板在细胞培养孵育箱中预热。使用标准细胞培养孵育箱，条件为5% CO2、37 °C、加湿环境。在4 °C冰箱中解冻基底膜基质。实验过程中将基底膜基质和培养基保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从人肺组织中分离细胞用于三维类器官培养
	<ol>
		<li>从因各种疾病接受手术切除的患者中获取新鲜切除的人肺组织，大小约为0.5 cm。将肺组织置于30 mL基础培养基中，室温运输，并尽快在生物安全柜内处理。</li>
		<li>在10 cm细胞培养皿中用无菌手术刀将肺组织切成小块（0.5–1 mm）。在15 mL离心管中用10 mL冷的基础培养基洗涤组织块，随后在4 °C下以400 × g离心5分钟&#160;。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于8 mL含有胶原酶的基础培养基中，终浓度为2 mg/mL。在37 °C下以120 rpm振荡消化组织块30–40分钟。</li>
		<li>使用10 mL移液管反复吹打20次，剪切消化后的组织块。将100 µm细胞筛置于50 mL离心管上，过滤悬液。</li>
		<li>用基础培养基将筛网上残留的组织块回收，并转移至15 mL离心管，进行第二轮剪切和过滤。可根据需要额外进行1–2次剪切-过滤步骤以获得更多细胞，尤其是在获取的组织块较小时（例如，&#60;0.5 cm）。</li>
		<li>向滤过液中加入胎牛血清（FBS），终浓度为2%，以终止消化反应，随后在4 °C下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于10 mL基础培养基中，再在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
		<li>（可选）若在沉淀中观察到大量红细胞（通过沉淀颜色估计），将细胞沉淀重悬于2 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5分钟。然后向管中加入10 mL基础培养基，再在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于冷的基底膜基质中，并保持在冰上。对于从约0.5 cm大小的肺组织中回收的细胞，加入80–160 µL基底膜基质；该体积足以接种2–4个液滴。</li>
		<li>将40 µL悬液分配至预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。将培养板在37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固形成液滴。</li>
		<li>向每孔加入500 µL含5 nM Heregulin beta-1的人肺类器官扩增培养基，并将培养板置于细胞培养孵育箱中孵育。</li>
		<li>每3天更换一次培养基。更换时小心移除旧培养基，保留液滴完整，并轻柔加入新鲜培养基。在孵育10–14天后传代类器官。Heregulin beta-1仅用于首次传代前的初始培养。</li>
		<li>在显微镜下观察类器官，确保类器官未因细胞密度过高而嵌入。若因细胞密度过高导致液滴解体，应回收类器官和细胞，使用更大体积的基底膜基质重新包埋，制备更多细胞密度较低且适宜的液滴。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人类肺类器官的扩增
<ol>
	<li>使用火焰（如本生灯）灼烧巴斯德移液管的尖端，将开口直径从1.5 mm缩小至约1.0 mm，制备成拉细的巴斯德移液管。移液管冷却后进行高压灭菌以实现消毒。使用基础培养基润洗移液管，以避免在机械剪切过程中发生细胞黏附和损失。</li>
	<li>肺类器官通过机械剪切法传代
	<ol>
		<li>使用1 mL枪头反复吹打上述获得的类器官液滴以将其打散。随后将类器官连同培养基转移至15 mL离心管中，并用冷的基础培养基调整总体积至10 mL。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>再次用10 mL冷的基础培养基洗涤类器官。将类器官重悬于2 mL冷的基础培养基中，使用巴斯德移液管反复吹打，使类器官剪切为小片段。</li>
		<li>补加基础培养基至总体积为10 mL，随后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。将类器官片段重悬于足量的冷基底膜基质中，以便实现1:3至1:5的传代比例。保持在冰上操作。</li>
		<li>将40 µL类器官悬液加入预热的24孔板的每一孔中。将培养板置于37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固。</li>
		<li>向每孔加入500 µL肺类器官扩增培养基，并置于细胞培养箱中孵育。每3天更换一次培养基。每2周以1:3至1:5的比例对类器官进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺类器官通过胰酶消化法传代 
	注：当使用巴斯德移液管难以将肺类器官剪切为小片段，或类器官大小差异较大，或后续实验要求类器官尺寸更均一时，建议采用胰酶消化法。
	<ol>
		<li>按照步骤2.2.1的方法收获肺类器官。将类器官重悬于1 mL解离酶溶液中，在37 °C水浴中孵育3–5分钟。</li>
		<li>向管中加入1 mL基础培养基。使用巴斯德移液管反复吹打，将类器官机械剪切为小片段。在4倍物镜下显微镜观察类器官片段的大小。然后加入40 µL胎牛血清（FBS）以终止消化反应。 
		注：应根据实验设计在显微镜下评估类器官片段的大小。若实验需要更多类器官或尺寸更均一的类器官，可将类器官剪切为更小的片段甚至单细胞。此时类器官需要更长时间（可能约3周）才能达到可用于实验的状态。</li>
		<li>补加基础培养基至终体积为10 mL，随后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。将类器官片段重悬于足量的冷基底膜基质中，以实现1:5–1:10的传代比例。保持在冰上操作。</li>
		<li>将40 µL类器官悬液加入预热的24孔板的每一孔中。将培养板置于37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固。</li>
		<li>每孔补充500 µL肺类器官扩增培养基，并置于细胞培养箱中孵育。每3天更换一次扩增培养基。在2–3周后对类器官进行传代。 
		&#8203;注：约100个类器官被包埋于40 µL基底膜基质液滴中。肺类器官通常在相对较高的细胞密度下生长更佳。若液滴发生解体，或因细胞密度过高导致生长中的类器官相互黏连，应以较低细胞密度重新包埋类器官。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 近端分化以生成成熟的气道类器官
<ol>
	<li>通过在气液界面基础培养基中添加1倍体积的气液界面添加剂、1倍体积的气液界面维持添加剂、4 µg/mL 肝素、1 µM 氢化可的松、10 µM Y-27632 和 10 µM DAPT，制备近端分化培养基（PD培养基）（参见 材料表).</li>
	<li>三维气道类器官
	<ol>
		<li>传代后，将肺类器官在扩增培养基中培养 7–10 天 通过 机械剪切。将扩增培养基更换为PD培养基。将类器官置于细胞培养箱中，在PD培养基中培养14天。</li>
		<li>弃去每孔中的 PD 培养基。加入细胞裂解液，收集已分化的气道类器官，用于 RNA 提取及通过 RT-qPCR 检测细胞基因表达。</li>
		<li>或者，在添加10 mM EDTA后，将类器官在37 °C孵育60分钟，以将其解离为单细胞，随后进行流式细胞术分析以检测细胞群体。类器官此时可用于各种实验操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维气道类器官
	<ol>
		<li>准备足够的3D肺类器官用于2D分化培养。共计1.3 × 105 和 4.5 x 105 分别需要用于24孔和12孔可渗透支持插入式培养板的细胞。</li>
		<li>在3D肺类器官于扩增培养基中培养2周后，将类器官消化为单细胞，并接种至24孔和12孔培养插件中，以生成2D气道类器官。</li>
		<li>将小室插入物在细胞培养箱中用基础培养基预孵育过夜。在24孔板的上室和下室中分别加入250 µL和500 µL基础培养基。对于12孔板，在上室和下室中分别加入500 µL和1,000 µL基础培养基。</li>
		<li>按照步骤 2.2.1 所述收获 3D 肺类器官。用 1 mL 解离酶重悬类器官，并在 37 °C 水浴中孵育 3–5 分钟。</li>
		<li>向离心管中加入1 mL基础培养基，使用巴斯德吸管反复吹打，将类器官剪切为单细胞，并在显微镜下观察细胞状态。随后，加入40 µL胎牛血清（FBS）以终止消化。</li>
		<li>通过40 µm细胞筛将细胞过滤至50 mL离心管中。将过滤后的细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入基础培养基至总体积10 mL，随后在300 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>将来自24滴（每滴40 µL）的沉淀物重悬于1–2.5 mL肺类器官扩增培养基中，具体体积根据液滴中的细胞密度确定。在显微镜下使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。将细胞浓度调整至1.3 × 10⁵ cells/mL6/mL（适用于24孔小室）或9 × 105/mL（适用于12孔插件）。</li>
		<li>移去上室和下室的基底培养基。在24孔插入式培养板和12孔插入式培养板的下室中，分别加入500 µL和1,000 µL扩增培养基。将步骤3.3.7中制备的细胞悬液分别取100 µL和500 µL接种至24孔插入式培养板和12孔插入式培养板的上室中。</li>
		<li>在细胞培养箱中孵育2天。将培养板的顶室和底室中的扩增培养基更换为PD培养基。将类器官在细胞培养箱中继续孵育14天，每3天更换一次PD培养基。 
		注意：在PD培养基中培养7天后，可在显微镜下观察到三维和二维类器官中的运动纤毛。在PD培养基中分化培养14天后，气道类器官已成熟，可用于多种实验操作。</li>
		<li>每隔一天使用电阻测量系统，按照文献中描述的标准方案测量跨上皮电阻（TEER）。17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z.、C.L. 和 M.C.C. 被列为气道类器官专利（公开号：US-2021-0207081-A1）的发明人。其他作者声明无竞争利益。

人体气道内壁覆盖着气道上皮，也称为假复层纤毛上皮。上呼吸道上皮的主要细胞类型包括纤毛细胞，其顶端纤毛可协调运动，推动黏液和吸入的颗粒物排出气道；杯状细胞，负责产生和分泌黏液；以及基底细胞，位于基底膜上，参与组织再生。在细支气管等小气道中，立方状气道上皮含有分泌型club细胞，且纤毛细胞数量较上呼吸道区域更少。本文描述了一种从人肺组织中的上皮干细胞高效建立人肺类器官的实验方案。这些人肺类器官可在扩增培养基中长期维持，并连续传代超过一年，保持高度稳定性。扩增培养基中的关键生长因子包括R-spondin（一种Wnt激动剂20）和Noggin（BMP信号通路的抑制剂21），以及FGF7和FGF10。既往研究表明，Wnt、FGF和BMP信号通路在呼吸上皮稳态中发挥关键作用22,23,24。扩增培养基通过引导类器官维持未成熟状态，实现其初始建立和长期扩增。我们进一步开发...

类器官已成为一种强大且通用的工具 体外 器官发育建模及生物学与疾病研究。在含有特定生长因子的培养基中培养时，来自多种器官的成体干细胞（ASC）可在三维（3D）条件下扩增，并自组装形成由多种细胞类型组成的类器官样细胞簇，称为类器官。Clevers 实验室于 2009 年首次报道了由成体干细胞衍生的人肠道类器官。1,2随后，已成功建立多种人类器官和组织的ASC来源类器官，包括前列腺3,4肝脏5,6，胃7,8,9，胰腺10乳腺11和肺 12,13这些由ASC衍生的类器官保留了天然器官的关键细胞、结构和功能特性，并在长期扩增培养中维持了遗传和表型的稳定性14,15.
类器官也可以来源于多能干细胞（PSC），包括胚胎干细胞（ES细胞）和诱导性多能干细胞（iPS细胞）16。虽然PSC来源的类器官利用器官发育机制进行构建，但成体干细胞（ASCs）则可通过重建模拟生理组织自我更新或组织修复过程中干细胞微环境的条件而被诱导形成类器官。PSC来源的类器官是研究发育和器官发生过程的理想模型，但其成熟程度不及ASC来源的类器官。PSC来源类器官具有类似胎儿的成熟状态，且构建过程复杂，这些因素显著限制了其在成熟组织生物学与病理学研究中的广泛应用。
从鼻腔到终末细支气管，人类呼吸道内壁覆盖着气道上皮，也称为假复层纤毛上皮，由四种主要细胞类型组成，即纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞和club细胞。我们与Clevers实验室合作，利用人肺组织建立了由气道干细胞（ASC）衍生的人肺类器官12,13。这些肺类器官可在扩增培养基中连续扩增超过一年；具体扩增时长因来自不同供体的类器官品系而异。然而，与天然气道上皮相比，这些可长期扩增的肺类器官尚未完全成熟，因为人类气道中占主导地位的纤毛细胞在这些类器官中所占比例偏低。因此，我们开发了一种近端分化方案，生成了在形态和功能上均接近生理状态的气道上皮的三维（3D）和二维（2D）气道类器官。
本文提供了一种从原代肺组织中衍生人类肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化以生成三维和二维气道类器官的视频实验方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;肺类器官培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>-</td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex 低生长因子基底膜基质，2 型（BME 2）</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX（谷氨酰胺）</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &amp;beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin（条件培养基）</td><td>自制</td><td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1（条件培养基）</td><td>自制</td><td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;近端分化培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>氢化可的松储备液</td><td>StemCell Technology</td><td>7925</td><td>1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X 补充剂</td><td></td><td></td><td>气液界面补充剂</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 基础培养基</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>气液界面基础培养基</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 维持补充剂</td><td></td><td></td><td>气液界面维持补充剂</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 或 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN black 或 ZEN blue 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 和 50 mL 锥形管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>医用注射器滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德玻璃移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5 mL、10 mL、25 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗细胞角蛋白 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗黏蛋白 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;beta;-微管蛋白 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗泌素/CC-10</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（10X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>解离酶</td></tr></tbody></table>

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

缺乏一种可靠的 体外 人呼吸道上皮模型的缺乏制约了对呼吸系统生物学与病理学的理解。本文描述了一种明确的实验方案，旨在从成人肺组织中的成体干细胞诱导生成人肺类器官，并进一步诱导其向近端气道分化，从而获得成熟的气道类器官。这些肺类器官可连续扩增超过一年，具有高度稳定性；而分化后的气道类器官则可在形态和功能上接近生理水平地模拟人类气道上皮。因此，我们建立了一个稳健的人气道上皮类器官模型。肺类器官及其分化后气道类器官的长期扩增提供了稳定且可再生的细胞来源，使科研人员能够在培养皿中重建并扩增人呼吸道上皮细胞。该人肺类器官系统提供了一个独特且具备生理活性的平台 体外 用于多种应用的模型，包括病毒-宿主相互作用研究、药物测试和疾病建模。

本方案能够以较高的成功率获得人肺类器官。新鲜的人肺组织被切成小块后，用胶原酶进行消化。所得的单个细胞被包埋于基底膜基质中，并在含有多种微环境因子的肺类器官扩增培养基中孵育，以促进上皮干细胞的生长（步骤 1.1.2）。图1展示了将新鲜分离的肺细胞包埋于生长因子减少的2型基底膜基质（BME；图1A，左）后的显微照片。囊状类器官随时间逐渐出现并增大（图1A，右）。与此同时，无关的细胞逐渐发生细胞死亡。在前一至二代培养过程中可见成纤维细胞的存在。此后，培养物中仅含有来源于原始肺组织中上皮干细胞的上皮类器官，即肺类器官。这些肺类器官每2-3周通过机械剪切以1:3至1:5的比例传代，或通过胰酶消化以1:5至1:10的比例传代（步骤 2.2–2.3）。第四代肺类器官的代表性显微照片如图1B所示。机械剪切后，包埋于BME中的类器官碎片在数小时内形成囊状结构（图1B</stro...

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。

缺乏稳定的人类呼吸道上皮体外模型，阻碍了对呼吸系统生物学与病理学的理解。

我们正在介绍一种在培养板中建立人呼吸道上皮类器官培养的方法。我们直接从原代肺组织高效地获得人肺类器官。所获得的人肺类器官可稳定扩增超过一年，通过近端分化方案可生成成熟的气道类器官，能够近乎生理水平地真实模拟人呼吸道上皮。因此，该培养系统可使科学家在培养板中重建并扩增人呼吸道上皮。本实验操作将由本实验室的博士研究生Man Chun Chiu和Yifei Yu进行演示。开始进行三维类器官培养的人肺组织细胞分离时，先用无菌手术刀将肺组织切成约1毫米大小的组织块，并用10毫升冷的基础培养基清洗组织碎片。在4°C条件下以400 × g离心5分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于8毫升添加了胶原酶的基础培养基中，胶原酶的终浓度为2毫克/毫升。然后，在37摄氏度下以120转/分钟的速度振荡试管30至40分钟，以消化组织块。消化完成后，使用10毫升血清移液管上下吹打20次，剪切已消化的组织块。随后，用100微米细胞筛过滤悬液至50毫升离心管中。用基础培养基将组织块从滤网中回收并转移至15毫升离心管中。为终止消化，在滤出液中加入胎牛血清，使其终浓度为2%。随后，离心该离心管，并如前所述将细胞沉淀重悬于10毫升基础培养基中。离心后，将沉淀物重悬于80至160微升冷的基底膜基质培养基中，并将离心管置于冰上。接下来，将40 µL悬浮液加入预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。在37°C下孵育10至15分钟，使基底膜基质凝固并形成液滴。孵育后，向每孔加入500微升添加了5纳摩尔heregulin-beta 1的人肺类器官扩增培养基，并将培养板置于细胞培养箱中孵育。三天后，更换旧培养基，注意保持液滴完整，然后小心加入新鲜培养基。传代培养10至14天后，在显微镜下观察类器官，确保类器官未因细胞密度过高而发生包埋。使用剪切法传代肺类器官时，用1毫升枪头反复吹打将类器官液滴打碎。随后将类器官连同培养基转移至15毫升离心管中，并用冷的基础培养基调整体积至10毫升。在4°C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液，并用10毫升冷的基础培养基洗涤类器官。然后，将类器官重悬于2毫升冷的基础培养基中，并使用巴斯德移液管剪切为小片段。接着，加入基础培养基至总体积为10毫升，离心后将类器官碎片重悬于足量的冷基底膜基质中，以实现1:3至1:5的传代扩增，并将试管置于冰上。将40微升类器官悬液分配至预热的24孔板的每孔中，在37摄氏度下孵育，使基底膜基质固化10至15分钟。随后，向每个孔中加入 500 µL 肺类器官扩增培养基，置于细胞培养孵箱中孵育。每三天更换一次培养基，每两周传代一次类器官。如需通过胰酶消化法传代肺类器官，将收获的肺类器官重悬于 1 mL 解离酶中。将类器官置于37摄氏度水浴中孵育3至5分钟。随后，向离心管中加入1毫升基础培养基，通过上下吹打机械剪切类器官。在使用40微升胎牛血清终止消化前，于100倍显微镜下观察类器官碎片的大小。用基础培养基将体积补足至10毫升，然后离心，再用足量的冷基底膜基质重悬类器官组织块，使其能够以1:5至1:10的传代比例进行传代。随后，将40微升类器官悬液分配至24孔板的每个孔中，并按照之前所示的方法进行培养。为生成三维气道类器官，在机械剪切传代后，将肺类器官在扩增培养基中培养7至10天。然后，将扩增培养基更换为近端分化培养基，并将类器官置于细胞培养箱中孵育。14天后，弃去每孔中的培养基，加入细胞裂解液缓冲液，以收获已分化的气道类器官，用于RNA提取及通过RT-qPCR检测细胞基因表达。将插入式培养小室预先在细胞培养箱中孵育，分别在24孔板的上室和下室中加入250和500微升基础培养基。然后，向离心管中加入1毫升基础培养基，上下吹打使类器官分散为单个细胞。在加入40微升胎牛血清终止消化之前，先在显微镜下观察细胞状态。将细胞悬液通过40微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，随后将过滤后的细胞悬液转移至15毫升离心管中。用基础培养基将悬浮液补足至总体积10毫升。离心后，根据细胞密度，用1至2.5毫升肺类器官扩增培养基重悬从24滴中收集的细胞沉淀。在显微镜下使用细胞计数器计数细胞数量，然后将细胞浓度调整为每毫升1.3×10⁶，用于24孔插件培养。在底部小室中加入 500 微升扩增培养基之前，移除顶部和底部小室中的基础培养基。将先前制备的 100 微升细胞悬液接种至 24 孔插入式培养板的顶室中，并进行培养。两天后，将扩增培养基更换为近端分化培养基，分别加入培养板的顶室和底室中。将类器官培养14天，每3天更换一次培养基。使用电阻测量系统每天检测跨上皮细胞电阻。在代表性显微照片中，可见新分离的肺细胞嵌入于生长因子减少的基底膜基质2型中。囊状类器官随时间推移逐渐形成并生长。此处展示的是经过第四代传代后的肺类器官。在机械剪切后两小时内，嵌入基底膜提取物中的类器官片段形成了囊状结构域。第5天同一视野的显微照片证实了类器官随时间推移的生长情况。扩增的类器官包含四种主要的气道上皮细胞类型，包括ACCTUB阳性或FOXJ1阳性的纤毛细胞、P63阳性的基底细胞、CC10阳性的克拉拉细胞以及处于未成熟状态的MUC5AC阳性杯状细胞。在扩增培养基和近端分化培养基中培养的类器官随时间推移呈现出不同的形态特征。在近端分化培养基中分化两周后，每个类器官中均可观察到运动纤毛。观察发现，同步摆动的纤毛将类器官腔内的细胞碎片驱动并单向旋转，以清除吸入的颗粒物。此外，流式细胞术分析表明，在近端分化和扩增培养基中，分化的类器官包含了四种气道上皮细胞类型。经过两周的分化，二维气道类器官形成了完整的上皮屏障。通过葡聚糖阻断实验评估二维气道类器官中形成的上皮屏障的完整性。二维类器官中含有丰富的纤毛细胞。长期可扩增的肺类器官和分化的气道类器官为研究呼吸系统生物学和病理学（包括新型冠状病毒感染）提供了一个具有生理活性且通用的模型系统。

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

建立人肺类器官和近端分化以产生成熟的气道类器官

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。...

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

本文提供了一种详细的组织解离和细胞分馏方法，可用于富集来自人肺近端和远端区域的活体上皮细胞。本文中，这些方法被应用于通过三维类器官培养模型对肺上皮祖细胞进行功能分析。...

人肺上皮前体细胞的分离与富集用于类器官培养

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。...

利用诱导多能干细胞构建三维全肺类器官以模拟肺发育生物学及疾病

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。...

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

膜成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）是一种培养成熟人脂肪细胞的新方法。本文详细介绍了如何从人脂肪组织中分离脂肪细胞，以及如何建立MAAC培养体系。...

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（MAAC）分离与培养人成熟脂肪细胞

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

了解如何从原代人肺组织高效建立人肺类器官，并通过近端分化方案生成熟气道类器官。该培养系统可稳定扩增一年以上，为研究呼吸道生物学和病理学提供接近生理水平的可靠模型。

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

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