Name: 针对咖啡浆果螟子下皮测试控制剂和杀虫剂 的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解利用绿色咖啡果实评估杀虫剂对咖啡浆果螟毒性的方法。该方案通过模拟自然条件，测定昆虫死亡率、驱避性及繁殖能力，为农业昆虫学和农药毒理学研究提供可靠的实验基础。

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作者感谢哥伦比亚咖啡种植者国家联合会、昆虫学系助理（Diana Marcela Giraldo、Gloria Patricia Naranjo）、Naranjal实验站以及Jhon Félix Trejos。

注意：本方案介绍了在实验室条件下识别对CBB产生不同影响的多种方法。
1. 果实采集
<ol>
	<li>清晨时分，在咖啡种植园中选择开花后发育年龄约为120至150天的绿果。</li>
</ol>
2. 果实消毒20
<ol>
	<li>将约300个火龙果（GFs）带入实验室。选择大小均匀且健康的火龙果，并切除果柄。</li>
	<li>将火龙果浸入肥皂溶液（2 mL 液体洗洁精溶于998 mL 自来水中），随后轻轻揉搓清洗。然后用清水冲洗果实，每次更换清水，共冲洗三次。</li>
	<li>将火龙果浸入0.5%次氯酸钠溶液（100 mL 次氯酸钠加入900 mL 自来水中），在摇床中以110 rpm振荡处理15分钟。随后在摇床中用清水振荡冲洗火龙果，每10分钟更换一次水，共更换三次。</li>
	<li>用无菌纸巾将火龙果表面擦干。</li>
	<li>将火龙果放置于托盘（33 cm × 25 cm × 2 cm）中，在具备紫外功能的水平层流洁净台内，使果实与紫外光源保持55 cm距离，照射15分钟。</li>
	<li>在照射期间，每隔5分钟翻动一次火龙果，以确保整个果实表面均得到充分照射。</li>
</ol>
3. 昆虫消毒21
<ol>
	<li>使用新羽化的（同日）CBB昆虫进行生物测定实验。</li>
	<li>将CBB浸入0.5%次氯酸钠溶液中，用刷子缓慢搅动10分钟。</li>
	<li>用棉布过滤CBB，并用无菌蒸馏水清洗三次。</li>
	<li>用无菌纸巾吸去多余水分。</li>
</ol>
4. 对具有果实保护作用的产品进行评价（接种前处理）(图1)
<ol>
	<li>每个实验单元使用一组咖啡果小蠹（GFs）。通常，每个实验单元使用30只GFs。</li>
	<li>将GFs放入塑料盒中（实验单元）。</li>
	<li>施用不同浓度的待测产品进行评估。使用便携式喷雾装置进行施药。本实验中测试了5%和6%浓度的生物碱乳剂。</li>
	<li>对照组使用清水喷洒一组GFs。</li>
	<li>每种处理至少设置三个重复（实验单元），依次进行喷雾处理。</li>
	<li>在无菌操作台内，向每只GFs释放两只CBB成虫（共向塑料盒中引入60只CBB）。30分钟后，盖上盒盖。</li>
	<li>将带有感染GFs的塑料盒置于环境可控的房间或培养箱中（黑暗条件，25 ± 2 °C，相对湿度71% ± 5%）。</li>
	<li>在接种后第1、7、15和21天，统计每个盒子中被蛀果实的数量以及果实外部存活和死亡的昆虫数量。</li>
	<li>接种后第20天，在体视显微镜下解剖每颗GF，放大倍数为10倍。</li>
	<li>统计每颗果实中健康种子以及被昆虫破坏的种子数量。</li>
	<li>记录观察到的CBB不同生物学阶段22，并统计每粒种子中死亡昆虫的数量，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。</li>
</ol>
5. 产品在CBB侵害后（侵害后）效果的评估 (图3)
<ol>
	<li>每种处理使用200个果实作为一组。</li>
	<li>在无菌操作台中，将咖啡果小蠹成虫（咖啡果小蠹成虫与绿果的比例为2:1）释放到预先消毒的绿果中，在21 °C条件下让其侵染3小时。</li>
	<li>检查绿果；3小时后，大多数绿果应已被侵染，咖啡果小蠹的腹部仍外露（位置A20），如图2所示。</li>
	<li>选取46个已被侵染的绿果（处于位置A），放入96孔塑料架中（作为实验单位）。果实应保持该位置，以便将处理药剂直接喷洒到正在钻入果实的咖啡果小蠹上。</li>
	<li>每种处理至少重复三次（三个架子），依次进行喷洒，并在30分钟后覆盖架子。</li>
	<li>将带有被侵染绿果的架子置于环境可控的房间或培养箱中（黑暗条件，25 ± 2 °C，相对湿度71% ± 5%）。</li>
	<li>20天后，在体视显微镜下以10倍放大倍数解剖绿果。</li>
	<li>统计每个果实中健康种子的数量或被昆虫破坏的种子数量。</li>
	<li>统计每个种子中咖啡果小蠹的不同生物学阶段22以及死亡昆虫数量，以确定每个实验单位的昆虫死亡率。</li>
</ol>
6. 对具有抑制CBB作用的产品进行评估
<ol>
	<li>按照第4.1-4.6步操作，评估对果实具有保护作用的产品。</li>
	<li>将咖啡果小蠹成虫释放到塑料盒中后，统计从盒子中飞走的咖啡果小蠹数量以及侵染绿色果实（GF）的数量，然后执行第4.7-4.11步。</li>
	<li>按照第5.1-5.5步操作，评估产品在咖啡果小蠹侵染后的效果。</li>
	<li>对位于A位置的昆虫喷施每种处理后，统计从绿色果实（GF）中移出和/或从绿色果实（GF）飞走的咖啡果小蠹数量，然后执行第5.6-5.9步。</li>
</ol>
7. 统计学分析
注意：响应变量为随时间变化的死亡率百分比以及健康且未受侵染的咖啡种子百分比。
<ol>
	<li>计算每个处理组各响应变量的平均值和标准差。</li>
	<li>对每个响应变量进行方差分析，采用完全随机设计的模型。 
	注意：采用邓nett 5%比较检验法，将各处理组与绝对对照组（水对照）进行比较。</li>
	<li>当处理组与绝对对照组之间差异显著时，采用5%水平的最小显著差异（LSD）检验对处理组进行相互比较。</li>
	<li>评估检验的检验效能；若检验效能大于85%，则说明满足正态性和方差齐性的假设条件。</li>
</ol>
<img alt="杀虫剂喷洒、咖啡果小蠹侵染、25°C培养、果实解剖、种群数量统计示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63694/63694fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）侵染前作用评价流程图。利用绿色果实（GFs）评估杀虫剂对Hypothenemus hampei（咖啡果小蠹，CBB）侵染前影响的操作步骤。（A）果实筛选。（B）在咖啡果实上喷洒杀虫剂。（C）以每2只CBB侵染1个绿色果实的比例进行咖啡果小蠹侵染。（D）已侵染的果实。（E）在受控条件下培养果实。（F）果实解剖。（G）统计种子内部的CBB种群数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63694/63694fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于电位分析的绿色实验装置，聚合物支架上排列着多行小橄榄。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63694/63694fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：咖啡果的咖啡果小蠹（CBB）侵染过程。 被侵染的果实中含有咖啡果小蠹成虫，其腹部部分外露（位置 A）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63694/63694fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="咖啡果小蠹侵染过程示意图，展示从果实选择到CBB种群数量统计的全过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63694/63694fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：评估杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）侵染后效果的操作流程。 使用咖啡果（GF）评估杀虫剂对CBB侵染后效果的步骤。（A）果实选择。（B）以每粒咖啡果2:1的比例接种CBB进行侵染。（C）选择已被侵染的果实。（D）对果实喷施杀虫剂。（E）果实培养。（F）果实解剖。（G）统计CBB种群数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63694/63694fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

所有作者均无任何利益冲突需要声明。

在本实验方案中，果实和昆虫的消毒是关键步骤。当从田间采集的果实用于实验室时，由于表皮存在微生物和螨类，果实常常表现出严重的污染和脱水现象7,15,16。因此，若使用未经消毒的果实或昆虫，会因细菌或真菌等微生物污染导致昆虫死亡，从而干扰生物测定结果。此前，Tapias 等人20曾评估过其他用于果实消毒的抗菌剂，如多菌灵和苯扎氯铵；然而，尽管这些化合物对果实的消毒效果良好，但对咖啡果小蠹（CBB）或环境具有高度毒性。
通过将果实分别浸入0.5%次氯酸钠溶液中30分钟和15分钟，评估了该溶液的使用效果。在两种处理时间下，微生物均受到抑制，但由于该溶液具有较强的氧化性，浸渍30分钟后，CBB也受到不利影响23。紫外线可破坏微生物的DNA24，从而减少污染。然而，在...

咖啡果小蠹（CBB），Hypothenemus hampei，于1988年首次在哥伦比亚被发现，现已成为咖啡作物最重要的害虫种类。雌性CBB在已受精的状态下离开其出生的果实，依靠果实释放的挥发性化学物质寻找新的果实1,2。在25 °C温度条件下，其完整生活周期为23天3。该周期始于“奠基雌虫”钻入种子并在果实质体中产卵。孵化出的幼虫以种子为食。若在此阶段解剖果实，可同时观察到奠基雌虫及其后代。14&#160;天后，幼虫化蛹，通常蛹期持续5天。成虫阶段，雌虫与兄弟交配，新受精的雌虫随后飞离受害果实，寻找新的咖啡果实以开启下一个生活周期4。
幼虫的侵入过程及其取食活动均会损害咖啡种子，降低咖啡饮品的品质，并显著减少经济收益；咖啡种植园中虫害发生率超过5%通常被视为经济阈值。
玉米根叶甲（CBB）的防治基于综合害虫管理（IPM）策略，包括农业生态控制和农艺措施、天然生物防治因子，以及在安全条件下及时使用化学杀虫剂4。
为了评估新型杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）的防治效果，需要采用低成本的方法以快速获得结果。目前使用的实验室和田间方法包括：含有咖啡的人工饲料，其中掺入杀虫剂5,6,&#160;，或在干燥的咖啡羊皮层上喷洒杀虫剂7,8,9。此外，已有研究报道在田间利用包裹昆虫学套袋的咖啡树枝条开展实验10,11；然而，这些方法需要大量人力投入且评估周期较长。
一种类似于自然田间条件且快速、低成本的方法是使用绿色或成熟的咖啡果实。然而，这些果实必须在适合咖啡果小蠹（CBB）发育的条件下保存，同时避免微生物引起的改变和污染，以维持其品质和特性。为此，已采用多种消毒剂以及涉及热处理和辐射的处理方法7,9,12,13,14,15,16。
此外，针对咖啡果小蠹（CBB）的杀虫剂评估方法需要模拟成年雌虫寻找果实或侵入果实的过程17,18。为此，已在田间开展人工果实侵染实验8,11,19，但该过程劳动强度大，且受环境条件影响。
本文介绍了一种标准化方法，用于在模拟田间条件的受控环境条件下，评估对中枢神经系统（CBB）具有不同影响的产品。

<table><tbody><tr><td>500 mL 低型带嘴烧杯</td><td>BRAND PP</td><td>BR87826</td><td></td></tr><tr><td>台式摇床</td><td>New Brunswick Scientific Innova 4000 恒温振荡培养箱</td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗洁精-AXION</td><td>Colgate-Palmolive</td><td>AXION</td><td></td></tr><tr><td>罩；水平层流工作台</td><td>Terra Universal</td><td></td><td>&amp;nbsp;粉末涂层钢，1930 mm 宽 × 1118 mm 深 × 1619 mm 高，120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)</td></tr><tr><td>昆虫 咖啡果小蠹</td><td>BIOCAFE</td><td></td><td>（http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html）</td></tr><tr><td>多折白色纸巾</td><td>科</td><td>73551</td><td></td></tr><tr><td>Preval 喷雾装置</td><td>&amp;nbsp;普雷瓦尔·默克</td><td>Z365556-1KT</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ&lt;br/&gt; 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt&lt;br/&gt; AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk&lt;br/&gt; WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB</td></tr><tr><td>可逆式96孔架</td><td>heathrowscientific</td><td>HEA2345A</td><td>https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a</td></tr><tr><td>11号手术刀片</td><td>默克</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>N3 型手术刀柄</td><td>默克</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>科洛克斯公司</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>蔡司</td><td>Stemi 508</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html</td></tr></tbody></table>

防治咖啡果小蠹 hypothenemus hampei 的控制药剂与杀虫剂测试方法

Methodology to Test Control Agents and Insecticides Against the Coffee Berry Borer Hypothenemus hampei

在推荐使用杀虫剂防治咖啡果小蠹（CBB）Hypothenemus hampei之前，了解这些杀虫剂对成虫的致死作用和驱避效应，或其对繁殖能力的影响具有重要意义。然而，目前可用的方法仅评估成虫死亡率，这限制了具有不同作用机制的新型杀虫剂的筛选。本研究通过考察多种实验方法，旨在鉴定在实验室条件下对CBB产生的多种影响。为此，采集青咖啡果实（GFs），通过浸泡于次氯酸钠溶液并辅以紫外光照射进行消毒。同时，来自种群的CBB成虫也通过浸泡于次氯酸钠溶液进行消毒。为评估果实保护效果（预防侵染），将果实置于塑料盒中，并施用杀虫剂，随后以每颗青咖啡果实释放2只CBB成虫的比例放入成虫。将青咖啡果实置于受控环境下培养，并在1、7、15和21天后评估CBB的侵染情况和存活率。为评估CBB侵染后果实上杀虫剂的防治效果（后侵染处理），将CBB成虫以2:1的比例释放至青咖啡果实中，在21 °C下持续3小时。选择侵染后CBB成虫腹部部分外露的果实，将其置于96孔板架中，并对正在钻入果实的CBB个体进行直接处理。20天后解剖果实，记录每颗果实内CBB各生物学阶段的情况。青咖啡果实作为基质，可模拟自然条件，用于评估对CBB具有毒性、化学性和生物性的杀虫剂效果。

结果表明，咖啡果小蠹雌虫能够识别果实，并根据果实表面的特征及释放的气味，在21 °C条件下于3小时内开始侵入或钻入果实。
在咖啡果实上施用杀虫剂（感染前处理）后24小时及随时间变化对咖啡果小蠹（CBB）的影响如图4所示。两种杀虫剂（5%和6%的生物碱乳剂）在第20天导致了较高的昆虫死亡率（表1），根据LSD检验，与清水绝对对照组相比具有显著差异（P &lt; 0.001）。关于未受侵染的健康种子百分比（表1），根据Dunnett检验（5%水平），对照组与杀虫剂处理组之间也存在显著差异（P &lt; 0.001）。在对照组中，37%的种子未被侵染，而施用杀虫剂可保护种子，使用杀虫剂2时有94%的种子保持健康，使用杀虫剂1时则为89%。
<img alt="21天内昆虫死亡率柱状图；处理组：对照组、杀虫剂1、杀虫剂2。"...

建立了一种利用绿色咖啡果实（GFs）检测杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）毒性的方法。在CBB侵染前或侵染后，将杀虫剂或有毒物质施用于已消毒的GFs上。评估了昆虫死亡率、驱避性、繁殖能力以及其他相关参数。

防治咖啡果小蠹 Hypothenemus hampei 的控制药剂与杀虫剂测试方法

在推荐使用杀虫剂防治咖啡果小蠹（CBB）Hypothenemus hampei 之前，了解这些杀虫剂的致死率和驱避性具有重要意义。

该方法利用绿色咖啡果实检测杀虫剂对咖啡果小蠹的毒性。可在昆虫侵染之前或之后施用杀虫剂，以研究昆虫的致死率、驱避性及其他效应。使用含有适合昆虫生长所需营养的真实绿色咖啡果实，是在模拟自然条件下评估化合物对昆虫毒性的最合适方法。该方案可用于评估化学杀虫剂以及抗真菌或驱避物质等病原体的毒性作用。果实和昆虫的感染是关键步骤，因为不当的消毒可能导致昆虫因污染而死亡。昆虫的质量也至关重要，因为体质较弱的昆虫会高估有毒物质的实验结果。通过直观演示，可以确定昆虫侵染过程中果实的合适阶段，以及施用毒物的适当时机，同时展示解剖果实的方法。本次操作演示由实验室研究助理 Claudia Martinez 进行。首先，在清晨从咖啡种植园采集开花后约120至150天发育期的绿色咖啡果实。选取约300个大小均匀且健康的果实，并去除果柄。将绿色咖啡果实浸入2%的肥皂溶液中，通过揉搓彻底清洗。然后用清水将果实冲洗三次。将其浸入0.5%次氯酸钠溶液中，在110转/分钟的摇床上振荡10分钟。用清水再次冲洗果实三次，并用无菌纸巾擦干。将果实置于配备紫外光源的水平层流工作台内，距离紫外光源55厘米处照射15分钟。每照射5分钟后移动果实一次，以确保整个果实得到充分照射。为建立生物测定实验，将同日羽化的咖啡果小蠹浸入0.5%次氯酸钠溶液中，用刷子缓慢搅动10分钟。用纱布过滤这些昆虫，并用无菌蒸馏水清洗三次。用无菌纸巾去除多余的水分。每个实验单位准备一组30个绿色咖啡果实，放入塑料盒中。使用便携式喷雾装置施加不同浓度的待测产品进行评估，此处使用5%和6%的生物碱乳剂。作为对照，用清水喷洒一组未烘焙咖啡果实。每种处理至少设置三个实验单元，并依次进行喷雾。在无菌操作台中，每个绿色咖啡果实放入两只咖啡果小蠹成虫，30分钟后盖上盒子。将装有被侵染绿色咖啡果实的塑料盒置于室内或培养箱的黑暗环境中，并保持可控条件。在处理后的第1、7、15和21天，统计每个盒子中被蛀蚀的果实数量以及果实外部的活虫和死虫数量。在接种后第20天，在10倍放大倍数的体视显微镜下解剖每个绿色咖啡果实，统计每个果实中健康种子或受昆虫损害的种子数量。记录咖啡果小蠹的不同生物学发育阶段。观察每粒种子中死亡昆虫的数量，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。在无菌操作台中，按照2:1的比例将咖啡果小蠹成虫释放到先前已消毒的青咖啡果实中，并在21摄氏度下让侵染过程持续进行3小时。3小时后，大多数青咖啡果实应已被侵染，且咖啡果小蠹的腹部仍暴露在外。选取46个已侵染的果实，将其放入一个96孔塑料架中，以便将处理试剂直接喷洒到穿入果实的咖啡果小蠹上。依次对三个架子进行处理，每个架子至少喷洒三次，喷洒30分钟后盖上架子。20天后，在体视显微镜下以10倍放大倍数解剖绿色咖啡果实，统计每颗果实中健康种子或受昆虫损害的种子数量。统计每粒种子中不同咖啡果小蠹生物学发育阶段的个体数以及死亡昆虫数量，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。按照评估具有果实保护效果产品的初始步骤操作，将成虫咖啡果小蠹释放到塑料盒中。然后统计从盒子中飞走的咖啡果小蠹数量以及侵染绿色咖啡果实的个体数量。在受控条件下培养后，于侵染后20天进行解剖，统计种子数量和死亡昆虫数量，随后按照咖啡果小蠹侵染后评估产品的步骤进行操作。统计从青咖啡果实中爬出或从果实上飞走的咖啡果小蠹数量。每次施用处理后，按照在受控条件下培养的步骤进行，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。施用5%和6%的杀虫剂对咖啡果小蠹导致第20天出现较高的昆虫死亡率，并且与对照组相比表现出显著差异。结果显示，使用杀虫剂二后，健康种子比例达到94%，而使用杀虫剂一后，健康种子比例为89%。对照组中有37%的种子未受虫害。在虫害发生后施用的情况下，这些产品可穿透昆虫表皮，导致昆虫死亡。杀虫剂二导致的死亡率最高。在评价的第20天，杀虫剂的效果体现在健康未感染种子的百分比上。与喷水的对照组相比，咖啡种子内部的昆虫种群数量减少。昆虫病原体与驱避剂的联合作用导致种子损伤最小化，同时实现昆虫死亡率最大化。这种对果实的侵染以及对昆虫的灭活确保了该方案的成功。该方法还可用于评估咖啡果实对咖啡果小蠹的耐受性或抗性。对于抗虫咖啡种子而言，也可能观察到对昆虫种群的负面影响。该方法不仅可用于昆虫学中评估具有不同作用机制的杀虫剂，还可用于植物育种中评价耐受性品种，以及在植物病理学中研究果实与病原体之间的相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

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防治咖啡果小蠹 Hypothenemus hampei 的控制药剂与杀虫剂测试方法

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