沙 门氏菌 斑疹伤寒诱导的小鼠脓毒性腹膜炎的特征

该协议描述了小鼠模型系统中革兰氏阴性单细菌性脓毒症的诱导。该模型有助于研究脓毒症期间的炎症和致死宿主反应。

脓毒症是对微生物侵袭或组织损伤的宿主免疫反应失调，导致器官损伤在远离感染或损伤的部位。在COVID-19大流行期间，公众对这种疾病的认识越来越高。2017年，全世界有4890万例脓毒症发病率和1100万例死亡，占全球死亡总数的近20%。

可以预料，大多数病例都在医院。事实上，一项研究发现，ICU脓毒症患者的阳性分离株中几乎有62%是革兰氏阴性菌。有几种模型，一些常用的脓毒症小鼠模型包括LPS诱导的内毒素血症，盲肠结扎和穿刺模型，以及单细菌感染模型系统。

在我们的实验室中，我们已经标准化了小鼠模型系统，使用鼠伤寒沙门氏菌诱导腹膜败血症。该模型优于其他模型，因为鼠伤寒沙门氏菌是一种细胞内病原体，模仿革兰氏阴性脓毒症的临床相关疾病。在该模型中，腹膜炎脓毒症的结果是全身性的，在感染后 96 小时内死亡率为 100%。

因此，该模型有助于研究炎症宿主反应。在该模型中，脓毒症是通过腹腔注射50万CFU的鼠伤寒沙门氏菌在8-10周龄的C57BL / 6小鼠中诱导的。全身感染可以通过评估器官细菌负荷，在感染后约16小时确认。

使用鼠伤寒沙门氏菌的实验需要BSL-2设施，并遵守BSL-2指南。必须注意使用适当的PPE，并确保安全，并遵循标准的BSL-2生物危害处置方法。所有实验均已获得机构动物伦理委员会的批准。

鼠伤寒沙门氏菌的培养制备。将一百微升鼠伤寒沙门氏菌NCTC 12023甘油储备液加入3毫升LB肉汤中。将培养物以每分钟160转，在37摄氏度下孵育过夜。

在LB肉汤中将50微升过夜培养物的条纹，放在志贺氏菌琼脂平板上，并在37摄氏度下孵育12小时。使用微尖从条纹SS琼脂平板中挑选单个菌落。将微尖放入3 mL LB肉汤中，并在37摄氏度下以160 RPM培养过夜。

将0.1mL细菌培养物加入50mL LB肉汤中，并在37摄氏度下以160RPM的振荡培养箱中孵育三至四小时，以达到生长的对数阶段。使用LB肉汤将培养物稀释两倍。在分光光度计中测量培养物在600纳米波长的光下的光密度。

一旦OD达到1，在1.5mL微量离心管中制备两个等分试样的1mL培养物。将管子以7， 750 G离心15分钟。弃去该上清液，并用1mL 1XPBS洗涤沉淀两次。

将管子以7， 750 G离心15分钟。将沉淀重悬于0.5 mL的1XPBS中，在两个不同的1.5 mL微量离心管中。将两个管中的悬浮液组合成一个1.5 mL的管，现在包含大约两个乘以10的功率，每mL有8个菌落形成单位。

通过稀释储备溶液制备10次6次CFU / mL的细菌细胞悬浮液。重要提示，在开始实验之前，请优化实验室中与OD相对应的CFU，以确定OD 1的CFU。小鼠和感染。

感染当天，单手握住小鼠，用70%乙醇擦拭腹部皮肤，张开后腿，使腹壁更容易接近。在1 mL注射器的帮助下，腹膜内注射0.5 mL 10的10至6次CFU / mL细菌悬浮液。感染后，平板培养物以检查实际注射的CFU，其可能从每0.5毫升0.2至0.8百万CFU不等。

CFU对器官的评估。使用二氧化碳窒息剂处死小鼠。牺牲受感染的小鼠后，用一块棉擦拭腹部，蘸有70%乙醇。

切开腹部皮肤。请参阅Ray和Dittle的文章，以获取有关如何收集腹膜灌洗液的视频协议。切开腹膜腔并收集感兴趣的器官。

在这段视频中，我们展示了肝脏器官CFU的枚举。在这种脓毒症模型中，肝脏经历广泛的组织病理学损伤。切一小块肝脏并将其放入微量离心管中。

这可以在冰中储存两到三个小时，然后再进行下一步。称量该块并将其转移到微量离心管中。优选地，将重约10至15mg的碎片切碎，以进行适当的均质化。

在试管中加入0.5mL的1XPBS，并使用手动均质机使器官均质化。确保器官完全同质化。通过加入0.5 mL的1XPBS，将体积增至1 mL。

将管子以200 G离心五分钟，摄氏四摄氏度。将上清液收集到新鲜的微量离心管中。在96孔板中制备10至功率减去1的稀释液，并将10至功率减去2的稀释液制备。

将50微升稀释剂铺在新鲜的SS琼脂平板上，并将平板在37摄氏度下孵育12小时。使用以下公式计算每种疾病中出现的集落数，并使用器官重量对数据进行归一化。CFU/mg等于菌落数，乘以20，乘以稀释因子，整体除以器官重量，单位为mg。

请注意，公式中使用数字20，将每个板的菌落转换为CFU / mL。这个数字是通过除以1 mL的给定体积的培养物的量来得出的。在本例中为 50 微升。

例如，如果你在SS琼脂平板中发现一百个菌落，其中50微升10次幂减去一次稀释的均质器官，体重10mg扩散，那么CFU / mg将等于100乘以20，乘以10，整体除以10，等于2000 CFU / mg。腹膜渗出物中各种免疫细胞群的流式细胞术分析。如前所述，由Ray和Dittle收集腹膜细胞。

从腹膜灌洗液中重悬细胞沉淀，在1mLRPMI中补充10%FBS。使用血细胞计数器枚举腹膜灌洗液中的总细胞数。以这种方式调整细胞数量，使每个管子接收2到5乘以10，提高到5个电池的功率。

在4摄氏度下以200 G的速度将细胞向下旋转10分钟。弃去上清液。用1XPBS洗涤细胞一次。

将细胞以200G离心10分钟。使用FcR阻断剂阻断Fc受体。一种是以400稀释，在封闭缓冲液中制备，由PBS中5%FBS和0.02%叠氮化钠组成。

在冰上孵育15分钟。将细胞以200G离心10分钟。弃去上清液。

在封闭缓冲液中稀释感兴趣的荧光染料偶联抗体。在这里，我们使用一种是将500稀释的抗小鼠Ly6G，来染色嗜中性粒细胞。注意，也可以显示其他免疫细胞群，对B细胞使用抗小鼠B220，对T细胞使用抗小鼠CD3，对巨噬细胞使用抗小鼠F4/80等。

在单独的试管中，在200微升稀释的抗体溶液中孵育约200万个细胞。作为阴性对照，每种荧光染料类型中留出一根管子，用于未染色的对照。在该管中，用不含抗体的200微升封闭缓冲液孵育细胞。

将样品在冰上孵育45分钟，每15分钟进行间歇敲击。将细胞以200 G离心10分钟，摄氏4摄氏度。弃去上清液。

用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟，如果需要储存几天。将细胞重悬于200微升FACS染色缓冲液中，PBS中为2%FBS。获取流式细胞仪中的数据。

这里显示的SS琼脂平板的图像表明了脓毒性小鼠肝脏和脾脏中的器官CFU负荷。将均质化的器官Lys6以10的稀释度扩散至负1的功率，并在37摄氏度下孵育。黑色色素的鼠伤寒沙门菌落在孵育后约12小时后出现。

此处以缩放插图的形式显示板的一部分，以突出显示菌落。这些结果表明，病原体成功地全身传播，并在内脏器官中定植。该图显示了从健康和脓毒性小鼠中分离出的血清。

脓毒性小鼠可收集的血液体积小于健康对照组，因此获得的血清较少。这是由于脓毒症凝血增加而发生的。此外，来自脓毒性小鼠的血清显示出明显的红色，表明发生广泛的溶血。

该图显示了来自健康和脓毒性小鼠的腹膜细胞的细胞术图，用抗Ly6G抗体染色。这些图像代表一只健康的小鼠和两只受感染的小鼠。脓毒性小鼠看到嗜中性粒细胞浸润到腹膜腔中增加。

在本视频中，我们展示了一种通过腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌在小鼠中诱导细菌性败血症的方法。这是研究治疗干预在减轻脓毒症方面的效果的有用模型。在该模型系统中，腹膜腔的细胞组成发生巨大变化，以对抗病原体。

因此，它是一个有用的模型，用于研究脓毒症期间免疫细胞组成和功能的动力学变化。该模型还有助于了解细胞间活性氧的增加，促炎细胞因子水平，溶血和凝血，所有这些都发生在脓毒症期间。