表征 沙门氏菌 小鼠中由伤寒沙门菌诱导的败血性腹膜炎

脓毒症是宿主对微生物入侵或组织损伤产生的失调性免疫反应，可导致远离感染或损伤部位的器官损伤。在新冠疫情期间，公众对该疾病的认识有所提高。2017年，全球有4890万例脓毒症病例，死亡人数达1100万，约占全球总死亡人数的20%。

正如所预期的，大多数病例发生在医院中。事实上，一项研究发现，在重症监护病房（ICU）中患有败血症的患者体内分离出的阳性样本中，近62%为革兰氏阴性菌。目前存在多种模型，其中一些常用于败血症研究的小鼠模型包括脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症模型、盲肠结扎穿刺模型以及单一致病菌感染模型系统。

在我们的实验室中，我们建立了一种标准化的小鼠模型系统，用于通过鼠伤寒沙门氏菌诱导腹膜脓毒症。该模型相较于其他模型具有优势，因为鼠伤寒沙门氏菌是一种细胞内病原体，能够模拟临床上常见的革兰氏阴性菌脓毒症状态。在此模型中，腹膜炎脓毒症的病程呈全身性发展，感染后96小时内死亡率达100%。

因此，该模型对于研究炎症性宿主反应具有重要作用。在此模型中，通过向8至10周龄的C57BL/6小鼠腹腔注射5×10⁵ CFU的鼠伤寒沙门菌来诱导脓毒症。可在感染后约16小时通过评估器官中的细菌负荷来确认全身性感染。

使用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的实验需要在BSL-2级实验室中进行，并严格遵守BSL-2级生物安全操作规范。必须正确使用个人防护装备（PPE），确保实验安全，并按照标准的BSL-2级生物危害废弃物处理方法进行处置。所有实验均已获得机构动物伦理委员会的批准。

鼠伤寒沙门氏菌的培养制备。取100 µL鼠伤寒沙门氏菌NCTC 12023甘油菌种，接种于3 mL LB液体培养基中。在37°C、160 rpm条件下过夜培养。

取50微升在LB肉汤中过夜培养的菌液，划线接种于沙门氏菌-志贺氏菌琼脂平板上，于37°C培养12小时。使用微量移液器吸头从划线的SS琼脂平板上挑取单个菌落，将吸头弹入3 mL LB肉汤中，于37°C、160 rpm条件下过夜培养。

取0.1 mL细菌培养物加入50 mL LB液体培养基中，在37摄氏度、160 RPM条件下于摇床培养箱中培养3至4小时，使菌液达到对数生长期。用LB液体培养基将培养物稀释两倍。使用分光光度计在600纳米波长下测定菌液的光密度。

当OD达到1时，取1 mL培养物分装到两个1.5 mL离心管中。在7,750 G下离心15分钟。弃去上清液，并用1 mL 1×PBS将沉淀洗涤两次。

将离心管在 7,750 G 条件下离心 15 分钟。将沉淀重悬于 0.5 mL 的 1×PBS 中，分装至两个不同的 1.5 mL 微量离心管中。将两管中的悬液合并至一个 1.5 mL 离心管中，此时菌液浓度约为 2 × 10⁸ 菌落形成单位/毫升。

制备浓度为10⁶ CFU/mL的细菌细胞悬液，通过稀释储备液获得。重要提示：在开始实验前，需在本实验室优化CFU与OD的对应关系，以确定OD为1时的CFU数值。小鼠与感染。

感染当天，用一只手固定小鼠，用70%乙醇擦拭腹部皮肤，并展开后肢以更方便地接触腹壁。借助1 mL注射器，向腹腔内注射0.5 mL浓度为10⁶ CFU/mL的细菌悬液。感染后，将培养物接种平板以检测实际注射的CFU，每0.5 mL注射液中的CFU数量可能在0.2至0.8百万之间波动。

器官的菌落形成单位（CFU）评估。使用二氧化碳窒息法处死小鼠。处死感染小鼠后，用浸有70%乙醇的棉球擦拭腹部。

切开腹部皮肤。有关如何收集腹腔灌洗液的视频方案，请参阅 Ray 和 Dittle 的文章。切开腹腔，取出目标器官。

在本视频中，我们将演示如何从肝脏中进行器官菌落形成单位（CFU）的计数。在此脓毒症模型中，肝脏会发生严重的组织病理学损伤。取一小块肝脏组织，放入微量离心管中。

此样品可在冰上保存两到三小时，然后进行下一步操作。称量组织块并转移至微量离心管中。为确保充分匀浆，建议将组织块切成约10至15 mg的大小。

加入 0.5 mL 的 1×PBS 至离心管中，使用手动匀浆器匀浆组织。确保组织完全匀浆。再加入 0.5 mL 的 1×PBS，将体积补至 1 mL。

在 4 °C 条件下，以 200 ×g 离心 5 分钟。将上清液收集至新的微量离心管中。在 96 孔板中制备 10⁻¹ 和 10⁻² 的稀释液。

取50微升稀释液，涂布于新鲜的SS琼脂平板上，将平板在37摄氏度下孵育12小时。计数每种条件下出现的菌落数量，并使用以下公式根据器官重量对数据进行归一化处理：每毫克菌落形成单位（CFU/mg）等于菌落数乘以20，再乘以稀释倍数，然后除以器官重量（单位为毫克）。

注意，公式中使用的数字 20 用于将每平板菌落数转换为 CFU/mL。该数值是通过将 1 mL 除以涂布到平板上的培养物体积（本例中为 50 微升）得到的。

例如，若在SS琼脂平板上观察到100个菌落，该平板接种了10 mg匀浆组织的10⁻¹稀释液50微升，则CFU/mg的计算方法为：100乘以20，再乘以10，然后除以10，结果等于2000 CFU/mg。腹腔渗出液中多种免疫细胞群体的流式细胞术分析。按照Ray和Dittle先前所述方法收集腹腔细胞。

用1 mL添加了10% FBS的RPMI重悬腹腔灌洗液中的细胞沉淀。使用血细胞计数板对腹腔灌洗液中的总细胞数进行计数。调整细胞数量，使每管接收2至5乘以10的5次方个细胞。

在 4 °C 条件下以 200 ×g 离心 10 分钟，沉淀细胞。弃去上清液。用 1×PBS 洗涤细胞一次。

将细胞在200 G条件下离心10分钟。使用FcR阻断剂封闭Fc受体。按1:400稀释，用封闭缓冲液配制，封闭缓冲液组分为PBS中含5% FBS和0.02%叠氮化钠。

冰上孵育15分钟。以200 G离心10分钟。弃去上清液。

将目标荧光染料标记的抗体用封闭缓冲液稀释。此处我们使用1:500稀释的抗小鼠Ly6G抗体来标记中性粒细胞。注意，也可使用其他抗体显示不同的免疫细胞群体，例如抗小鼠B220标记B细胞，抗小鼠CD3标记T细胞，抗小鼠F4/80标记巨噬细胞等。

将约 0.2 × 10⁶ 个细胞分别置于含有 200 µL 抗体稀释液的独立离心管中孵育。作为阴性对照，每种荧光染料类型均需保留一管作未染色对照。在该管中，将细胞与不含抗体的 200 µL 封闭缓冲液一同孵育。

将样品置于冰上孵育45分钟，每15分钟轻轻敲击一次。在4 °C条件下，以200 ×g离心10分钟。弃去上清液。

如需将细胞保存数天，可用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟。将细胞重悬于200 µL FACS染色缓冲液（含2% FBS的PBS）中。使用流式细胞仪采集数据。

此处所示 SS 琼脂平板图像反映了脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的器官 CFU 负荷。将匀浆后的器官裂解液 Lys6 以 10⁻¹ 稀释度涂布平板，并在 37 摄氏度下培养。约培养 12 小时后，出现黑色色素的鼠伤寒沙门菌菌落。

此处展示的是平板的一部分，以放大插图形式突出显示菌落。这些结果表明病原体已成功在体内系统性扩散，并定植于内脏器官。该图显示了从健康小鼠和败血症小鼠中分离得到的血清。

脓毒症小鼠可采集的血液体积少于健康对照组，因此获得的血清量也较少。这主要是由于脓毒症中凝血反应增强所致。此外，脓毒症小鼠的血清呈现明显的红色，提示发生了广泛的溶血。

该图显示了来自健康小鼠和脓毒症小鼠的腹腔细胞经抗Ly6G抗体染色后的流式细胞图。这些图像分别代表一只健康小鼠和两只感染小鼠的典型结果。脓毒症小鼠腹腔内中性粒细胞浸润显著增加。

在本视频中，我们展示了一种通过腹腔注射鼠伤寒沙门菌在小鼠体内诱导细菌性脓毒症的方法。该模型可用于研究治疗干预措施在减轻脓毒症方面的作用。在此模型系统中，为对抗病原体，腹腔内的细胞组成会发生显著变化。

因此，该模型在研究脓毒症期间免疫细胞组成和功能的动力学变化方面具有重要价值。该模型还有助于理解脓毒症过程中发生的细胞内活性氧水平升高、促炎性细胞因子水平增加、溶血以及血液凝固等现象。