Name: 研究小鼠小肠对管腔颗粒的机械传感 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 了解小鼠小肠机械传感研究方法，通过灌胃制备与活体成像技术追踪不同物理特性颗粒在肠道中的空间分布与转运决策过程。该技术为胃肠神经科学与机械敏感性研究提供高分辨率分析工具。

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感谢Lyndsay Busby女士提供的行政协助以及Joel Pino先生提供的媒体支持。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金资助：DK123549、AT010875、DK052766、DK128913，以及梅奥诊所胃肠道细胞信号转导中心（DK084567）。

本文所述所有方法均已获得梅奥诊所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 设置
<ol>
	<li>对8至10周龄的小鼠禁食4小时，期间允许小鼠自由饮水。 
	注：本研究中所有实验均使用野生型雄性C57BL/6J小鼠，但该方法适用于任何品系、性别和基因型的小鼠。</li>
	<li>将15 mL蒸馏水置于50 mL锥形管中，放入4 °C冰箱预冷。</li>
	<li>在烧杯中使用磁力搅拌器和加热板将另外15 mL蒸馏水加热至约80–90 °C。</li>
	<li>称取0.5%的甲基纤维素，总量为30 mL（即0.15 g）。</li>
	<li>将甲基纤维素缓慢加入15 mL热水中，避免结块。此过程中甲基纤维素溶液将呈现浑浊状态。</li>
	<li>待甲基纤维素完全溶解后，将烧杯从加热板上取下，并将15 mL预冷的蒸馏水加入热烧杯中。</li>
	<li>将混合液置于4 °C冰箱中冷却，直至溶液变澄清，约需15–20分钟。</li>
	<li>溶液澄清后，按每5 mL 0.5%甲基纤维素溶液加入3 mg罗丹明异硫氰酸酯标记的葡聚糖（RITC-dextran）的比例称量并混匀。此即代表性结果部分所述的液体状态。
	<ol>
		<li>或者，称取25 mg荧光聚乙烯微球，与200 µL甲基纤维素溶液充分混合至均匀。使用涡旋振荡器确保微球完全分散。实验人员必须观察确认混合液中悬浮微球分布均匀。</li>
		<li>由于RITC-葡聚糖溶液对光敏感，应将其冷藏保存。RITC-葡聚糖溶液和微球混合物需提前配制，并在2个月内使用完毕。使用前需重新混悬微球混合物。 
		&#8203;注：不同尺寸的微球可用于研究胃肠道对不同物质的处理情况。在代表性结果部分，我们展示了使用小尺寸（直径：75–90 µm）和较大尺寸（直径：180–212 µm）微球的实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 管腔内容物灌胃
<ol>
	<li>通过将18号×50毫米的喂养管连接至1 mL注射器，并吸取200 µL RITC溶液或微球溶液，制备灌胃液。</li>
	<li>使用单手固定技术手动固定禁食后的动物25。请参考本机构关于正确小鼠固定技术的相关说明。</li>
	<li>将喂养管轻柔地经小鼠口腔插入食道，直至进入胃部。 
	&#8203;注意：灌胃步骤是实验成功的关键。操作者需具备熟练经验，能够 consistently 将导管插入每只小鼠体内大致相同的深度。执行本方案的研究人员必须对这一操作进行标准化。所有需相互比较的小鼠群体应由同一名实验人员完成灌胃。</li>
	<li>缓慢将注射器内容物注入胃内，然后小心地将导管从小鼠体内取出。</li>
	<li>灌胃完成后，将小鼠放回笼中。</li>
	<li>丢弃使用过的灌胃管。</li>
	<li>根据所需动物数量，重复上述操作。</li>
</ol>
3. 肠道解剖
<ol>
	<li>开始解剖前，打开 体内 成像仪器，使其预热至工作温度。</li>
	<li>灌胃后30分钟处死小鼠。采用二氧化碳吸入法处死小鼠，随后进行颈椎脱位以确保安乐死成功。</li>
	<li>确认安乐死成功后，将小鼠仰卧位固定于解剖板上，并用大头针固定其四肢，以便暴露腹部。用70%乙醇润湿腹部表面，使腹毛湿润。</li>
	<li>使用显微解剖镊子（#5）提起皮肤，并用锐利的手术剪在肛门上方1 cm处做一横向切口。继续沿腹部垂直向上延伸切口，直至肋骨区域，以暴露腹膜腔。</li>
	<li>用显微解剖镊子将盲肠轻轻移向左侧，以暴露远端结肠。</li>
	<li>用显微解剖剪在直肠近端处剪断远端结肠。</li>
	<li>缓慢朝相反方向轻轻牵拉，逐步展开结肠、盲肠和小肠。 
	注意：保持所解剖的肠道为一个连续的整体，可为研究者提供最大便利。若肠道出现撕裂或破损，将使后续步骤更加困难。</li>
	<li>使用显微解剖剪在胃的近端处剪断。</li>
	<li>用镊子将解剖所得的肠道转移至测量板（图1）。将胃置于0 mm处，并沿刻度尺依次排列肠道至200 mm处。使用显微解剖剪在200 mm处剪断。重复此过程，将肠道段依次从0 mm对齐至200 mm，同时确保肠道方向不发生混淆。
	<ol>
		<li>对齐肠道时应避免拉伸组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织在刻度尺上排列完毕后，将盲肠调整至与肠道平行但不直接接触的位置（若该区域出现荧光信号，则需明确区分盲肠与肠道）。</li>
	<li>将带有解剖组织的测量板置于避光处，以保护荧光信号，直至成像前。</li>
</ol>
4. 离体成像
<ol>
	<li>打开 in vivo 成像软件并登录。</li>
	<li>初始化成像仪器，使其处于可进行图像采集的状态。</li>
	<li>将“激发”和“发射”参数设置为珠子或RITC灌胃所用对应的颜色。红色（液体）：激发 535 nm / 发射 600 nm；绿色（微球）：激发 465 nm / 发射 520 nm。</li>
	<li>将曝光设置为“自动”。</li>
	<li>选择视野范围。</li>
	<li>在将测量板放入仪器前，确保肠道在运输过程中未发生移位。</li>
	<li>将测量板放入仪器的视野范围内。</li>
	<li>牢固关闭仪器门，然后选择 Snapshot 拍摄视野图像。</li>
	<li>将采集的图像保存至U盘以供分析。分别保存荧光图像和拍照图像的单张图片。照片与荧光图像的叠加图可显示胃肠道内荧光物质的位置（图1）。 
	&#8203;注意：我们建议将文件保存为标签图像文件格式（.tif），以便后续处理。</li>
</ol>
5. 分析
<ol>
	<li>在图像编辑软件中打开荧光图像和照片图像文件。</li>
	<li>调整两幅图像的像素尺寸，使其具有完全相同的尺寸（我们通常将两幅图像均设置为1280像素 × 850像素 [高度 × 宽度]）。</li>
	<li>关闭照片文件。以下步骤仅涉及荧光图像。</li>
	<li>使用橡皮擦工具去除背景并使其变为透明。可能需要使用橡皮擦清除残留的背景斑块。</li>
	<li>创建一个新图层，并将其设置为荧光信号的纯黑色背景。可通过选择图层填充为黑色，并将该图层拖至荧光图像图层的下方来实现。</li>
	<li>将仅包含黑色背景上荧光信号的新荧光图像另存为一个新的 .tif 文件。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开新的荧光图像和照片图像。</li>
	<li>通过选择 图像 &#62; 类型 &#62; 32位，将每幅图像转换为32位图像。</li>
	<li>通过选择 图像 &#62; 颜色 &#62; 合并通道 创建两幅图像的合并图像。在弹出的对话框中，选择照片文件作为灰度通道，荧光文件作为任意彩色通道。</li>
	<li>通过选择 分析 &#62; 设定比例尺 &#62; 点击移除比例尺，关闭合并图像的比例尺显示。</li>
	<li>在 ImageJ 中选择 &#34;矩形&#34; 工具。</li>
	<li>在小肠的一段区域周围绘制一个矩形。需特别注意该感兴趣区域（ROI）的宽度，应确保所有 ROI 的宽度保持一致。具体数值并不关键，重要的是在本图像中绘制的所有 ROI 之间保持一致（由于小肠跨越多行，将在不同行上分别为小肠的每一段绘制单独的 ROI（图1））。图2 显示了 ImageJ 工具栏中宽度值的位置。</li>
	<li>通过选择 图像 &#62; 复制 复制该 ROI。仅选择对应于彩色通道的通道。</li>
	<li>再次使用矩形工具，在整个新图像上绘制一个 ROI。</li>
	<li>通过选择 分析 &#62; 绘制剖面图 获取荧光强度分布曲线。生成的图表在 y 轴上显示 ROI 长度方向上每个像素的平均强度值。该长度在步骤 5.12 中选定，即所分析的小肠段长度。</li>
	<li>打开数值列表并将其复制到电子表格软件中。</li>
	<li>对位于不同标尺行上的小肠各段重复执行步骤 5.12–5.16。将每组数值连续粘贴至同一电子表格文件中前一组数值的正下方，使该列中所有连续的行均包含小肠全长范围内的平均强度值。</li>
	<li>在电子表格软件中，将每个平均强度值乘以步骤 5.12 中创建的 ROI 矩形的固定宽度。这将得到小肠各位置处的实际强度值。 
	注意：不同动物的小肠长度可能存在轻微差异。为避免长度差异影响后续数据分析结果，需将强度值序列划分为数量一致的若干区间（bin），以便在所有实验样本间进行统一比较（图3、图4 和 图5 展示了三种不同 bin 数量下的结果）。</li>
	<li>将强度值的总数除以所需的 bin 数量。所得商 S 决定了每个 bin 所包含的强度值数量。</li>
	<li>使用向上取整公式确定每个原始强度值所属的 bin。此步骤将每个原始强度值分配至某一 bin 中。每个原始强度值按时间顺序以整数 N 编号，商 N/S 决定该原始值所属的 bin 编号，向上取整公式应将该商四舍五入为无小数的整数。</li>
	<li>使用 averageif 公式计算每个 bin 的数值。目标是计算步骤 5.20 中分配至特定 bin 的原始数值的平均值。因此，公式中的参数应为：(1) 步骤 5.20 中生成的已分配 bin；(2) bin 编号；(3) 原始强度值。 
	注意：对分 bin 后的数据可进行的首个分析是几何中心分析，用于量化荧光最高强度在小肠中的位置（图4）。</li>
	<li>将每个强度值除以总荧光强度进行归一化处理。即，将每个强度值除以所有强度值的总和。</li>
	<li>将每个归一化后的值乘以对应的 bin 编号。所得乘积反映了各 bin 对总荧光强度的相对贡献权重。</li>
	<li>将步骤 5.23 中生成的所有数值相加，得到荧光信号的中心所在 bin 编号。再除以 bin 总数，即可将几何中心表示为荧光中心所经过小肠长度的比例分数。 
	注意：为反映信号的空间分布特征，下一步是生成分 bin 后强度数据集的功率谱（图5）。</li>
	<li>在电子表格软件中打开快速傅里叶变换（FFT）向导。选择输入为分 bin 后的数据集，输出为与 bin 数量相同的空数据区域。</li>
	<li>提取 FFT 结果中的实部数值。</li>
	<li>将每个 FFT 实部数值平方，得到功率谱数据集。</li>
	<li>选取功率谱数据集的前半部分，并将其移至后半部分下方。此操作可使下步绘图时功率谱围绕中心频率对称分布。</li>
	<li>在 x-y 图表的 y 轴上绘制功率谱，x 轴的取值范围为 -1 × (bin 数量/2) 到 (bin 数量/2) - 1。例如，若 bin 数量为 1000，则 x 轴范围为 -500 到 499。</li>
	<li>应基于非零峰值的分布范围及其高度，对每只动物的功率谱进行比较。</li>
</ol>

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<li>Padmanabhan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+transit+measurements+in+mice+with+99mTc-DTPA-labeled+activated+charcoal+using+NanoSPECT-CT%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Jang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+discrimination+in+rat+and+mouse+gastric+emptying%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharmaceutics+and+Drug+Disposition%22%5BJournal%5D)">Size discrimination in rat and mouse gastric emptying.</a> Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).</li>
<li>Zhu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+sensory+neurons+communicate+with+interstitial+cells+of+Cajal+to+affect+pacemaker+activity+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).</li>
<li>Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+touchy+business+of+gastrointestinal+%28GI%29+mechanosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity.</a> Brain Research. 1693, 197-200 (2018).</li>
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胃肠道与其他管状器官（如血管）类似，需要机械感受器和效应器来维持稳态26,27,28。然而，胃肠道的独特之处在于，通过其管腔的物质物理性质在不同餐次之间并不恒定。具有不同物理性质（固体、液体和气体）的管腔内容物在肠道中移动，从而向胃肠道机械感受器产生不同的机械刺激。事实上，结肠中的不同机械刺激由不同的通路感知并传递29。
本方案在技术上适用于所有从事常规小鼠操作的研究人员，但有几个关键步骤需要特别注意。我们发现，在开始研究前对小鼠进行禁食非常重要，因为这可以消除先前进食对荧光信号的稀释作用。此外，饲喂标准饮食的小鼠会因食物成分（特别是其中的叶绿素成分）而在肠腔内产生自发荧光30。通过禁食并合理选择荧光染料，我们可以防止饲料自发荧光干扰本方案中所述实验的受控条件。我们建议实验人员应独立验证所选的禁食时间是...

人体胃肠道（GI）是一个长达数英尺的器官系统，大致可近似为一个尺寸和物理特性各异的管道1。当内容物在其内部移动时，胃肠道的主要功能是吸收维持生命所必需的物质。其中，小肠专门负责营养物质的吸收。小肠的转运过程受到严格调控，以协调消化与吸收功能，从而产生多种运动模式。Bayliss 和 Starling 于 1899 年描述了&#34;肠道定律&#34;2，揭示了如今被称为蠕动反射的肠道收缩推进程序：食糜近端的肠段发生收缩以推动其向前，而远端肠段则舒张以接收食糜。理论上，仅此模式就足以实现物质的向肛侧运输，但一个多世纪以来的研究揭示了胃肠道收缩活动更为复杂的图景。人类小肠存在三种公认的运动周期：移行性运动复合波（MMC）、空腹期和餐后期3。类似模式也在小鼠中被报道4,5。MMC 是一种在大多数哺乳动物中保守存在的周期性运动模式6,7。MMC 具有特征性的四相模式，可作为功能性胃肠道疾病中的重要临床标志7。这四个时相按发生顺序依次为：（I）静息期，（II）不规则的低幅度收缩，（III）规律的高幅度收缩，以及（IV）活动逐渐减弱的下降期7。MMC 是空腹期的主要运动模式3。空腹期的 MMC 可清除小肠内容物，为下一餐的摄入做好准备。
餐后时期的运动模式经过优化，以适应消化和吸收功能3。无论热量组成如何，食糜在小肠内的初始通过速度较快，内容物被分散至整个肠段，随后传输速度减慢8。通过增加接触表面积并减缓传输速度以延长停留时间，从而优化吸收效率。当营养物质进入肠腔后，主要的运动模式为密集的（&#60;2 cm 间隔）非协调性收缩（分节性收缩），并叠加少数跨越整个小肠长度的高幅收缩（推进性收缩）9。分节性收缩主要在局部混合肠腔内容物，而偶发的大幅度推进性收缩则推动内容物向结肠方向移动。
这种恢复到MMC周期的时间取决于食物的体积和热量组成10。因此，小肠通过感知管腔内的信号来调控不同运动时相之间的转换时机。机械性刺激，例如管腔内容物的物理特性11、管腔容积和肠壁张力，可激活胃肠道壁中的机械感受细胞12,13,14,15,16。事实上，增加餐食中的固体成分会导致小肠通过时间延长17。我们推测，管腔内容物的物理状态（如液体或固体）因其在胃肠道壁上产生的作用力不同，可能激活了不同的机械感受器18。
测量的金标准 体内 在人类和小鼠中，胃肠道传输的检测均采用放射性示踪剂，通过闪烁扫描法测量其从胃部排出或在结肠中传输的过程。19,20在哺乳动物中，小肠以不可预测的方式盘绕，使得小肠难以成像 体内 可靠地，但相关研究正在推进中21此外，目前尚缺乏用于量化小肠对不同性质和尺寸颗粒物处理能力的工具。本研究的起点是一种作为金标准的技术，可对小肠转运研究进行标准化22,23,24 和屏障功能22通过向小鼠灌胃荧光物质，待胃肠道蠕动将物质输送后，取出胃肠道组织，从胃至结肠分段切割，随后对各段腔内含物进行切片和匀浆处理，以定量检测荧光强度。我们进行了两项改进：第一，调整了灌胃液成分，加入荧光微珠，以评估小肠对物理颗粒物的分布情况；第二，通过成像从胃至结肠的完整胃肠道，提高了空间分辨率。 离体 并采用可变大小的区间划分方法，以在不同动物间标准化分析。我们推测，这揭示了餐后阶段推进性收缩与分节收缩之间平衡的新见解。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>本方案也可使用其他品系小鼠</td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td>用于电子表格分析</td></tr><tr><td>荧光绿色聚乙烯微球 1.00g/cc 75-90um - 10g</td><td>Cospheric</td><td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td><td>&quot;较小微球&quot; 在文稿中</td></tr><tr><td>荧光绿色聚乙烯微球 1.00g/cc 180-212um - 10g</td><td>Cospheric</td><td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td><td>&quot;较大小球&quot; 在文稿中</td></tr><tr><td>灌胃针头</td><td>Instech</td><td>FTP-18-50-50</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>用于提取荧光轮廓</td></tr><tr><td>覆膜尺纸（自行制备）</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素（黏度：400 cP）</td><td>Sigma</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 软件</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>用于图像处理</td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>r8881-100mg</td><td>&quot;液体&quot; 条件在文稿中</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>活体成像系统</td></tr></tbody></table>

研究小鼠小肠对管腔内颗粒物的机械感知

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

胃肠道（GI）运动功能对正常的消化和吸收至关重要。在负责营养吸收的小肠中，运动功能可优化消化与吸收过程。因此，小肠中存在多种运动模式，包括用于混合腔内内容物的分节运动和推动内容物前进的蠕动运动。腔内内容物的物理特性可调节小肠运动的模式。腔内物质的通过及其引发的肠道运动对胃肠道机械感受回路产生机械刺激，从而启动并调节复杂的胃肠道运动模式。然而，驱动这一过程的机械感受机制仍不甚清楚。这主要由于缺乏可用于解析小肠如何处理不同物理特性物质的研究工具。为了研究小肠对不同大小颗粒物的处理方式，我们改进了一种既有的方法 体内 测定小肠传输的小鼠方法。我们通过灌胃向活体小鼠给予荧光液体或微小荧光微珠。30分钟后，解剖小鼠取出肠道，对荧光物质在整个胃肠道中的分布情况进行成像。除了对几何中心进行高分辨率测量外，我们还采用可变尺寸分箱和频谱分析方法，以确定不同物质对小肠传输的影响。利用该方法，我们已探究了一种新近发现的“肠触觉”机制对小肠运动功能的调控作用。

关键词：小肠传输，灌胃，荧光微珠，胃肠道成像，几何中心，分箱分析，频谱分析，肠运动，小鼠模型，gut touch

我们展示从第3步开始的代表性结果。图1显示了完整取出的肠道组织，叠加了荧光测量结果。胃（紫色）与小肠（橙色）沿同一轴线放置，但我们倾向于将盲肠（蓝色）移至一侧，以避免与大肠（橙色）重叠。如左图所示，由于器官大小限制，这种布局并不总是可行。我们通常在约200 mm处切断小肠，以最大程度覆盖连续的肠段，但由于肠系膜限制了肠道的展开，以及我们倾向于避免切断荧光颗粒或盲肠等结构，因此该操作并非总能实现。图1左图中的红色强度以及中图和右图中的绿色强度被分入不同大小的区间，用于生成图3。仅提取橙色感兴趣区域（ROI）内（小肠）的强度用于分析。分析时提取小肠的全长（即每个图中所有橙色ROI）。橙色ROI的宽度一致，如ImageJ中所示（图2）。在分区间之前，将所有强度值按顺序拼接在一起。图3显示了每组的平均荧光轨迹及其标准误（SEM）；具体细节请参见图注。...

为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒物，我们改进了一种已建立的方法 体内 测定小肠传输时间的方法

胃肠道（GI）运动功能对正常的消化和吸收至关重要。在负责营养吸收的小肠中，运动功能可优化消化过程……

本方案用于研究小肠如何处理具有不同物理特性的物质，以及这些物质在空间中的分布情况。该方法是我们研究肠道机械敏感性的重要补充工具。本方案的主要优势在于，可用于研究具有不同物理特性的材料或混合物，且其分辨率能够使我们分辨出短肠段内的区域性通过情况。该技术增强了我们对肠道机械敏感性的理解，有助于阐明小肠如何根据来自管腔内容物的机械信号做出转运决策。首先，通过将一根直径18号、长50毫米的饲喂管连接至1毫升注射器，并吸取200微升RITC溶液或微球溶液，制备灌胃液。接下来，使用单手固定法手动固定禁食后的动物，然后将饲管轻柔地经小鼠口腔和食道插入，直至进入胃内。插入后，缓慢将注射器中的内容物推入胃中，然后小心地将饲管从小鼠体内取出。灌胃完成后，将小鼠放回笼中。开始解剖前，打开活体成像仪器，使其达到所需温度。安乐死后，将小鼠仰卧位放置于解剖台上，并用针固定其四肢，以暴露腹部。随后，用70%乙醇润湿腹部表面。接下来，使用显微解剖镊牵拉皮肤，并用锋利的手术剪在肛门上方1厘米处做一横向切口。为暴露腹膜腔，将切口沿腹部垂直向上延伸至肋骨区域。在操作肠道之前，应轻柔地处理肠管，并观察其在腹腔内的解剖位置和走向。在胃食管连接处近端切断，从而将胃与食管分离，并通过缓慢向相反方向牵拉，轻柔地展开结肠、盲肠和小肠。使用显微解剖剪分离肠系膜与肠道的连接组织。随后，用镊子将解剖好的肠道转移至测量板上。将胃置于0毫米处，沿直尺排列肠管直至200毫米，然后用显微解剖剪在200毫米处剪断肠管，并重复此肠管排列步骤。组织在直尺上排好后，将盲肠与组织平行放置，但不与其直接接触。将带有已解剖组织的测量纸置于避光处，以保持荧光，直至成像时使用。开始离体成像时，打开成像软件，登录并初始化成像仪器，使其准备就绪以进行图像采集。对于RITC灌胃实验，设置激发波长为535纳米，发射波长为600纳米。对于绿色微球珠，将激发波长设为465纳米，发射波长设为520纳米。现在，将曝光设为自动，并选择视野区域。在确认肠道在运输过程中未发生移位后，将测量板放入仪器的视野范围内。牢固关闭仪器门，选择“快照”以拍摄视野图像。将采集的图片保存至U盘以供分析。接下来，分别保存荧光图像和拍照图像的单张截图。照片与荧光图像的叠加显示了胃肠道中荧光物质的位置。在图像编辑软件中打开荧光图像和照片文件进行分析。调整两幅图像的像素尺寸，使其具有完全相同的大小，然后关闭照片文件。对于荧光图像，使用橡皮擦工具去除背景并使其透明。创建一个新图层，将该图层填充为黑色，并将此图层拖至荧光图像图层的下方，从而形成纯黑色背景。将仅包含黑色背景上荧光信号的新荧光图像保存为新的 TIF 文件。在 ImageJ 中打开新的荧光图像和照片图像。依次选择“图像”、“类型”，然后选择“30 位”，将每张图像转换为 30 位图像。通过选择“图像”，然后选择“颜色”和“合并

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

研究小鼠小肠对管腔颗粒的机械传感

术后肠梗阻（POI）是腹部手术后的一种并发症，可导致发病率升高和住院时间延长。由于目前缺乏有效的预防或治疗策略，亟需加强相关研究。因此，我们建立了一种标准化且可行的小鼠模型，用于研究POI的病理生理机制，并探索潜在的治疗方案。...

肠道运动功能及肠壁炎症在啮齿类动物中的功能评估：标准化肠道操作模型中的分析

本视频展示了在小鼠模型中建立回肠袢模型以研究肠道通透性的方法。该方法提供了一种活体模型，用于理解上皮屏障功能及其引发的免疫反应。...

小鼠回肠环模型：一种用于研究小鼠肠道通透性的外科手术模型

在本视频中，我们介绍了一种用于构建小鼠近端结肠袢（pcLoop）节段的外科手术方法，随后向该节段进行管腔内注射荧光标记物，以研究肠道上皮通透性。...

小鼠近端结肠袢模型的建立：一种通过肠腔内注射荧光标记物并检测血清中荧光信号以评估肠道通透性的外科手术方法

在实验动物胃肠道中对平滑肌收缩进行体内测量仍是一种强大但尚未被充分利用的技术。目前市场上无法购得柔性双元件应变规，需自行制备。本方案描述了用于在啮齿类动物中进行急性或慢性植入的可靠且低成本应变规的构建方法。...

微型双元件应变计的制备与植入用于测量 体内 啮齿类动物的胃肠道收缩

本方案描述了使用离体肠组织制备物或“肠囊”作为肠道屏障功能的离体模型。ex vivo...

体外 肠道囊泡法评估胃肠道疾病模型中的黏膜通透性

本文介绍了一种视频成像技术及高分辨率时空图谱方法，用于识别成年小鼠结肠运动神经调控的变化。利用该方法在离体组织样本中可检测胃肠道（GI）功能的细微影响，从而增进对胃肠道疾病的理解。...

利用视频成像与时空图分析小鼠胃肠道运动功能

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。...

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。...

利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

本研究介绍了一种利用完整肠组织和多光子显微镜进行三维成像的方法，用于定量分析分泌的黏液，从而实现对氯化氨甲酰胆碱等刺激物作用下黏液动态变化的精确体积分析和可视化。...

利用全组织成像对肠道黏液进行三维定量分析

本文描述了：（1）从出生后第6天（DOL 6）起对新生小鼠进行口服灌胃给药；（2）通过Ussing chamber评估出生后第10天至断奶期（出生后第20天）幼鼠结肠上皮屏障功能的离体（ex...

新生小鼠口服灌胃及利用尤斯室功能评估肠道屏障完整性的方法

了解小鼠小肠机械传感研究方法，通过灌胃制备与活体成像技术追踪不同物理特性颗粒在肠道中的空间分布与转运决策过程。该技术为胃肠神经科学与机械敏感性研究提供高分辨率分析工具。

研究小鼠小肠对管腔内颗粒物的机械感知

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