Name: 基于宽带受激拉曼散射显微镜的多重化学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习宽带受激拉曼散射显微镜技术，实现无标记、非侵入式化学成像。该方法可快速测量分子振动光谱，用于细胞和组织的化学成分定位与定量分析，在神经科学和生物医学研究中具有重要应用价值。

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D. P. 感谢欧洲联盟项目 CRIMSON（资助协议编号：101016923）和伦巴第大区政府项目 NEWMED（资助协议编号：POR FESR 2014-2020）提供的资金支持。G. C. 感谢欧洲联盟项目 GRAPHENE Core3（资助协议编号：881603）提供的资金支持。G. C. 还感谢沙特阿卜杜拉国王科技大学提供的资助（资助编号：OSR-2016-CRG5-3017-01）。

1. 样品制备
注意：本方案描述了化学异质混合物的浓度分布图和特征受激拉曼散射（SRS）光谱的获取方法。
<ol>
	<li>样品制备：从聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微珠的水悬浮液中吸取 2 µL（参见材料表），并将该 2 µL 液滴置于显微镜盖玻片上。
	<ol>
		<li>使用洁净的移液器吸头，从聚苯乙烯（PS）微珠的水悬浮液中吸取 2 µL，并将其与盖玻片上的 PMMA 悬浮液混合。用移液器吸头轻轻混匀悬浮液，静置干燥 24 小时。 
		注意：必须精确匹配两种微珠悬浮液的浓度，以避免样品表面微珠数量比例失衡。PS 和 PMMA 微珠的直径分别为 10 和 6 µm。这些尺寸可在不降低受激拉曼散射（SRS）信号生成效率的前提下，展示显微镜的高空间分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待水分蒸发后，在盖玻片上形成一层平坦的白色微珠层，向其上加入 20 µL 二甲基亚砜（DMSO），随后加入 20 µL 纯橄榄油。</li>
	<li>在另一张显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油，将该盖玻片盖在混合液上，使涂抹指甲油的一面朝下，施加适当压力以确保密封，然后静置干燥。 
	​注意：图3 展示了采用上述步骤获得的典型结果。若密封良好，该样品可保存长达三个月。</li>
</ol>
2. 优化泵浦光和斯托克斯光束
<ol>
	<li>打开激光器，使其达到热平衡状态。对基频光束施加群延迟色散（GDD = -6,000 fs2）的负群延迟色散。 
	注意：该GDD值对于成功驱动OPO至关重要，在本实验装置中为最优值，但在不同系统中可能有所变化。负GDD可通过光栅对、棱镜压缩器或基于空间光调制器的脉冲整形器引入28。</li>
	<li>使用偏振分束器（PBS1）将基频激光分为两路。为获得窄带斯托克斯脉冲，将其中一路4 W的光束导入法布里-珀罗标准具。轻微旋转标准具，直至获得一条窄谱线，并使其光谱峰值居中（见图2中的红色曲线）。 
	注意：该标准具在1,040 nm处的有效精细度为29，自由光谱范围为29.8 nm。</li>
	<li>为获得调制的斯托克斯脉冲，将窄带光束送入声光调制器。 
	注意：如图4A所示，一级衍射光束的调制深度为100%，而零级仅为50%。因此，优先使用一级衍射光束，以避免用强未调制光束照射样品，从而防止样品光损伤且不产生任何SRS信号。
	<ol>
		<li>为优化调制效率，调节透镜f1与f2之间的距离（图4B）。使用光电二极管测量调制光束，并用示波器记录其波形。</li>
		<li>调节f1与f2之间的距离，直至示波器读数的信号幅值与基线之间达到最大对比度。 
		注意：这对透镜并非作为准直器使用，而是用于在声光调制器晶体处形成有效聚焦光斑。</li>
		<li>放置第三片透镜f3，以微调斯托克斯光束的束腰，从而改变显微镜焦平面处的相互作用体积，进而优化SRS信号。 
		注意：在本实验方案中，斯托克斯光束的调制频率为1.6 MHz。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将基频光束剩余的6 W光学功率聚焦到一块三硼酸锂（LBO）晶体（LBO1，θ = 90°，φ = 13.8°）上，通过二次谐波产生（SHG）过程实现基频光的倍频（图5A）。
	<ol>
		<li>为最大化SHG效率，轻微旋转晶体，调节φ角（图5B）。优化LBO1，使其产生至少2.5 W的SHG输出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节LBO2的φ角，以最大化信号光束的产生效率。 
	注意：透镜f1、f2和f3的焦距经过精心选择，以实现SHG光束与OPO谐振腔的模式匹配。因此，在不同实验装置中这些透镜的焦距可能不同。由于OPO谐振腔中存在残余色散，谐振腔长度的微小变化会引起信号光束光谱的偏移。
	<ol>
		<li>调节谐振腔长度，使泵浦光谱与1,040 nm处的窄带斯托克斯光结合后，能够产生1,373–5,090 cm-1范围内的频率失谐。该范围覆盖了CH伸缩振动光谱区域（2,800–3,050 cm-1）。参见图2中的蓝色光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为补偿激发显微镜物镜引起的色散效应，将宽带泵浦光送入棱镜压缩器。将泵浦光从棱镜A的顶角入射，并引导色散后的泵浦光朝向棱镜B的顶角。根据所需补偿的负色散量，设定两棱镜顶角之间的距离L。 
	注意：图6展示了棱镜的排列方式29。在本例中，补偿设定为GDD ≈ -12,800 fs2，因此L = 1.26 m。
	<ol>
		<li>使用布儒斯特角切割的棱镜。
		<ol>
			<li>确保泵浦光束的偏振方向位于棱镜的三角平面内（即上下未抛光面）。</li>
			<li>确保泵浦光束的入射角θin等于布儒斯特角。</li>
			<li>确保棱镜A的出射面与棱镜B的入射面平行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为估算待补偿宽带脉冲的GDD，测量单一波长λ1处的SRS信号，记录泵浦-斯托克斯之间获得最大SRS(λ1)时的时间延迟τ1。对第二个波长λ2重复该过程，再次记录SRS(λ2)最大时的时间延迟τ2。 
		注意：由于GDD定义为群延迟对角频率的导数，上述测量可用于估算宽带光束的GDD（公式[1]）。 
		<img alt="GDD方程；方程；光学系统中的群延迟色散，时间与频率变量。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1">    (1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用λ/2波片，将泵浦光束的偏振方向设置为45°。将偏振后的泵浦光引导至一块长度为13.3 mm的YVO4晶体，并将其快轴方向设为垂直。 
	注意：当泵浦脉冲通过YVO4晶体时，会被分裂为两个正交偏振的副本，沿共线方向传播，但彼此之间保持约Δt ≈ 10 ps的时间延迟。该延迟取决于双折射晶体的厚度及其折射率。此后，将与斯托克斯脉冲偏振态相同的泵浦副本称为“信号”，而偏振态正交的副本称为“参考”。该技术称为共线平衡探测，其详细描述已有报道30。</li>
	<li>使用二向色镜合并泵浦光与斯托克斯光，并利用一对荧光针孔仔细对准，确保两者共线传播。衰减光束后，使用透镜将其聚焦到一个高速（带宽至少100 MHz）光电二极管上。
	<ol>
		<li>遮挡泵浦光，使用高带宽数字示波器测量单个斯托克斯脉冲。使用激光器的触发信号作为示波器测量的时钟源。确定光电二极管电压达到最大值时的平均值。</li>
		<li>遮挡斯托克斯光束，并对泵浦脉冲重复该过程。增加或减少泵浦（斯托克斯）光束的光程，直至其脉冲大致与斯托克斯（泵浦）脉冲同时到达。 
		注意：这应能保证两臂之间的光程差匹配精度最高可达几毫米。</li>
		<li>移除光电二极管，放置一块适合泵浦-斯托克斯光子和频产生（SFG）的非线性晶体，其切割角度合适。 
		注意：此处使用的非线性晶体为I类相位匹配切割，θ = 90°，φ = 9.8°。非线性晶体的光轴应与斯托克斯光和信号光的偏振方向平行。</li>
		<li>使泵浦/斯托克斯光束略微非共线，并移动延迟线，直至观察到SFG信号。该信号由于相位匹配，位于泵浦与斯托克斯光的二次谐波之间。若未观察到信号，需验证两光束在晶体上的空间重叠情况。 
		注意：SFG信号发生蓝移，肉眼应可轻易观察到。</li>
		<li>若遇到意外困难，可放置低通滤波器以去除泵浦光、斯托克斯光及其各自的二次谐波，并使用光谱仪测量SFG信号（图7A）。找到SFG强度最大时对应的时间延迟，该值即为非线性信号生成所需的最佳时空重叠条件，并将延迟线固定在此位置（图7B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用校准相机测量光束轮廓。或者，使用红外卡纸并通过目视估算光束直径。使用两套望远镜系统，分别用于泵浦光和斯托克斯光束。通过调节望远镜，使光束直径与激发物镜的后光阑相匹配。 
	注意：该步骤可确保实验装置达到最大空间分辨率。
	<ol>
		<li>在获得SRS信号后，使用泵浦光束上的望远镜微调其光束直径，改变其瑞利长度，从而调节显微镜焦点处的相互作用体积。当SRS信号达到最大时停止调节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光电二极管测量泵浦（斯托克斯）光束的强度，并结合光电二极管的响应度，计算入射到探测器有效区域的平均功率 <img alt="静态平衡图，ΣFx=0，力分析，矢量分解，物理教学工具。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2">。
	<ol>
		<li>若使用高带宽光电二极管，连接电子低通滤波器，仅获取恒定或直流分量。为测量δP(f)，将高带宽光电二极管的输出（断开低通滤波器）连接至锁相放大器的输入端。在不同解调频率下存储锁相放大器的输出 <img alt="电压噪声谱密度；方程；V/√Hz；电信号分析；科学测量。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式3">，并利用光电二极管的响应度将电压单位转换为瓦特单位。 
		注意：商用锁相放大器内置测量δP(f)的工具（例如，Zurich Instruments在其LabOne软件中集成了频率扫描器31）。</li>
		<li>测量光束的相对强度噪声（RIN）后，关闭激光器并测量电子噪声（即在无光照条件下计算的RIN）。 
		​注意：若RIN主要由激光波动限制而非散粒噪声限制，则此暗噪声测量有助于诊断所用测量仪器；若电子噪声与激光RIN相当，则无法用于准确测量激光RIN，可能需要使用超低噪声放大器以降低电子噪声。</li>
		<li>若RIN由散粒噪声限制而非激光波动限制，则增加照射到探测器上的光功率。参见图8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置SRS成像的光谱检测
<ol>
	<li>将泵浦光束和斯托克斯光束引导至显微镜。</li>
	<li>将第1节中讨论的样品放置到位，并寻找一个无微珠的区域以帮助对准泵浦光束。使用相机，在阻断泵浦光（斯托克斯光）的情况下测量斯托克斯（泵浦）光束的反射轮廓。通过显微镜前的反射镜调节激光光斑的位置。 
	注意：为了获得最高的受激拉曼散射（SRS）信号，它们应完全重叠。 图9 显示（A泵B）斯托克斯，以及（C) 两束光在显微镜的焦平面处完全重叠。</li>
	<li>使激发物镜与收集物镜共焦。 
	注意：使用无限远校正物镜意味着将泵浦光聚焦到样品平面时，会在收集物镜的后光阑处形成一束准直光。
	<ol>
		<li>在光路中加入短通滤光片以去除调制的斯托克斯光，并将泵浦光引导至光栅。在光栅后放置一个透镜，将色散后的光束聚焦到探测器上。 
		注意：光栅方程将有助于确定线色散率（即在给定焦距透镜的情况下，探测平面每毫米对应多少纳米） f32）。光栅方程描述了刻槽周期性与 d 光栅的衍射角β、入射角α、衍射波长λ以及衍射级次 m (Eq [2]). 
		<img alt="衍射光栅方程 mλ=d(sinα+sinβ)，示意图，光学光谱实验装置。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"> (2)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为实现平衡探测，测量沿泵浦光束传播的参考光和信号副本的光谱。 
	注意：经过光栅后，泵浦光束的空间分布呈一条线，该线沿其长度方向包含宽带泵浦光的不同光谱成分。泵浦光谱线中的每个光谱成分将在特定距离处聚焦 f 通过球面透镜（见步骤 3.1–3.2）。
	<ol>
		<li>为避免截断分散的泵浦光，应将球面透镜尽可能靠近光栅放置。在球面透镜后紧接放置一个偏振分束器（PBS），以分离泵浦光的复制光束。 
		注意：此处使用了偏振立方体分束器，因为这种类型的偏振器不会扰乱泵浦光束的偏振态。它还能有效分离不同的泵浦副本，并且尺寸足够大，可避免截断宽带泵浦光。该偏振分束器（PBS）将反射信号副本（s偏振）并透射参考副本（p偏振）。</li>
		<li>使用一对转向镜，将信号光和参考光分别引导至各自的探测器图1). 
		注意：在理想的平衡配置中，信号光与参考光的副本应具有相同的光功率。</li>
		<li>为消除泵浦光束中的噪声，将测量信号的光电二极管阵列各通道与其在参考探测器中的对应通道进行关联。因此，需确保第 n 个通道th 信号光电二极管阵列和参考光电二极管阵列分别测量信号和参考光副本中相同光谱成分的光功率。 
		注意： 图8 显示典型的RIN谱图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保两个光电二极管阵列之间的光谱匹配，在光栅与偏振分束棱镜（PBS）之间放置一个小狭缝或可调光阑，以对色散后的泵浦光进行空间滤波。裁剪掉泵浦光复制像中除一个光谱成分以外的全部成分，使透射光线在n处居中th 参考和信号光电二极管阵列的探测器。使用上述转向镜调节不同检测通道之间的相关性。</li>
	<li>此时，开始进行受激拉曼散射（SRS）显微成像。具体操作为：调制斯托克斯光，对样品进行光栅扫描，并同步采集泵浦光谱上的调制信号转移量（ΔI）及其对应的直流光谱信号（I），从而获得每个像素的归一化SRS信号（ΔI/I）。生成三维矩阵，其行（x）和列（y）对应样品的扫描位置，在垂直于x-y平面的每个矢量（z）上存储相应的SRS光谱。 
	注意： 图12 显示SRS高光谱数据的结构。
	<ol>
		<li>将斯托克斯光束的功率设为 65 mW，宽带泵浦光束的功率设为 20 mW。为实验设置理想的积分时间。 
		注意：此处积分时间为 44 µs；但由于压电扫描器速度较慢，像素驻留时间为1 ms。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 高光谱SRS数据的化学计量学分析
<ol>
	<li>使用多元曲线分辨分析法解析样品中不同的化学组分。从 Tauler、de Juan 和 Jaumot 提供的链接下载图形用户界面（GUI）33. 
	注意：此处使用了Tauler及其同事开发的多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）MATLAB程序34,35有关MCR-ALS在SRS数据中的应用，请参见 36,37；有关该算法的详细讨论，请参见 38.</li>
	<li>在 MATLAB 中，将 SRS 超光谱数据立方体重塑为矩阵 D 其行包含SRS光谱。假设展开的SRL超立方体 D 是浓度的线性组合 C 以及光谱特征 S 样品中化学成分的（即， D = CS T + E，其中 E 是一个包含实验误差的矩阵，上标 T 表示矩阵转置。</li>
	<li>分离数据的主要成分 C 和 S. 由于已先验地知道第1节中讨论的样品包含四种物质，即DMSO、橄榄油、PMMA和PS，因此将程序设置为搜索四种物质，并额外增加一种以考虑背景噪声。如果样品中物质种类数量不同，则应根据实际情况相应调整程序设置。 
	注意：该程序对光谱数据进行奇异值分解，并将其作为纯光谱的初始估计值 S.
	<ol>
		<li>或者，向程序输入包含已知光谱特征的矩阵（例如，物质的自发拉曼光谱）。 
		注意：利用纯光谱的初始估计值，该程序将进行计算 C = DS(STS−1 和 ST = (CTC)−1CTD. 新的数值 C 和 S 采用交替最小二乘算法进行优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于SRS是一种非负信号，需约束交替最小二乘算法仅输出正值。 
	注意：优化后的 C 和 S 将能够构建一个新的矩阵 D*= CST，程序将用该数据集与原始数据进行比较 D程序会自动重复这些步骤，直至差异达到设定要求 D* 和 D 小于可定义的任意阈值。</li>
	<li>绘图 C 和 S 获取样品化学成分的化学图像及其特征光谱。</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Raman Imaging.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).</li>
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G. C. 宣布与剑桥拉曼成像公司存在关联，该公司旨在推动宽带受激拉曼散射显微技术的商业化。其他作者声明无利益冲突。

宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大的成像方法，能够提供真实的化学对比度，用于识别和区分异质样品中的化学组分。这种分析工具在多个研究领域具有广泛应用前景，从材料科学到组织病理学均可受益。然而，宽带SRS显微技术的缺点在于其技术要求较高：实验人员不仅需要掌握宽带激光光源的相关知识，还需对激光脉冲进行精确调控，以高效产生SRS信号，而该信号本身又需要借助复杂的检测方案进行测量。本文提供了一套详细实验方案，描述了如何利用多路复用宽带SRS显微镜生成混合化学化合物的化学分布图。尽管所述工作对于某些激光物理学家和非线性显微技术专家而言可能较为基础，但对于那些科研背景不在该领域、却希望利用宽带SRS显微技术优势的读者来说，仍具挑战性。因此，本文旨在详尽描述每一个操作步骤，以指导广大对宽带SRS显微技术感兴趣的科研人员。
本方案首先介绍了如何制备一种简单但拉曼散射光谱丰富的样品，该样品由多种强拉曼散射体且已知的物质组成。我们讨论了如何获得宽带泵浦光和窄带斯托克斯光，以搭建受激拉曼散射显微镜系统。 图5C 展示了SHG和OPO装置的示意图。注意透镜f1 将基频光束聚焦到LBO上1 用于产生二次谐波（SHG），而二向色镜反射SHG辐射并透射剩余的基频光束。第二个透镜f2 准直SHG光束。当f2 &gt; f1，SHG 光束被扩束，扩束倍数等于 f2/ｆ1第三片透镜 f3 将扩大的SHG光束聚焦到第二块I型LBO晶体（LBO2）在 θ = 处切割 90° 且 φ = 29.0°通过泵浦LBO2 使用上述SGH（520 nm）时，680-910 nm波长范围的辐射将从LBO中出射2 通过差频产生（DFG）生成两束光：信号光和闲频光27 (图5D，E）。后者被弃用，而前者在OPO腔内被放大，以提供SRS实验所用的泵浦脉冲。OPO在520 nm处的泵浦光（即SHG光束）不应与SRS实验中的泵浦光（即OPO的信号光束）混淆。
SRS显微成像的对比度来源于显微镜焦点处产生的非线性信号，该信号要求在特定时间内将大量光子限制在样品平面内。这种光子限制通过高数值孔径（NA）的显微物镜实现，该物镜由一组透镜组成，同时也决定了系统的空间分辨率：数值孔径越高，空间分辨率也越高。然而，高NA物镜内部玻璃结构密集，会对脉冲辐射引入正群延迟色散（GDD），即一种频率啁啾，最终导致脉冲的时间轮廓展宽39。因此，显微物镜引入的GDD可能会延长宽带泵浦脉冲的持续时间，使其甚至长于斯托克斯脉冲的时间包络，从而降低拉曼信号的有效可用带宽。此外，这种展宽还可能引起所测SRS光谱谱形的失真。
在相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）中，具有光谱学意义的信号出现在与激发光场波长不同的波长处。通过简单的光电倍增管或电荷耦合器件（CCD）相机即可对CARS信号进行时间积分，累加数千个脉冲以平均掉激光噪声。相比之下，受激拉曼散射（SRS）信号表现为嵌入在强且波动的激光背景中的微弱调制信号。由于该调制信号非常微弱，激光噪声很容易将其淹没，从而降低SRS显微镜的成像速度和灵敏度。因此，在成像之前，必须测量激光的相对强度噪声（RIN），以判断该激光器是否适用于高速SRS成像，并选择噪声最低的调制频率。RIN定义为激光噪声功率谱密度[δP(f)，单位为W2/Hz]除以平均光功率（<img alt="静力平衡图解，ΣFx=0，受力分析，矢量分解，物理教学工具。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2">）40,41。换句话说，RIN描述了激光在不同频率下的归一化波动情况（公式[4]）。
<img alt="相对强度噪声方程，RIN=10log₁₀(δP(f)/P̅²)[dB/Hz]，用于噪声分析的公式。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 7"> （4）
因此，RIN 是 SRS 系统的一个参数，用于确定实验中的理想调制频率范围。例如，图中的橄榄色条形 图8 显示了SRS成像的理想调制频率范围。对于窄带SRS，用户应测量泵浦光和斯托克斯光的相对强度噪声（RIN），以确定哪一束光需要进行调制，从而实现最佳性能。请注意自 图8例如，斯托克斯光束的相对强度噪声（RIN）略高于泵浦光束，这意味着受激拉曼增益（SRG）测量结果将比其受激拉曼损失（SRL） counterpart 更嘈杂。在宽带受激拉曼散射（SRS）情况下，应调制的光束是窄带光束.
光栅的角分散度 D 表示衍射角随波长的变化关系，定义为光栅方程的导数。对于利特罗构型，角分散度由公式（5）给出。
<img alt="色散方程 D=dβ/dλ=2/λtanβ；光谱分析的光学公式。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 8"> （5）
得到方程（5），我们假设 α = β，解方程（2）用于 m/d 并将结果插入 dβ/ dλ. 注意，在利特罗构型中，β = sin-1(mλ/2d在小角度近似下，沿光谱的位置变化为 fdβ ≈ dl (图10）。因此，通过插入 dβ 代入公式 (5），我们可以计算线性色散，这是一个具有单位的量 nm mm-1 使用公式 (6):
<img alt="光谱学静态平衡公式 dλ/dl=1/Df。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 9"> （6）
对于以利特罗构型工作的衍射光栅，其刻线密度为 1,851.85 条/毫米， d = 540 nm。如果我们使用光在约789 nm处的一级衍射， D = 0.0027 纳米 (nm)-1。使用一个 f = 750 mm 镜头，可获得约 0.5 的线性色散 nm mm-1，换算为约 7.8 cm-1毫米-1因此，透镜的焦距决定了“密度” 纳米米 每 毫米 在探测器平面：焦距越长，数量越少 纳米米 每 毫米 获得，从而增大宽带泵浦光谱线之间的间距。相反，使用较短焦距时，将会有更多 纳米米 每 毫米 在探测平面处，减小了色散泵浦光所占据的空间。
平衡检测可提高噪声较大系统的图像质量和灵敏度。例如，根据图8所示的相对强度噪声（RIN）谱，并结合典型的受激拉曼散射（SRS）信号幅度（1 × 10-5）进行分析，非平衡检测下的信噪比（SNR）约为60；而采用平衡检测（即接近散粒噪声极限）时，信噪比可达约145。图11展示了在平衡与非平衡条件下获得的光谱及复合图像。显然，平衡检测的效果直接影响实验的最终结果，即化学成像图。基于这些结果，我们强调，平衡检测是一种有效抑制激光强度波动对图像质量造成不利影响的强大技术。需要指出的是，平衡检测特别适用于噪声较大的激光器，例如光纤振荡器；而对于采用低噪声光源（如固体激光器）的SRS显微系统，则可能无需使用平衡检测。
该方案还介绍了一种基于非线性光学的方法，用于确定这些光束脉冲之间的时空重叠。我们描述了使用1的 advantagesst 而不是0th 将AOM的衍射级次作为调制的斯托克斯光束。此外，本文描述了色散对受激拉曼散射（SRS）产生效率的不利影响，并提出了通过棱镜压缩器减轻这些影响的方法。同时，该方案解释了如何对棱镜进行准直，并强调了实现最佳性能需考虑的三个关键方面。我们不仅讨论了相对强度噪声（RIN）在SRS显微成像中的重要性，还展示了如何使用锁相放大器测量RIN，并通过RIN谱确定最佳调制频率。通过具体实例，本文说明了光栅方程如何辅助设计检测光路。最后，该方案利用真实的SRS数据，展示了SRS超立方体的结构以及如何使用常规科学编程语言对其进行分析。
本方案存在三个次要局限性。首先，本研究中采用的检测方案包含一种非传统的多通道锁相检测器，该检测器由 Sciortino 等人自行设计并搭建26。如先前研究所证实25，该检测器可被市售的平衡光电二极管替代。尽管这一修改仅涉及检测器本身，对整体方案几乎不造成影响，但使用单个光电二极管时，需在检测器上逐个扫描各光谱成分，而无法同时测量所有成分。其次，本方案采用共线式平衡检测，这需要在光路中插入多个光学元件。这些光学元件增加了系统的复杂性，并导致光功率损失和脉冲展宽。
内联平衡检测还要求两束泵浦光副本均穿过样品，这种情况可能并不适合对光敏感的样品（如活细胞），或具有强双折射特性的样品（在这些样品中，两束泵浦光副本可能经历不同的光学性质，从而破坏平衡检测效果）。第三，该方案依赖于自制的光参量振荡器（OPO），而这种设备可能不易获得。然而，OPO提供的宽带光谱也有替代方案，例如来自非线性光学光纤或体块晶体的超连续谱。其中，后者仅能与低重复频率激光器（最高至5 MHz）配合使用。因此，如同所有实验设计一样，本方案也存在一些局限性。但这些局限性很小，并不会影响该方法的成功应用。
尽管本文描述的是参考样品，但该方案可成功解析细胞以及动物和植物组织中的化学物质，例如纤维素、脂类物质或蛋白质，在不同的生化研究中具有实际应用价值，也可作为组织病理学中的诊断工具。同样，该方案在材料科学领域也具有重要应用价值。例如，采用本方案可探究聚合物种类的分子组成和浓度42。此外，该方法可与其它非线性显微技术兼容，例如基于泵浦-探测43和外差CARS44的宽带显微技术，这些四波混频过程与SRS类似，均需要两束激发光和调制转移测量。最后，本文包含的部分信息也可应用于不依赖调制转移技术、但需要对准两束或多束脉冲激光的非线性成像技术，例如常规CARS45和SFG显微技术46。
综上所述，本方案介绍了一种基于宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术的强大方法，可从化学异质混合物中提取化学分布图及其特征SRS光谱，生成便于直接进行定量数据分析的数据集。该方法具有通用性和简便性，使感兴趣的读者能够将其适配于不同的非线性技术。

拉曼显微技术是一种强大的成像技术，通过测量拉曼散射来提供丰富的化学分布图。拉曼散射是一种非弹性辐射过程，源于分子在入射光作用下发生振动1。拉曼图谱中的每个像素都包含一个光谱，直接反映样品的化学组成和结构信息，从而生成具有本征振动对比度的图像。迄今为止，拉曼显微技术已成为分子振动微区光谱研究的参考标准，因为尚无其他成像技术能够同时实现高化学特异性和高空间分辨率的成像4。尽管其化学特异性极为出色，但拉曼散射的产生效率较低，因此需要较长的像素驻留时间或高功率激发，分别导致采集速度慢以及与敏感样品的兼容性差2,3。
拉曼显微技术的这一单一缺陷促使研究人员采用相干拉曼散射5,6,7,8,9作为显微成像的对比度来源。这是一种非线性光学过程，可将分子振动信号增强数个（最高达七个）数量级，从而实现高速化学成像10,11,12,13。其中，应用最为广泛的两种相干拉曼散射技术分别为相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）14和受激拉曼散射（SRS）15。与CARS不同，SRS信号对共振分子的浓度呈线性依赖关系。此外，SRS不受非共振背景的干扰——这种非线性效应与任何振动跃迁无关，但会扭曲分子振动拉曼光谱所特有的洛伦兹线型16,17。因此，SRS显微技术能够提供真实的拉曼信息，支持直接的定量图像分析。
受激拉曼散射（SRS）是一种三阶非线性光学过程，可直接提供样品中化学键的信息。该过程源于两个通常位于近红外光谱区域的光场在时空上的叠加，即泵浦光（频率为 ωpu）和斯托克斯光（频率为 ωS）10,11,18。这种叠加产生一个频率差为 Ω = ωpu - ωS 的拍频信号。当 Ω 与分子振动频率 ΩR 相匹配时，分子发生共振，导致光场与分子之间发生相干能量转移。结果，分子被激发至振动激发态。该过程可通过检测泵浦光子的减少（称为受激拉曼损耗 [SRL] 信号）或斯托克斯光子的同步增强（称为受激拉曼增益 [SRG]）来监测。SRG 和 SRL 均为微弱信号（ΔI），叠加在强而波动的背景光强（I）之上。由于典型的 SRS 信号强度（ΔI/I）在 10-6 至 10-4 范围内，激光噪声极易将其掩盖。为了减轻激光噪声对信噪比（SNR）以及成像速度的不利影响，SRS 检测依赖于在高调制频率（&#62;1 MHz）下采用调制传递技术（例如锁相放大器、谐振电路或盒式平均器），因为在这些频率处激光噪声达到最低水平15,19,20。
传统的受激拉曼散射（SRS）显微技术采用窄带（≈10 cm−1）的泵浦光和斯托克斯光脉冲，在单一振动频率下生成化学图像，可实现视频速率成像，像素驻留时间低至约 ≈100 ns21,22。然而，由于窄带SRS显微技术仅通过在少数几个振动频率上依次扫描样品来构建化学图谱，其信息量有限23。对于拉曼谱带重叠的化学物质，尤其在异质体系中，仅具有一种或两种振动对比度的SRS图像可能不足以实现有效区分。因此，典型的窄带SRS显微镜未能充分发挥SRS的全部潜力，因为仅考察少量振动频率会限制其化学特异性，并忽略了振动光谱中蕴含的丰富信息。此外，在不同频率下对样品进行顺序扫描会导致像素驻留时间延长，可能引发光损伤，并妨碍连续图像之间严格的空域共定位，从而产生运动伪影。
与窄带SRS显微技术不同，宽带SRS显微技术在每次样品扫描时可为每个像素获取一条振动光谱10,12,24。因此，宽带SRS能够实现超光谱成像，并对不同振动对比信号进行严格的空间共定位，从而支持严谨的数据分析。这种方法不仅可通过拉曼光谱揭示样品的化学成分，还有助于确定各成分的相对浓度。根据光谱采集方式的不同，宽带SRS显微技术可分为超光谱SRS和多路复用SRS两类。在超光谱SRS中，样品每个扫描点的SRS光谱是依次获取的（即通过扫描频率失谐量Ω实现），通过将连续拉曼位移下的SRS信号逐个叠加，构建出完整的SRS光谱。而在多路复用SRS中，多个振动模式的拉曼光谱可同时被测量。因此，多路复用SRS方法结合了一个调制的窄带脉冲和一个宽带脉冲，以在不同频率上激发SRS信号，并采用多通道探测器进行SRS光谱检测，其灵敏度可与窄带SRS相媲美。
本文介绍了一种利用多路复用受激拉曼散射（SRS）显微镜对异质样品进行化学成像的实验方案。本方案所采用的SRS显微镜结构如图1所示，其详细描述见其他文献25,26,27。简而言之，该宽带SRS显微镜由一台商用锁模Yb光纤激光器驱动，该激光器产生中心波长为1040 nm、脉宽140 fs的激光脉冲，平均功率为10 W，重复频率为80 MHz。一个偏振分束器（PBS）将基频光束分为两路。其中一路（4 W基频光）用于产生窄带斯托克斯脉冲，该光束被导入一个法布里-珀罗标准具，生成窄带宽（≈15 cm-1）光束，随后通过声光调制器（AOM）在1.6 MHz频率下进行调制。另一路剩余光束（6 W基频光）则通过一块2.8 mm厚的三硼酸锂（LBO）晶体（I类相位匹配，θ = 90°，φ = 13.8°）进行倍频。所产生的520 nm二次谐波进入一个X型折叠腔，用于泵浦一台光学参量振荡器（OPO），该装置采用一块3.0 mm厚的LBO晶体（I类相位匹配，θ = 90°，φ = 9.8°）作为增益介质，可输出波长在680–910 nm光谱范围内可调的宽带光辐射（图2）。这些宽带脉冲在SRS实验中作为泵浦光，随后进入棱镜压缩器，以预先补偿显微物镜引起的色散效应。
压缩阶段之后，一个半波片（λ/2波片）与一块YVO4双折射板结合，产生两个正交偏振的复制光束，它们在探测平面上的电子相减可消除宽带泵浦光的噪声。一个二向色镜将泵浦光和斯托克斯光束合并，并导入一台正置显微镜。数值孔径（NA）为1.27的水浸物镜将光聚焦到样品上，而数值孔径（NA）为1.4的油浸物镜负责收集信号光。在探测阶段之前，一个短通滤光片（SPF）去除被调制的斯托克斯光，而一块工作于利特罗构型的衍射光栅将透射的宽带泵浦光色散。第二个偏振分束器（PBS2）将泵浦光的复制光束分离，再由透镜将其聚焦到两个光电二极管阵列上。这两个光电二极管阵列输出的信号进行电子相减后，送入一个自制的多通道锁相放大器（M-LIA）。解调后的信号再通过其中一个光电二极管阵列的直流（DC）读数进行归一化，从而得到SRL光谱。
作为一个示范性实验，我们对多种已知的拉曼散射物质的混合物进行成像，每种物质都具有独特的拉曼光谱。因此，本实验方案首先描述如何制备参考样品。由于我们检测的是受激拉曼损失（SRL），接下来我们将解释如何获得窄带斯托克斯脉冲，并搭建用于提供宽带（≈250 cm-1）泵浦脉冲的光学光源，即自制的光参量振荡器（OPO）。本方案展示了光束的准直与优化过程，详细说明了关键参数，例如窄带斯托克斯光和宽带泵浦光的功率与光谱特性。本方案特别详细地描述了宽带泵浦光的光路，因其需要使用特殊的光学元件。此外，还解释了如何实现泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时空重叠，并展示了一种实用的方法来测定相对强度噪声（RIN），从而帮助确定SRS实验的最佳调制频率。随后，我们阐述检测链的工作原理及其校准方法。最后，本方案展示了数据采集过程、化学计量学分析以及图像处理流程。

<table><tbody><tr><td>采集目标</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon</td><td>油浸物镜</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>043211-KJ</td><td>石英显微镜盖玻片，25.4 × 25.4 × 0.15 mm</td></tr><tr><td>延迟线</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>M-406.6PD</td><td>精密微位移台，行程范围150 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>D8418-500ML</td><td>二甲基亚砜，分子生物学级DMSO，DMSO，甲基亚砜</td></tr><tr><td>标准具</td><td>SLS Optics Ltd</td><td>定制</td><td>在1,040 nm处具有抗反射涂层，安装于直径38 mm、长35.5 mm的不锈钢腔体中，带防尘盖，配有50 mm直径的&amp;lsquo;夹紧环&amp;rsquo;固定环</td></tr><tr><td>激发物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon</td><td>水浸物镜</td></tr><tr><td>光栅</td><td>LightSmyth</td><td>T-1850-800s 系列</td><td>高效率透射光栅 T-1850-800s 系列</td></tr><tr><td>激光器</td><td>Coherent</td><td>定制</td><td>Fidelity, HP</td></tr><tr><td>&amp;lambda;/2</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td>安装式超消色差半波片</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thorlabs</td><td>CM5-PBS203/M</td><td>16 mm笼式立方体安装偏振分光棱镜立方体</td></tr><tr><td>PMMA微球</td><td>Merck</td><td>MFCD00198073</td><td>基于聚甲基丙烯酸甲酯的微粒</td></tr><tr><td>棱镜</td><td>Crisel</td><td>320-8218</td><td>SF11材质激光色散棱镜</td></tr><tr><td>PS微球</td><td>Merck</td><td>72986-10ML-F</td><td>基于聚苯乙烯的微粒</td></tr><tr><td>YVO4晶体</td><td>Dr. Sztatecsny GmbH</td><td>定制</td><td>&amp;nbsp;厚度8 mm，直径1.00 cm，适用于1&quot;安装座，涂层适用于850–1,100 nm波段</td></tr></tbody></table>

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种用于无标记化学成像的非线性光学技术。该分析工具通过直接探测样品的分子振动，能够对薄样品实现高速、高空间分辨率的化学图谱成像。在标准实现方式中，SRS显微技术是窄带的，每次仅能利用单一振动频率生成图像。然而，这种方法不仅限制了SRS的化学特异性，也忽略了振动光谱中所蕴含的丰富信息。
这些局限性可通过宽带受激拉曼散射（SRS）得以克服，该技术能够并行地提取图像中每个像素点的振动光谱。由此获得的高光谱数据，结合化学计量学分析，可最大化从样本中获取的信息量。因此，宽带SRS提高了系统的化学特异性，实现了对样品中各组分浓度的定量测定。本文报道了一种基于自制SRS显微镜并结合定制的多通道差分锁相放大检测系统的宽带SRS化学成像实验方案。该方案涵盖了样品制备、SRS装置的光路准直以及化学计量学分析等内容。通过采集振动拉曼光谱，本方案演示了如何在混合物中识别不同的化学物质，并确定其相对浓度。

图3展示了使用本方案在PS、PMMA和橄榄油中获得的典型结果。旋转LBO1会改变SHG场经历的折射率，从而直接调节其相速度。当SHG场的相速度与LBO1中诱导的非线性极化相速度相匹配时，非线性产生的场与非线性极化将同相，从而产生强烈的SHG辐射。换句话说，调节LBO1的φ角可使用户实现SHG的最佳相位匹配条件。由于此处使用的是I型相位匹配晶体，SHG光束的偏振方向将与基频光束的偏振方向正交（图5B）。
图8展示了本实验方案所用光学光源的相对强度噪声（RIN）以及散粒噪声极限，后者源于电子和光子的量子特性，构成了激光噪声的基本极限。散粒噪声极限下的RIN通过<img alt="电磁信号分析，dB/Hz方程，频谱图。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程5">计算，如公式（3）所示。
<img alt="激光系统噪声分析方程，公式：RIN_shot = 10log₁₀(2hv/P̅)，光学概念。" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 6"> （3）
其中 h 为普朗克常数，ν 为光频率。因此，散粒噪声为电子器件设计提供了有用的指导依据。
图11A 和 图11C 展示了平衡与非平衡光谱的典型数据。显然，平衡检测的效果会影响实验的最终结果，即化学分布图。图11B 和 图11D 分别展示了在非平衡和平衡条件下的复合图像。成功实施所述方案将有助于识别和定位异质样品中不同化学组分，并提取其特征SRS光谱。对图12中的高光谱数据进行化学计量学分析后得到 图13。图13A 显示了样品中不同化学组分的浓度分布图的复合图像，而 图13B 显示了它们的特征SRS光谱。请注意，图13A 中所示数据不仅使用户能够轻松识别样品中的不同组分，还可进行更定量的分析。例如，利用浓度分布图，我们可以计算每种化学物质的平均分数浓度：38% DMSO、25% PMMA、14% PS 和 22% 橄榄油。
<img alt="超快光谱示意图：用于光学激发和发射分析的光纤激光器装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：本方案中所采用的宽带受激拉曼散射（SRS）显微镜示意图。 缩写：PBSx = 偏振分束器；SHG = 二次谐波产生模块；OPO = 光学参量振荡器；AOM = 声光调制器；SPF = 短通滤波器；M-LIA = 多通道锁相放大器；DM = 二向色镜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱分析图，可调谐泵浦光和斯托克斯光，强度与波长关系，拉曼光谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：可调谐宽带泵浦光束（蓝色）和窄带斯托克斯光束（红色）的光谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胶体分散体系显微图像；标注 PS、PMMA、DMSO、油；颗粒聚集分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：化学异质性样品的明场显微图像。 请注意，常规显微镜无法区分不同的组分。比例尺 = 100 µm。缩写：PS = 聚苯乙烯；PMMA = 聚甲基丙烯酸甲酯；DMSO = 二甲基亚砜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="瞬态吸收光谱图及用于光学激发测量分析的声光调制器装置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4窄带斯托克斯脉冲的调控 (A透明的蓝色轨迹显示了0th 衍射光束，而黑色的表示相应的1st 顺序。B光学装置用于优化1的调制效率st 一阶衍射光束以及斯托克斯光束在到达激发物镜前的光斑尺寸精细调节。缩写：AOM = 声光调制器；fx = 透镜 X 的焦距 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="非线性光学中的二次谐波产生（SHG）和差频产生（DFG）示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：驱动OPO所需的非线性光学过程。（A）SHG相互作用的几何构型。两个频率为ω1的基本光子将材料系统激发至高能虚拟能级，随后材料系统跃迁回基态，发射出一个频率为ωSHG的光子。（B）SHG实验示意图。（C）SHG与OPO装置的示意图。（D）DFG相互作用的几何构型。一个ωSHG光子被分裂为信号光（ωSignal）和闲频光（ωIdler）光子。通过将信号光子反馈并使其在谐振腔内共振，从而实现信号光束的增益。（E）DFG实验示意图。缩写：SMx = 球面反射镜（R = 75 mm）；OPO = 光学参量振荡器；SHG = 二次谐波产生模块；DFG = 差频产生；LBO = 偏硼酸锂；OC = 油浸物镜；DM = 二向色镜；fx = 透镜X的焦距。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="棱镜色散图、角度测量、光路设置、光束偏转分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：棱镜压缩器的几何结构。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="和频生成；用于光激发和数据分析的和频生成图谱及光谱装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：利用和频生成优化时空重叠。（A）泵浦光与斯托克斯光及其各自的二次谐波生成（SHG）在屏幕上产生的和频信号。此处，透镜将泵浦光和斯托克斯光聚焦到晶体上，同时使用低通滤光片将其滤除。（B）泵浦光与斯托克斯光之间和频信号强度随时间延迟的变化关系。将受激拉曼散射（SRS）系统的零时间点设定在和频信号最强的位置。B图中交叉相关曲线的不对称性是由斯托克斯光束中法布里-珀罗标准具引起的时域轮廓所致。缩写：SFG = 和频生成（sum-frequency generation）；SHG = 二次谐波生成模块（second harmonic generation module）；SRS = 受激拉曼散射光谱（stimulated Raman scattering spectroscopy）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斯托克斯拉曼散射噪声分析图；相对强度噪声 dB/Hz 与频率、SRS 带宽、物理研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 8"> 
图 8：相对强度噪声（RIN）谱。 绿色高亮的频带显示了进行受激拉曼散射（SRS）实验的最佳光谱区域。在此频带内的任意频率对斯托克斯光束进行调制，均可确保激光噪声对 SRS 信号的影响降至最低。缩写：RIN = 相对强度噪声；SRS = 受激拉曼散射光谱法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光学激发模式，示意图显示泵浦光、斯托克斯光以及泵浦光+斯托克斯光的激光相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9：光束轮廓。（A）泵浦光，（B）斯托克斯光，以及（C）泵浦光与斯托克斯光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱学示意图，线性探测器设置，角度 β，焦距 f，物理研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图10"> 
图10：色散光栅与光电二极管阵列探测器的假设几何结构。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="非平衡与平衡波数SRS数据的光谱分析图和显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig11.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图11"> 
图11．平衡检测的影响。 对光谱（A, C）和化学图像（B, D）的影响。图中（B）和（D）所示的复合图像为实验的最终结果（即高光谱数据经化学计量分析后所得结果，详见方案第4部分）。比例尺 = 10 µm。缩写：SRS = 受激拉曼散射光谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D光谱成像示意图，波数峰值分析，显微成像数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig12.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图12"> 
图12：通过宽带受激拉曼散射显微镜获取的代表性SRS超立方体数据。 x-y平面存储了扫描位置的坐标，而沿z方向的每个向量记录了一条SRS光谱。缩写：SRS = 受激拉曼散射光谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜与光谱数据；光学分析，图表显示在不同波长下的光谱拟合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig13.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图13"> 
图13：高光谱受激拉曼散射（SRS）数据的化学计量分析。 （A）样品中不同组分浓度图的叠加图像。（B）各化学物质的特征光谱。两个图中，黄色代表橄榄油，蓝色代表DMSO，青色代表PS，橙色代表PMMA。比例尺 = 20 µm（A）。缩写：SRS = 受激拉曼散射光谱法；PS = 聚苯乙烯；PMMA = 聚甲基丙烯酸甲酯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种用于无标记化学成像的非线性光学技术。该分析工具可提供化学分布图……

本方案描述了如何构建受激拉曼散射显微镜，该技术能够在微秒时间内测量分子的振动光谱。当应用于成像时，可实现高光谱显微成像，以无标记、非侵入的方式对物质的化学组分进行定位与定量。该方案主要应用于生物与生物医学科学领域的多个方面。例如，用于成像细胞或组织。我们的方法面临两个重要挑战：宽带光学光源和探测链。针对前者，可以购买OPR，也可以自行搭建。或者，可以使用在体相晶体或非线性光学纤维中产生的白光超连续谱。后一种挑战可通过商用光电二极管与检流计扫描仪依次扫描每个光谱组分来解决。首先，从聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微珠的水悬浮液中提取两微升，将该悬浮液滴加到显微镜盖玻片上。然后，从聚苯乙烯微珠的水悬浮液中提取两微升，并将其与盖玻片上的PMMA悬浮液混合。用移液枪枪头轻轻混匀悬浮液，静置干燥24小时。当水分蒸发后，盖玻片表面将出现一层白色珠状物。在盖玻片上加入20 µL二甲基亚砜和20 µL纯橄榄油。在第二片显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油。将盖玻片放置在混合物上，指甲油面朝下，并施加足够的压力以密封。静置使其干燥。为了优化窄带斯托克斯光束的调制效率，调节透镜 F1 与 F2 之间的距离，并使用光电二极管测量已调制的光束，然后用示波器记录其波形。调节光学参量振荡器的腔长，使得所产生的宽带泵浦光谱与1040纳米的窄带斯托克斯光结合后，能够产生2,800至3,100 cm⁻¹范围内的频率失谐。该光谱范围覆盖了CH伸缩振动区域。将宽带泵浦光送入棱镜压缩器，以补偿激发显微物镜引入的色散效应。将泵浦光引入棱镜A，通过其顶点，并将色散后的泵浦光导向棱镜B的顶点。确定所需的负色散量，并相应设置两棱镜顶点之间的距离。使用布儒斯特角切割的棱镜，并确保泵浦光束的偏振方向位于棱镜的三角平面内。为了优化共线平衡探测方案，将该双折射晶体的快轴设置为垂直方向，并将偏振泵浦光引导至一块长度为13.3毫米的YV04晶体板。然后，使用半波片将泵浦光束的偏振方向调整为45度。利用二向色镜将泵浦光束和斯托克斯光束合并，并使用一对荧光针孔仔细对准。确保两束光共线传播。衰减光束并将其引导至快速光电二极管上，使其在时间上重叠。随后移除光电二极管。接着，使用校准过的相机测量光束轮廓，并借助红外观察卡通过目视估测光束直径。使用两个望远镜，一个用于泵浦光束，另一个用于斯托克斯光束，并尽量使光束直径与激发物镜的后光阑相匹配。一旦获得受激拉曼散射（SRS）信号，即可通过调节泵浦光束上的望远镜来微调其光束直径，从而改变其瑞利长度，进而调节显微镜焦点处的相互作用体积。当达到最大SRS时停止。使用光电二极管测量泵浦光束的强度，并结合光电二极管的响应度，计算照射到探测器有效区域的平均功率。为测量激光器的相对强度噪声，断开低通滤波器，将宽带宽光电二极管的输出连接至锁相放大器的输入端。在不同解调频率下，以伏特每赫兹的平方根为单位存储锁相放大器的输出，并利用光电二极管的响应度将伏特转换为瓦特。将泵浦光束和斯托克斯光束引导至显微镜。放置样品并找到无微珠的区域，以辅助对准泵浦光束。然后，使激发和收集物镜共焦。放置一个短通滤光片以去除调制的斯托克斯光，并将泵浦光束引导至分光元件。在分光元件后放置一个透镜，将色散后的光束聚焦到探测器上。为了实现平衡探测，测量沿泵浦光束传播的参考光和信号副本的光谱。在光栅与偏振分束器之间放置一个窄缝或光阑，以确保两个光电二极管阵列之间的光谱匹配，并在空间上滤除色散的泵浦光。裁剪掉泵浦副本中除一个光谱成分以外的所有成分，使透射光线在参考和信号光电二极管阵列的第 N 个探测器上居中。使用转向镜调节不同检测通道之间的相关性。启动受激拉曼散射（SRS）显微成像：调制斯托克斯光，对样品进行光栅扫描，并在泵浦光谱上获取相应的调制转移信号及其对应的直流（DC）光谱，从而得到每个像素的归一化SRS光谱。生成三维矩阵，其行和列包含样品的扫描位置。在每个垂直于 XY 平面的向量上存储一个 SRS 光谱。绘制浓度和光谱轮廓，以获得样品化学成分的化学图像和特征光谱。代表性图像显示了本实验方案所用光学光源的相对强度噪声光谱。此处显示的是SRS实验的最佳光谱区域。在此波段内的任意频率下调制斯托克斯光束，可确保激光噪声对SRS信号的影响降至最低。此处展示了非平衡与平衡光谱的典型数据。平衡检测的效果会影响实验的最终结果，即化学图谱。此处展示了非平衡和平衡条件下的复合图像。代表性图像展示了高光谱受激拉曼散射（SRS）数据的化学计量分析结果。图中显示了样品中不同化学组分的浓度分布图及其特征性的SRS光谱。根据该数据，可轻松识别出样品中的不同组分，例如橄榄油、二甲基亚砜（DMSO）、聚苯乙烯以及聚甲基丙烯酸甲酯。目前，我们的技术仅能探测CH振动的伸缩模式。然而，通过优化光学光源，相同的检测系统将使我们能够同时检测多种模式，从而探索信息更丰富的指纹区。我们的检测系统为宽带受激拉曼散射（SRS）技术在临床中的整合铺平了道路，引入了一项可补充并增强传统组织病理学诊断流程的新技术。

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受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。...

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

基于电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）的彩虹样拉曼染料成像，是一种用于高重数基于表位的蛋白质成像的新平台。本文中，我们提供了一份实用指南，包括抗体准备、组织样本染色、SRS显微镜组装以及epr-SRS组织成像。...

使用拉曼染料进行高重组织成像

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS...

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23...

一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

学习宽带受激拉曼散射显微镜技术，实现无标记、非侵入式化学成像。该方法可快速测量分子振动光谱，用于细胞和组织的化学成分定位与定量分析，在神经科学和生物医学研究中具有重要应用价值。

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

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