使用突变蛋氨酸tRNA合成酶小鼠系从复杂组织中纯化和鉴定细胞类型特异性蛋白

该协议使得以细胞类型特异性方式标记蛋白质成为可能。这是提供这种可能性的第一种技术，可以在体外或体内完成。该技术的主要优点是标记的细胞类型特异性蛋白质可以在未鉴定的情况下纯化，或者通过免疫荧光原位可视化。

通过以组织湿重的12至15倍的体积加入裂解缓冲液开始制备组织裂解物，并对组织进行研磨直至其均质化。将该匀浆加热15分钟至75摄氏度以使蛋白质变性，然后离心样品并将上清液转移到新管中。该样品可以在零下80摄氏度下储存。

接下来，对于烷基化，将匀浆样品在含有不含EDTA的蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中稀释两到三次。然后加入新鲜制备的碘乙酰胺至终浓度为20毫摩尔。将样品在20摄氏度的黑暗中放置一到两个小时。

重复碘乙酰胺添加和孵育步骤两次。按照制造商的说明，首先涡旋色谱柱，准备色谱柱。然后取下盖子切割底部并离心它们。

接下来，首先使用点击化学交换缓冲液平衡缓冲液交换柱，然后更换所有烷基化样品，从而进行缓冲液交换。为了评估叠氮体亮氨酸掺入，取40微升暗示的样品，并加入磷酸盐水缓冲液至最终体积为120微升。然后通过涡旋反应20秒来设置点击化学反应。

按照指示的顺序尽快加入每种试剂后，将样品在黑暗中以 4 摄氏度连续旋转孵育过夜。第二天，离心后以17， 000倍G离心样品五分钟，可以看到略带绿松石的颗粒。将上清液转移到新管中，并将样品储存在零下80摄氏度。

用于标记蛋白纯化。将所有样品置于缓冲液交换程序中，如使用中性粒素结合缓冲液作为平衡缓冲液清洁游离炔烃残留物所示。然后通过将磁珠与结合缓冲液混合来洗涤中性粒素高容量磁珠三次。

离心混合物，弃去上清液并重复三次。然后通过加入相同体积的中性粒蛋白干珠和中性粒素结合缓冲液来制备一对一的浆液。留出20至40微升的每个样品作为预纯化的裂解物，并将其储存在零下20摄氏度。

测量样品的蛋白质浓度后，将1毫克蛋白质与40微升珠浆液混合。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜，并连续旋转，使标记的蛋白质与磁珠结合。第二天通过离心收集上清液。

将 20 至 40 微升等分试样的上清液放在一边以供以后分析，并将其余液冷冻在零下 80 摄氏度。接下来，通过加入冰镇的中性粒素洗涤缓冲液一来洗涤珠子三次。沉淀珠子并丢弃上清液。

然后加入相同的缓冲液，并将珠子在4摄氏度下连续旋转孵育10分钟，然后弃去上清液。用中性粒细胞素洗涤缓冲液二和三重复洗涤，并通过在20摄氏度下将磁珠与一定体积的中性粒蛋白洗脱缓冲液孵育30分钟来洗脱点击的蛋白质，对应于所用干珠的一体积。在洗脱过程中，将磁珠悬浮在热块摇床中每分钟1000转，躲避两次，并合并两种洗脱液。

点击反应通过SDS页和蛋白质免疫印迹进行分析。显示了通过腹膜内注射给予叠氮白氨酸和通过饮用水给予叠氮柳氨酸的实验的代表性图像。进一步的实验为确定最佳二硫化物生物素可裂解炔烃浓度提供了示例。

在本例中，标记样品和对照之间的倍数变化在14微摩尔炔烃浓度下最高。此处显示了与对照相比，叠氮白氨酸标记样品中明显富集的质谱结果示例。这种差异在总蛋白染色中已经可见。

除了肽强度的变化外，在两个样品中还发现了独特的蛋白质。这是一个技术复杂的方案，必须使用适当的阴性对照烷基化，适当（模糊）和充分清洁非点击存档来仔细遵循这一步骤。我们在这个协议中的关键步骤，纯化的蛋白质可以通过质谱法鉴定，如果研究人员有兴趣研究蛋白质，或者将其加载到凝胶中，用于通过蛋白质印迹研究感兴趣的蛋白质。

这种方法标记来自特定细胞来源的蛋白质的能力有很多应用，例如蛋白质的张力或体外或体内蛋白质合成的研究。