Name: 使用突变蛋氨酸tRNA合成酶小鼠系从复杂组织中纯化和鉴定细胞类型特异性蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解利用突变蛋氨酸tRNA合成酶小鼠模型进行细胞类型特异性蛋白标记、纯化与鉴定的方法。该技术通过叠氮正亮氨酸实现体内外蛋白质标记，结合点击化学与质谱分析，为神经科学与细胞生物学研究提供重要工具。

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B.A-C 由西班牙科学与创新部（Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I）、马德里自治区（Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057）以及 MICINN（PID2020-113270RA-I00）资助项目提供经费支持。R. A-P 由马德里自治区（Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057）提供经费支持。E.M.S. 由马克斯·普朗克学会、欧洲研究理事会高级研究者奖（资助号 743216）、德国研究基金会 CRC 1080：神经稳态的分子与细胞机制，以及德国研究基金会 CRC 902：基于 RNA 的调控分子原理项目提供经费支持。我们感谢 D.C Dieterich 和 P. Landgraf 提供的技术建议以及 DST-Alkyne 的合成。我们感谢 E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast 以及马克斯·普朗克脑研究所动物设施提供的出色支持。我们感谢 Sandra Goebbels 分享 Nex-Cre 小鼠品系。我们感谢 Antonio G. Carroggio 在英文语言润色方面的帮助。B.A-C 负责实验的设计、实施与数据分析。B.N-A、D.O.C、R.A-P、C. E. 和 S. t. D. 参与了实验的实施与数据分析。B.A-C 和 E.M.S. 负责实验设计并监督项目进展，B.A-C 撰写了论文。所有作者均参与了论文的修改。

所有涉及动物的实验均获得德国当地政府部门（RP Darmstadt；方案编号：V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012）或西班牙（马德里康普顿斯大学动物实验委员会及马德里自治区环境咨询部门，方案编号：PROEX 005.0/21）的许可，并符合马克斯·普朗克学会的规定、西班牙法规以及欧盟关于动物福利的指导方针。
1. 在体 使用 ANL 进行代谢标记
<ol>
	<li>饮用水：
	<ol>
		<li>将ANL和麦芽糖溶解于小鼠的常规饮用水中。推荐的麦芽糖浓度为0.7%（wt/vol）。添加到饮用水中的ANL最大量为1%（wt/vol）。混合液配制完成后，通过过滤灭菌，并在4 °C下保存。</li>
		<li>将步骤1.1中配制的混合液提供给小鼠。频繁更换瓶子（例如每3天一次），以避免污染，并每天检查是否存在可能的污染或堵塞。通过称重每日饮水量，监测小鼠的饮水量，从而了解其ANL摄入量。 
		注：本研究中评估的最长标记时间为3周，使用1% ANL浓度的饮用水，可在脑组织中实现良好可检测的标记。2周时间也可获得良好的标记效果。我们未使用该给药方法研究更短的标记时间、更长的时间点或其他ANL剂量，但这并不意味着这些条件无效。ANL的掺入率可能因所研究的组织或细胞类型而异。标记时间应根据科学问题而定；例如，若目标是标记蛋白质组，则标记时间应根据所研究组织中蛋白质的平均半衰期来计算。如果仅需鉴定新合成的蛋白质，标记时间可相应缩短。每种实验条件和目标细胞类型下的标记周期与ANL剂量均需通过实验进行优化验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔注射给药：
	<ol>
		<li>将ANL溶解于生理氯化钠溶液（NaCl）、磷酸盐缓冲液（PBS）或水中，终浓度为400 mM。</li>
		<li>确保溶液的渗透压处于生理范围内。本实验中，以10 mL/kg体重的剂量向小鼠注射ANL溶液。 
		&#8203;注：通过每日一次腹腔注射（IP）400 mM ANL，持续1周，可成功实现脑内兴奋性神经元的良好标记。本研究未测试更低的ANL浓度或其他腹腔注射标记周期，但这并不意味着这些条件无效。某些公司提供的ANL为盐酸盐形式，在此情况下，必须将溶液pH调节至适当范围（取决于给药途径）。ANL也可根据Link等11发表的方法并结合一些改进5进行合成。ANL标记可采用不同的ANL浓度、时间跨度和给药途径进行。对于代谢率较低的组织/细胞类型，可使用低甲硫氨酸饮食，且应在ANL给药前至少1周开始该饮食。当使用400 mM ANL时，其在4 °C储存过程中可能发生沉淀；加热至37 °C可使其重新溶解。注射前应使其恢复至室温。在世界大多数地区，向小鼠给予ANL属于动物实验，需经相关主管部门批准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织收获、裂解和蛋白质提取
<ol>
	<li>组织解剖：解剖含有目标细胞类型的组织区域，并记录所收集组织的重量。 
	注意：样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。在本方案中，解剖了小鼠的大脑皮层和海马组织。</li>
	<li>组织裂解：在室温下，向组织中加入裂解缓冲液，其体积为组织湿重的12-15倍（PBS pH 7.4，1% wt/vol SDS，1% (vol/vol) Triton X-100，Benzonase（1:1000 vol/vol），蛋白酶抑制剂（PI）（无EDTA，1:4000））。例如，对于20 mg的组织，加入240–300 μL裂解缓冲液。反复吹打直至组织完全匀浆。 
	注意：样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。若直接在1.5 mL离心管中进行匀浆，建议使用手持式电池驱动匀浆器，尤其适用于处理小块组织。对于较大组织块，可使用Dounce匀浆器。所有含蛋白酶抑制剂（PI）的缓冲液均应在使用前立即加入，不得提前添加。</li>
	<li>蛋白质变性：将匀浆液在75 °C加热15分钟，然后在10 °C下以17,000 × g离心15分钟。将上清液转移至新管中。</li>
	<li>蛋白质含量测定：测定各样品的蛋白浓度，并将所有待比较样品调整至相同蛋白浓度；通过添加裂解缓冲液调节浓度。最佳浓度范围为2–4 μg/μL。 
	注意：样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。</li>
	<li>烷基化
	<ol>
		<li>用PBS（pH 7.8）+ PI（无EDTA，1:4000）将匀浆样品稀释2–3倍。</li>
		<li>加入碘乙酰胺（IAA），使其终浓度为20 mM（储存液500 mM）。</li>
		<li>将样品置于20 °C避光孵育1–2小时。重复步骤2.5.2–2.5.3两次。 
		注意：对于某些组织，若阴性对照中的非特异性点击信号仍较高，可能需要在烷基化前进行还原步骤12。IAA储存液应在加入样品前新鲜配制。样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓冲液置换：使用点击化学缓冲液（PBS pH 7.8，0.04% (wt/vol) SDS，0.08% (vol/vol) Triton X-100 和 PI（1:4000））平衡缓冲液置换柱，并按照制造商说明操作。对所有烷基化后的样品进行缓冲液置换。 
	注意：洗脱后的样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。此步骤可去除IAA，并将缓冲液置换为点击化学反应缓冲液。缓冲液置换后可再次测定蛋白浓度，以确认蛋白未在置换过程中丢失。根据所用置换柱类型的不同，蛋白可能大量损失。建议使用推荐的柱子以避免蛋白损失。对于样品储存，建议分装保存。</li>
	<li>点击反应以评估实验中ANL的掺入情况
	<ol>
		<li>取步骤2.6中洗脱的样品40 μL，加入PBS（pH 7.8）至终体积120 µL。</li>
		<li>按以下顺序加入试剂以建立点击化学反应，每次加入后涡旋20秒：1.5 µL三唑配体（储存液40 mM）、1.5 µL生物素炔烃（储存液5 mM）和1 µL Cu(I)溴化物（储存液10 mg/mL，通过轻柔吹打溶解于DMSO中，切勿涡旋）。应尽快加入试剂。</li>
		<li>将样品在4 °C避光条件下持续旋转孵育过夜。</li>
		<li>在4 °C下以17,000 × g离心5分钟。可见轻微蓝绿色沉淀。将上清液转移至新管中。 
		注意：Cu(I)溴化物储存液应在使用前立即配制，以防铜氧化。保持裂解样品与PBS之间的体积比恒定，对确保各管中最终去垢剂浓度一致至关重要。为加快点击化学反应体系的建立，建议使用带管架的台式涡旋仪。点击反应后的样品可在 -80 °C 下保存数月，或在 -20 °C 下保存数周，直至后续处理（暂停点）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blot分析以评估实验中ANL的掺入情况
	<ol>
		<li>取点击化学反应后的上清液20–40 μL进行SDS-PAGE电泳。使用12%丙烯酰胺凝胶，在含1% SDS、250 mM Tris-HCl、2 mM甘氨酸的电泳缓冲液中运行，直至前沿移出凝胶。</li>
		<li>将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜13。</li>
		<li>用GFP抗体（1:500，GFP蛋白与MetRS*5共翻译）和生物素抗体（1:1000，用于检测与生物素偶联的点击炔烃）在4 °C孵育膜过夜。</li>
		<li>用缓冲液洗涤一次抗体两次，每次10分钟，然后加入二抗孵育1.5小时。</li>
		<li>洗涤二抗两次，每次10分钟，若使用荧光标记抗体则进行扫描，若使用辣根过氧化物酶标记抗体则进行胶片曝光。</li>
		<li>使用ImageJ或类似软件对生物素信号进行定量，评估实验中各样品的整体标记情况，并识别可能的异常值。评估实验的信噪比（ANL样品标记信号与阴性对照背景信号之比），识别未能摄取或掺入ANL的动物个体。 
		注意：对于ANL掺入较高的样品，理论上可使用不可切割炔烃（如本节用于评估ANL掺入的炔烃）进行蛋白质纯化。但在使用脑组织样品时，通过不可切割炔烃纯化蛋白后经质谱检测发现阴性对照背景过高14。因此，仅使用更易操作的不可切割炔烃进行初步的样品和实验整体评估。无论计划用于蛋白纯化的炔烃类型如何，均建议执行下节所述的炔烃剂量优化步骤（步骤2.9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可切割炔烃剂量优化的点击反应
	<ol>
		<li>准备四支试管，每管加入40 μL代表性样品（来自步骤2.6，并已在步骤2.8中评估），再加入PBS（pH 7.8）至终体积120 μL。</li>
		<li>按照步骤2.7所述建立点击化学反应，但此次加入四种不同量的DST-炔烃。建议测试5 μM、15 μM、30 μM和60 μM四个浓度。</li>
		<li>重复步骤2.8，根据最高标记效率和最低背景信号，确定最适合当前实验问题的炔烃剂量。 
		注意：在对剩余样品进行点击反应前，必须确定任何炔烃的最佳用量。市面上有多种可选的炔烃产品，其切割方式不同（如光解或还原剂切割）。也可采用无铜点击化学反应（使用张力促进试剂，如DBCO试剂）。炔烃或DBCO试剂用量的微小变化常会显著增加阴性对照的背景信号。本文描述的是使用含二硫键、可通过还原剂切割的炔烃（二硫键生物素炔烃或DST-炔烃15）进行蛋白纯化的方法。使用DST-炔烃时，在进行SDS-PAGE（步骤8.1）时应避免使用含强还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）的上样缓冲液，以防炔烃提前断裂。本研究中，在上样缓冲液中加入5 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM），72 °C加热5分钟，不会影响DST-炔烃的稳定性。步骤2.9.2可重复进行，在表现最佳的剂量范围内测试更精细的梯度浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于蛋白纯化的制备型点击反应
	<ol>
		<li>将步骤2.6获得的所有样品，使用步骤2.9确定的最佳炔烃剂量进行点击反应，并取部分样品通过SDS-PAGE和Western blot（步骤2.8）进行分析。 
		&#8203;注意：确保移液器经过准确校准，以保证样品放大过程的精确性。点击反应后的样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>缓冲液置换
	<ol>
		<li>将所有点击反应后的样品进行缓冲液置换操作，具体步骤如2.6所述，但使用中性亲和素结合缓冲液作为平衡缓冲液（PBS pH 7.4，0.15% (wt/vol) SDS，1% (vol/vol) Triton X-100 和蛋白酶抑制剂 PI (1:2000)）。 
		注意：洗脱样品可在 -80 °C 下保存数月（暂停点）。此步骤可去除未发生点击反应的游离炔基，并将缓冲液置换为中性亲和素结合缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与中性亲和素磁珠结合
	<ol>
		<li>用中性亲和素结合缓冲液洗涤高容量中性亲和素磁珠（见步骤3.1）；将磁珠与缓冲液混合后，在3000 x g 条件下离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤三次。</li>
		<li>通过加入等体积的干燥磁珠和中性亲和素结合缓冲液，制备1:1的磁珠悬液。</li>
		<li>每份样品保留20–40 μL作为纯化前裂解液，于-20 °C保存备用。</li>
		<li>测定蛋白浓度（见步骤2.4），取100 μg蛋白与步骤3.2.2中获得的4 μL磁珠悬液混合。</li>
		<li>在4 °C下持续旋转孵育过夜，使标记的蛋白质与磁珠结合。 
		注意：与点击化学反应类似，步骤3.2.4中所述的基础亲和纯化反应可按比例放大。例如，在纯化海马区兴奋性神经元蛋白时，可将1 mg蛋白裂解液与40 μL中性亲和素磁珠（1:1悬液）混合。中性亲和素磁珠的用量可根据每毫克总蛋白中标记蛋白的量进行调整，该量取决于所选细胞类型和标记时间，需通过实验经验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中性亲和素磁珠洗涤与蛋白洗脱
	<ol>
		<li>通过离心收集上清液（见步骤3.2.1）。每份上清液保留20–40 μL用于后续分析，其余部分于-80 °C冷冻保存。</li>
		<li>加入预冷的中性亲和素洗涤缓冲液1（PBS pH 7.4，0.2% (wt/vol) SDS，1% (vol/vol) Triton X-100 和 PI (1:2000)），混匀后沉淀磁珠并弃去上清液。重复该步骤三次。</li>
		<li>随后加入相同缓冲液，在4 °C下持续旋转孵育10分钟，然后弃去上清液。重复该步骤三次。</li>
		<li>按照步骤3.3.2–3.3.3所述方法洗涤磁珠，但使用中性亲和素洗涤缓冲液2（1x PBS，pH 7.4，PI 1:2000）。</li>
		<li>按照步骤3.3.2–3.3.3所述方法洗涤磁珠，但使用中性亲和素洗涤缓冲液3（50 mM 碳酸氢铵，PI 1:2000）。</li>
		<li>加入与所用干燥磁珠体积相等的中性亲和素洗脱缓冲液（5% (vol/vol) β-巯基乙醇和0.03% (wt/vol) SDS），在20 °C孵育30分钟以洗脱点击反应后的蛋白。</li>
		<li>在洗脱过程中，使用恒温振荡器持续震荡（1000 rpm）以保持磁珠悬浮状态。洗脱两次，并合并两次洗脱液。 
		注意：如步骤3.2.1所述，用于分离磁珠悬液固相（磁珠）与液相（上清液）的离心条件适用于步骤3.3.1–3.3.7。若蛋白洗脱不完全，可适当增加SDS浓度；但当SDS浓度超过0.08%–0.1%时，非特异性结合于磁珠的蛋白也可能被洗脱。β-巯基乙醇具有挥发性和毒性，建议在步骤3.3.6–3.3.7中于通风橱内操作。步骤3.2.3和3.3.1中收集的样品应通过SDS-PAGE电泳并进行Western blot检测（见步骤2.8），以评估亲和纯化效率（步骤3.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱蛋白的评估
	<ol>
		<li>取洗脱样品的1/3上样至SDS-PAGE凝胶（见步骤2.8.1）。</li>
		<li>使用高灵敏度染色方法（如银染或荧光染色）对凝胶进行染色以观察蛋白条带。</li>
		<li>若样品质量符合预期，即叠氮亮氨酸（ANL）标记样品中的蛋白量较阴性对照高出3–4倍，则可通过常规质谱方法（如参考文献5所述）对洗脱蛋白进行鉴定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+synaptic+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+protein+synthesis%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li>
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<li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li>
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<li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li>
<li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377(2016).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioID%3A+A+screen+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

该实验方案的关键要点包括：设置阴性对照、具备足够的生物学重复、ANL的给药途径、剂量和持续时间、样品的烷基化处理、炔烃的浓度，以及在使用DST-炔烃时去除β-巯基乙醇。
关键是要包含来自未携带Cre驱动且因此不表达MetRS*的ANL标记动物的阴性对照样本。这些样本必须与来自ANL标记的Cre诱导MetRS*小鼠的样本平行地经历本方案中描述的每一步操作。未进行点击化学反应（non-clicked）的样本不能作为有效对照，因为仅使用此类对照获得的任何结果可能源于非特异性点击反应。我们未观察到ANL在不表达MetRS*基因的细胞中发生掺入，也未观察到在无Cre的细胞中存在MetRS*表达；因此，用ANL标记的野生型动物可作为阴性对照。
鉴于本方案包含多个可能导致样本丢失的步骤，建议在计算生物学重复时考虑技术性失败的因素。对于脑组织样本，大约有30%的重复样本可能丢失。
本文描述了两种 ANL 的给药途径和给药持续时间。这并不排除其他给药方式（例如，将 ANL 添加至食物中）同...

蛋白质稳态失衡由蛋白质合成与降解之间的失衡引起。多种疾病与蛋白质稳态的改变相关，其中一些疾病的特征是在不同的亚细胞区域和脑区出现蛋白聚集体。蛋白质稳态不仅在疾病中具有重要意义，也在正常器官和细胞功能中发挥关键作用1。例如，已有研究表明，蛋白质合成对于多种形式的神经元可塑性至关重要2,3，该结论基于使用化学抑制剂阻断蛋白质合成的实验结果4。然而，目前尚不清楚在学习与记忆过程中，哪些特定细胞类型的蛋白质组发生了改变，也不清楚每种细胞类型中哪些特定蛋白质的合成或降解发生了增加或减少。因此，对蛋白质稳态进行全面研究，需要具备区分来自特定细胞类型蛋白质组的能力。事实上，在多细胞环境中识别特定细胞类型的蛋白质组，一直是蛋白质组学研究中的一个重要难题。为此，我们开发了一种结合MetRS*表达与生物正交方法的技术，已被证明是识别和纯化特定细胞类型蛋白质组的有效手段，填补了这一研究空白5,6,7。
表达突变型MetRS*（MetRS L274G）可实现非天然甲硫氨酸类似物ANL向相应tRNA的加载8,9 及其后续整合&#160;转化为蛋白质。当MetRS*的表达由细胞类型特异性启动子调控时，非经典氨基酸将以细胞选择性的方式被掺入蛋白质中。一旦ANL被掺入蛋白质，即可通过点击化学（click-chemistry）进行特异性功能化，随后通过成像技术（FUNCAT）或蛋白质免疫印迹（BONCAT）进行可视化检测。 Alternatively，蛋白质也可通过质谱（MS）进行选择性纯化与鉴定。利用该技术，我们构建了一种小鼠品系，其MetRS*蛋白的表达受Cre重组酶的调控。鉴于目前已有越来越多的Cre小鼠品系，MetRS*系统可广泛应用于各个研究领域，针对任何已有Cre品系的组织中的特定细胞类型开展研究。使用ANL对蛋白质进行标记是可行的 体外 或 体内，且不会改变小鼠行为或蛋白质完整性6标记时间可根据每位研究人员的科学问题进行调整，以标记新合成的蛋白质（较短标记时间）或整个蛋白质组（较长标记时间）。该技术的应用受限于研究人员拟研究的细胞类型的数量；因此，对于数量较少或代谢率较低的细胞类型，无法通过此方法实现蛋白质分离。本方法的目标是鉴定被标记的细胞类型特异性蛋白质/蛋白质组 体内在本实验方案中，我们描述了如何在活体小鼠中利用ANL对特定细胞类型的蛋白质组进行标记，并纯化标记后的蛋白质。纯化后，可采用常规的质谱分析方法对蛋白质进行鉴定。5,10通过选择性纯化特定细胞群体中的蛋白质，该方法降低了样品复杂性，使研究者能够检测蛋白质组的细微变化，例如在环境变化刺激下的变化。标记蛋白质的纯化过程约需10天完成，不包括质谱分析或标记周期。本文中，我们描述了向表达MetRS*的小鼠施用ANL的两种方法：（1）将氨基酸添加至饮水中；（2）通过腹腔注射引入ANL。无论选择哪种ANL施用方式，后续的分离与纯化步骤均相同（从第2步开始）。

<table><tbody><tr><td>12% 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>GenScript</td><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>有毒；使用实验服、手套和通风橱。</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>有毒；使用实验服、手套和通风橱</td></tr><tr><td>ANL</td><td></td><td></td><td>合成方法如先前对AHA所述（见参考文献5和11）</td></tr><tr><td>ANL-HCl</td><td>IrishBotech</td><td>HAA1625.0500</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶（Benzonase）</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>生物素炔烃</td><td>Thermo,</td><td>B10185</td><td></td></tr><tr><td>鸡源抗GFP抗体</td><td>Aves</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>有毒；使用实验服和手套。</td></tr><tr><td>溴化亚铜（I）</td><td>Sigma</td><td>254185</td><td>99.999% (wt/wt)</td></tr><tr><td>二硫键标签（DST）-炔烃</td><td></td><td></td><td>合成方法见参考文献15，其中称为探针20</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>滤膜</td><td>Merk</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>IR 抗鸡 800</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 800CW</td><td>驴抗鸡二抗</td></tr><tr><td>IR 抗兔 680</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 680RD</td><td>山羊抗兔IgG二抗</td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Sigma</td><td>M9171</td><td></td></tr><tr><td>手动混合器</td><td>BioSpec Products</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Sigma</td><td>4259</td><td>有毒；使用实验服、手套和通风橱。</td></tr><tr><td>NeutrAvidin 琼脂糖珠</td><td>Pierce</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>J62036.K2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X pH 7.8</td><td></td><td></td><td>制备方法见参考文献5</td></tr><tr><td>PD SpinTrap G-25 柱</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用于缓冲液置换</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo,</td><td>23225</td><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒中的试剂对水生生物有毒。</td></tr><tr><td>兔多克隆抗生物素抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>5597</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE&amp;nbsp; 运行缓冲液 MOPS</td><td>GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Ruby 染色液</td><td>Sigma</td><td>S4942</td><td></td></tr><tr><td>台式自动涡旋振荡器</td><td>Eppendorf</td><td>Mixmate</td><td></td></tr><tr><td>三唑配体</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>分子生物学级</td></tr></tbody></table>

利用突变型甲硫氨酸trna合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

理解蛋白质稳态 在体 对于了解细胞在生理和疾病状态下的功能至关重要。本方案描述了 体内 利用经基因工程改造的小鼠品系，通过特异性标记特定细胞群体中的新合成蛋白质并进行后续纯化。该小鼠品系可在Cre重组酶诱导下表达L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*），从而实现非天然氨基酸叠氮正亮氨酸（ANL）在蛋白质中的特异性掺入，而该过程在正常情况下不会发生。通过本文所述方法，可实现对特定细胞类型中标记的新合成蛋白质组的富集与纯化 体内 并通过降低样本复杂性来检测蛋白质含量的细微变化。

按照所述方案（总结于 图1），通过每日腹腔注射给予小鼠ANL（400 mM ANL，10 mL/kg，Nex-Cre::MetRS*），持续7天，或 通过 饮用水（含0.7%麦芽糖、1% ANL、CamkII-Cre::MetRS*）持续21天。标记结束后，分离相应脑区组织，进行裂解、烷基化和点击化学反应。点击化学反应产物通过SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹分析。实验的代表性图像如下所示 图2 用于通过腹腔注射给予 ANL 图3 用于 ANL 给药 通过 饮用水。需要注意的是，图示的目的是展示两种标记方法均有效，而非对二者进行比较。由于所示的两个实验中标记了不同的神经元群体（海马体和皮层的兴奋性神经元，以及小脑的浦肯野神经元），因此无法进行直接比较。 
另一项实验提供了确定最佳DST-可裂解炔烃浓度的示...

本方案描述了如何利用表达突变型L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*）的小鼠品系，通过叠氮诺亮氨酸（ANL）对特定细胞类型的蛋白质进行标记，并详细说明了分离标记蛋白质所需的步骤。我们概述了在活体小鼠中使用ANL的两种给药途径：（1）饮水给药和（2）腹腔注射。

利用突变型甲硫氨酸tRNA合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

了解体内蛋白质稳态对于认识细胞在生理和疾病状态下的功能至关重要。本方案……

该方案能够以细胞类型特异性的方式标记蛋白质。这是首个提供此类可能性的技术，可在体外或体内进行。该技术的主要优势在于，可对已标记的细胞类型特异性蛋白质进行未鉴定状态下的纯化，或通过免疫荧光在原位进行可视化观察。首先，通过加入裂解缓冲液来制备组织裂解液，缓冲液体积为组织湿重的12至15倍，并反复吹打组织直至充分匀浆。将此匀浆在75摄氏度加热15分钟以使蛋白质变性，然后离心样品，并将上清液转移至新管中。该样品可在负80摄氏度保存。接下来，将匀浆后的样品用含有无EDTA蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液稀释两到三倍，用于烷基化。然后加入新配制的碘乙酰胺，使其终浓度为20毫摩尔。将样品在20摄氏度避光条件下孵育一至两小时。重复碘乙酰胺添加和孵育步骤两次。按照制造商的说明准备色谱柱：首先涡旋震荡色谱柱，然后取下盖子，切去底部，并进行离心。接下来，首先使用点击化学交换缓冲液平衡缓冲液交换柱，然后对所有烷基化样品进行缓冲液交换。为评估叠氮高丙氨酸的掺入情况，取40微升上述样品，加入磷酸盐缓冲液（PBS），使终体积达到120微升。随后通过涡旋振荡反应液20秒，建立点击化学反应体系。按照指定顺序快速加入每种试剂后，将样品在4°C避光孵育过夜，并持续旋转。次日，将样品在17,000 × g离心5分钟，离心后可见略带 turquoise 色的沉淀。将上清液转移至新管中，并将样品在-80°C保存。用于标记蛋白的纯化。将所有样品进行缓冲液置换操作，以去除游离炔烃残留物，使用中性亲和素结合缓冲液作为平衡缓冲液。随后，用结合缓冲液混合中性亲和素高容量磁珠，洗涤三次。将混合物离心，弃去上清液，并重复此步骤三次。然后通过加入等体积的链霉亲和素干珠和链霉亲和素结合缓冲液，制备1:1的悬浊液。每份样品预留20至40微升作为纯化前裂解液，并于-20摄氏度保存。测定样品的蛋白浓度后，将一毫克蛋白与40微升珠子悬液混合。将混合物在4摄氏度下孵育过夜，同时持续旋转，使标记的蛋白结合到珠子上。次日，通过离心收集上清液。留取20至40微升上清液用于后续分析，其余部分于-80摄氏度冷冻保存。随后，加入预冷的中性亲和素洗涤缓冲液1，洗涤磁珠三次。每次洗涤均需沉淀磁珠并弃去上清液。然后加入相同缓冲液，在4摄氏度下持续旋转孵育珠子10分钟，随后弃去上清液。使用中性亲和素洗涤缓冲液二和三重复洗涤两次，并用相当于所用干珠体积的中性亲和素洗脱缓冲液，在20摄氏度下孵育珠子30分钟，以洗脱发生点击化学反应的蛋白质。在洗脱过程中，将珠子置于恒温金属浴振荡器中，以每分钟1000转的速度保持悬浮状态，分两次进行洗脱，并合并两次洗脱液。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析点击反应。图中展示了经腹腔注射给予叠氮高正亮氨酸以及通过饮水给予叠氮高正亮氨酸的实验代表性图像。另一项实验提供了确定最佳二硫键生物素可裂解炔烃浓度的示例。在此示例中，标记样本与对照样本之间的倍数变化在14 µM炔烃浓度下达到最高。此处展示了一个质谱结果示例，显示与对照样本相比，叠氮诺亮氨酸标记样本中存在明显的富集现象。该差异在总蛋白染色中已可观察到。除了肽段强度的变化外，两种样本中还存在各自特有的蛋白质。该实验方案技术上较为复杂，必须严格遵循每一步操作，并使用适当的阴性对照、烷基化处理以及对非点击化合物进行充分的纯化和清洗。本方案的关键步骤在于：若研究人员希望研究蛋白质，可通过对纯化后的蛋白质进行质谱分析来鉴定；也可将蛋白质上样至凝胶，通过蛋白质印迹法（Western blot）对目标蛋白进行分析。该方法能够标记特定细胞来源的蛋白质，在蛋白质张力研究或体外、体内蛋白质合成分析等方面具有广泛应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用突变蛋氨酸tRNA合成酶小鼠系从复杂组织中纯化和鉴定细胞类型特异性蛋白

本视频演示了增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法，用于鉴定小鼠睾丸中的RNA结合蛋白。eCLIP能够精确定位RNA结合蛋白（RBPs）与其靶RNA相互作用的结合位点。...

一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA

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在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

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使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

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单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

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从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

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雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

本方案描述了利用聚合和去聚合循环从小规模或中等规模来源（如培养细胞或单个小鼠脑组织）中纯化微管蛋白的方法。所获得的纯化微管蛋白在特定异构体或特定翻译后修饰方面得到富集，可用于体外重建实验，以研究微管动力学及其相互作用。...

通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化Salmonella typhimurium色氨酸合酶复合物，并提供了一种可在一天内快速纯化该蛋白复合物的实验方案。所涵盖的方法包括定点诱变、在Escherichia...

PCR定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶

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