Name: 强大且高度可重复的皮质脑类器官生成，用于在体外模拟大脑神经元衰老 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: 学习利用hPSC分化技术构建高度可重复的皮质脑类器官，用于在体外模拟大脑神经元衰老过程。该方法为研究人类脑发育及神经退行性疾病提供了可靠的实验平台。

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本工作由医学研究未来基金-加速研究项目、脑白质营养不良旗舰计划“Massimo's Mission”（EPCD000034）以及医学研究未来基金-干细胞使命项目（APP2007653）资助。作者谨此感谢韩国大学的Ju-Hyun Lee博士为补充视频1提供数据。

1. 皮质脑类器官的生成
注意：本方案的此部分所有步骤均须在二级生物安全柜中进行，除非另有说明。
<ol>
	<li>从hPSC二维培养物中诱导生成二维神经外胚层集落（第-1至3天）
	<ol>
		<li>诱导前，将hPSC集落以20%–30%的密度接种于6孔板中的hESC级基底膜基质上。可通过将一个6孔板中60%汇合度的hPSC集落传代至三个新的6孔板孔中来达到该密度。</li>
		<li>进行基底膜基质包被时，用普通基础培养基按1:50比例稀释基底膜基质，每孔均匀加入1 mL，室温（RT）孵育1小时后吸除。</li>
		<li>在开始分化前，使用2 mL无血清细胞培养基维持hPSC集落1天。</li>
		<li>在hPSC分化当天，使用明场显微镜以4×至10×放大倍数检查hPSC集落，确保集落状态健康且无明显分化迹象。 
		注：健康的hPSC会形成边缘紧密的集落，细胞具有较大的细胞核、极小的细胞质以及明显的核仁。已分化的iPSC集落在形态上与上述hPSC集落有明显差异，尤其体现在集落外缘或中心区域。</li>
		<li>根据表1列出的试剂配制分化所需的N2培养基，并在使用前将其恢复至室温（RT）。</li>
		<li>待培养基恢复至室温后，吸除6孔板各孔中的无血清细胞培养基，轻轻加入2 mL N2培养基（使用5 mL移液管）。</li>
		<li>加入双SMAD抑制剂SB-431542（10 µM）和LDN 193189（100 nM）。 
		注：SMAD抑制剂可在N2培养基加入各孔后添加，也可在更换无血清培养基前加入所需量的N2培养基中。通过轻轻摇晃培养板或倒置含有培养基和抑制剂的离心管3–4次，可使抑制剂均匀混入培养基中。</li>
		<li>在接下来的2天内，每天向各孔加入新鲜的N2培养基，并补充SB-431542（10 µM）和LDN 193189（100 nM）。 
		注：每日更换新鲜N2培养基可减少细胞长期暴露于用于溶解SB-431542和LDN 193189的DMSO中，从而避免细胞毒性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从诱导生成的二维神经外胚层集落生成三维神经外胚层球体（第3至7天）
	<ol>
		<li>使用dispase酶处理，按照步骤1.2.2–1.2.8操作，将诱导后的神经外胚层集落剥离。</li>
		<li>首先，从6孔板中移除2 mL N2培养基，并用HBSS洗涤一次，确保完全去除残留的N2培养基。 
		注：N2培养基可能干扰dispase的酶活性，影响神经外胚层集落从孔底的充分脱离。</li>
		<li>向每个含有集落的孔中加入1 mL浓度为2.4单位/mL的dispase溶液。</li>
		<li>在37 °C孵育20–25分钟（最长不超过30分钟），期间定期检查集落脱离情况。 
		注：较小的集落可能在20分钟内即已脱离；若超过30分钟仍未能脱离的集落应予以舍弃。</li>
		<li>孵育结束后，向孔中加入1 mL N2培养基以终止dispase酶活性，并使用宽口P1000移液枪头或经无菌剪刀剪裁改造的P1000枪头（制成宽口型）将集落转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>让集落团块依靠重力自然沉降至管底。 
		注：此过程约需1分钟。</li>
		<li>待集落团块沉降后，小心使用标准P1000移液枪头吸除上清液，并替换为1 mL新鲜N2培养基。重复该洗涤步骤三次，以确保完全去除dispase残留。 
		注：任何残留的dispase都会阻碍神经外胚层球体的均匀形成，并导致细胞死亡。</li>
		<li>洗涤完成后，将细胞团块重悬于3 mL N2培养基中，转移至一个6孔板孔内，并加入40 ng/mL bFGF。 
		注：若脱离的神经外胚层集落数量较多，可将其接种于两个或多个6孔板孔中，以防止球体融合。在使用dispase处理集落24小时后，检查是否已形成球体。</li>
		<li>在接下来的3–4天内继续使用相同培养基维持球体生长，每天向各孔补充新鲜bFGF（40 ng/mL），以促进神经外胚层细胞增殖、自组织化，并诱导和扩增神经上皮结构。 
		注：若球体接种密度较高，培养基可能较快变黄，需每隔2天更换一次含新鲜bFGF（40 ng/mL）的培养基。但此做法不推荐，建议每孔维持较少数量的球体以避免该问题。若已观察到明显的神经上皮结构，可在3天后将球体包埋于基底膜基质中；若神经上皮结构不明显或发育较弱，则继续维持培养1天后再行评估。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮层脑类器官的分化与维持（第8天）
	<ol>
		<li>根据表2所列试剂配制终末分化培养基（DM），并将其恢复至室温（RT）。</li>
		<li>将100% hESC级基底膜基质置于冰上解冻。</li>
		<li>在10 cm培养皿中放置一张经70%乙醇灭菌的Parafilm膜，并在其表面压出凹槽，然后置于生物安全柜内的体视显微镜下。 
		注：可使用空的200 µL移液枪头盒在Parafilm上压出规则的凹槽阵列。</li>
		<li>剪去100 µL移液枪头末端（制成宽口型），用于在不破坏球体的前提下将神经球体包埋入基底膜基质中。</li>
		<li>在体视显微镜下，从6孔板中挑选大小相近的神经球体（约500 µm），使用宽口100 µL移液枪头将其转移至Parafilm的凹槽中，每个凹槽放置一个神经球体。</li>
		<li>轻轻吸除多余培养基，仅保留足以覆盖球体的少量液体。 
		注：此举旨在添加基底膜基质前维持球体质量，防止其干燥。</li>
		<li>轻轻在球体上方加入18 µL基底膜基质，使球体位于基质液滴中央。可用10 µL移液枪头末端调整球体在基质中的位置，使其居中。 
		注：应尽快完成基底膜基质的添加，以避免球体周围液体干燥。</li>
		<li>盖上10 cm培养皿，转移至培养箱中，在37 °C孵育25分钟，使Parafilm上的包埋球体在基底膜基质中稳定。</li>
		<li>孵育结束后，使用P1000枪头吸取0.5 mL DM培养基，将包埋的球体冲洗至低吸附24孔板中，确保每个孔仅含一个包埋的球体。 
		注：若同一孔中落入多个包埋球体，应使用宽口P1000枪头将多余的球体转移至新孔中。</li>
		<li>将已分化的皮层脑类器官长期维持在DM培养基中，随着类器官体积增大和培养时间延长，每2天更换一次培养基。 
		&#8203;注：在分化的第一周内，可每3天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大脑类器官中神经元衰老的表征
<ol>
	<li>处理皮质类器官以制备冷冻切片： 
	注意：所有步骤均在二级生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>准备若干 2 mL 离心管，每管加入 1.5 mL 4% 多聚甲醛（PFA）。</li>
		<li>剪去 P1000 移液枪枪头的尖端（使其成为宽口枪头），轻柔地将每个类器官转移至上述准备好的 2 mL 离心管中（每管一个类器官）。 
		注意：为防止过多的 DM 培养基混入 PFA 中，可让类器官沉降至 P1000 枪头开口处，并将枪头末端轻轻置于管中 PFA 液面上方，再将类器官吹出。这样可确保仅转移类器官及极少量培养基。</li>
		<li>于 4°C 固定 1 小时。</li>
		<li>使用未剪切的 P1000 枪头，小心吸除多余的 PFA，并加入 1.5 mL 冷的 1× PBS。</li>
		<li>将离心管置于摇床上，设置转速为 70 rpm，在室温下振荡洗涤 10 分钟。</li>
		<li>用冷的 1× PBS 重复洗涤三次，确保彻底去除所有 PFA。 
		注意：切勿将 PFA 排放到普通废弃物容器中；应准备专用的化学废液容器进行收集，因为 PFA 属于有害物质。</li>
		<li>将类器官浸入含 30% 蔗糖的 1× PBS 中，于 4°C 孵育，直至所有类器官沉降至管底。 
		注意：类器官下沉所需时间取决于其大小和培养时间。3 个月大的类器官可能需要长达 5 小时。</li>
		<li>使用剪切过的宽口 P1000 枪头，轻柔地将三至五个类器官转移至包埋模具中，模具内含有由 30% 蔗糖与 100% 最佳切割温度（OCT）包埋剂按 3:2 比例配制的包埋液。</li>
		<li>借助体视显微镜，使用 10 µL 枪头将类器官排列成网格状，进行定向和定位。</li>
		<li>将模具置于干冰上，使蔗糖-OCT 溶液完全凝固后，再使用冷冻切片机进行切片（厚度 16–20 µm）。 
		注意：对于衰老相关 β-半乳糖苷酶检测，所有组织必须在沉底后立即进行切片处理；而对于免疫荧光染色，可在次日进行切片。若不能立即染色，所有载玻片上的切片均需于 -20 °C 保存，以备后续进行免疫荧光或 β-半乳糖苷酶染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮质脑类器官衰老分析的处理步骤： 
	注意：以下步骤可在普通实验台面上进行。
	<ol>
		<li>将载玻片放入带盖的显微镜载玻片染色缸中，用 1× PBS 在室温下洗涤切片组织三次，每次 10 分钟，以去除残留的包埋剂。</li>
		<li>随后，将洗涤后的组织与新配制的 β-半乳糖苷酶染色液在 37 °C 下孵育过夜。 
		注意：β-半乳糖苷酶染色液的配制方法如下（以 10 mL 磷酸盐缓冲液为例）：8.15 mL 1 M NaH2PO4 与 1.85 mL 1 M Na2HPO4 混合，调节 pH 至 6.0，加入 100 mM 铁氰化钾（III）、100 mM 亚铁氰化钾（II）三水合物、5 M NaCl、1 M MgCl2 和 20 mg/mL X-Gal。避免使用含 CO2 的标准细胞培养箱，因为 CO2 会改变 β-半乳糖苷酶染色液的 pH 值。</li>
		<li>用 1× PBS 在室温下洗涤染色后的组织三次，每次 10 分钟，以去除残留的 β-半乳糖苷酶染色液。</li>
		<li>使用抗荧光淬灭封片剂将洗涤后的组织封片，并在室温下静置 30 分钟，使封片剂完全凝固，随后可在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
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<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC-derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).</li>
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<li>Shaker, M. R., Aguado, J., Chaggar, H. K., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+inhibits+neuronal+senescence+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Klotho inhibits neuronal senescence in human brain organoids.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 1-12 (2021).</li>
<li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+Wnt-RA+gradient+defines+adhesion+and+migration+properties+of+neural+progenitors+in+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior Wnt-RA gradient defines adhesion and migration properties of neural progenitors in developing spinal cord.</a> Stem Cell Reports. 15 (4), 898-911 (2020).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+myelinating+human+oligodendrocytes+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of myelinating human oligodendrocytes in organoids.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 631548(2021).</li>
<li>Lee, J. -H., Shaker, M. R., Lee, E., Lee, B., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroCore+formation+during+differentiation+of+neurospheres+of+mouse+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">NeuroCore formation during differentiation of neurospheres of mouse embryonic neural stem cells.</a> Stem Cell Research. 34, 101691(2020).</li>
<li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+contribution+of+neuromesodermal+progenitor-derived+neural+cells+in+the+elongation+of+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal contribution of neuromesodermal progenitor-derived neural cells in the elongation of developing mouse spinal cord.</a> Life Sciences. 282, 119393(2021).</li>
<li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+epidermal+growth+factor-like+like+protein+2+Is+expressed+in+human+oligodendroglial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural epidermal growth factor-like like protein 2 Is expressed in human oligodendroglial cell types.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 803061(2022).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li>
<li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Hunter, Z. L., Leeson, H. C., Shaker, M. R., Wolvetang, E. J., Vadlamudi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+epilepsy+patients+for+use+as+in+vitro+models+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells generated from epilepsy patients for use as in vitro models for drug screening.</a> Stem Cell Research. 60, 102673(2022).</li>
<li>Kaur, A., Macip, S., Stover, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+appraisal+on+the+value+of+using+nutraceutical+based+senolytics+and+senostatics+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An appraisal on the value of using nutraceutical based senolytics and senostatics in aging.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 218(2020).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+dispase+and+plasmin+in+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of dispase and plasmin in pharmacologic vitreolysis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3286-3290 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了在药物筛选和疾病建模中应用人多能干细胞（hPSC）衍生的脑类器官，必须采用可重复且可靠的方案来制备类器官15脑类器官通常由人多能干细胞（hPSCs）衍生的拟胚体生成，随后将拟胚体包埋于促进组织扩展和神经分化的细胞外基质中。与Lancaster等人的方案相比1,16,17 和 Velasco18，其开始&#160;从拟胚体中分离并培养&#160;为了使类器官遵循默认的分化路径，我们发现，与使用胚状体相比，直接从人神经外胚层细胞（NEct细胞）开始皮质脑类器官的构建，能够提高皮质脑类器官形成的稳定性。这同时也便于实现药物筛选和表型筛选所需的规模化操作。由于人NEct细胞不仅可扩增至较大数量，还可方便地进行冷冻保存，该方法进一步提升了实验间的可重复性。此外需指出的是，与其他采用生物反应器或类似技术的方案相比，本方案无需特殊设备，因此适用于任何实验室。6最后，与Lancaster方法相比，生成表达皮层分层标志物（如SATB2）的成熟类器官所需时间更短。1 和生物反应器实验方案6,19 使其更适用于研究人类大脑皮层在健康与疾病状态下的发育轨迹1,6,16.
此外，鉴于与大脑中衰老细胞类型增加相关的衰老相关疾病（如痴呆）对全球医疗健康的持续增长影响，能够识别并测试可改善大脑衰老的化合物具有极大的研究价值。尽管已知人多能干细胞（hPSCs）在重编程过程中会发生表观遗传学上的 rejuvenation20，但我们发现，在长期培养的皮质脑类器官中，衰老细胞数量显著增加。这一发现具有重要意义，使得现在可以筛选能够清除大脑中此类衰老细胞（即senolytics）或延缓该过程（即senostatics）的药物21。由于来源于人神经外胚层细胞（NEct）的皮质脑类器官具有人类来源特性，这一方法有望缩短此类新型治疗药物从研发到上市的传统路径。
本实验方案中有两个关键步骤。第一步是在分化时人多能干细胞（hPSC）集落应处于正确的汇合度。hPSC集落的汇合度最多不得超过30%，以确保生成的神经外胚层（NEct）集落不会与邻近集落融合，并保证每个类器官为单克隆来源。第二步的关键在于正确使用分散酶（dispase）来剥离NEct集落并形成神经球。分散酶孵育时间对最终生成的神经球质量至关重要，因为集落过度暴露于分散酶会对细胞产生毒性22，进而影响所生成类器官的质量。本方案的局限性在于难以控制神经球的大小，因为其大小取决于用分散酶剥离的初始集落的尺寸。然而，在进入包埋步骤时，通过选择大小相近的神经球即可克服这一问题。
最后，未来应用还可拓展至在机器人分析和生物制药筛选中的可重复性皮质类器官使用，这些方法在该行业中通常被采用。我们实验室的初步数据支持这一前景，表明从人NEct细胞生成皮质脑类器官可轻松实现自动化，因而与这些方法具有良好的兼容性。

目前，我们对人类大脑的认知在很大程度上依赖于动物模型和死后脑组织标本。干细胞生物学是一个快速发展的领域，为揭示人类大脑发育的基本生物学机制以及脑部疾病病理驱动因素提供了新的见解。人类多能干细胞（hPSCs）是模拟人类大脑的宝贵工具 通过 类器官的生成，即形成类似器官的三维（3D）组织，通常可重现发育中人脑的发育轨迹、细胞组成和结构特征。脑类器官由神经干细胞、特化的神经前体细胞、成熟神经元和胶质细胞类型自组装而成。因此，类器官为研究难以直接进行实验干预的早期人脑提供了独特的机会，但也存在固有局限性，例如缺乏脉管系统和免疫系统。
类脑器官的生成方法主要分为两种：非引导性分化和引导性分化。非引导性类脑器官方法依赖于干细胞自发的内在分化能力，驱动组织形态发生1,2，从而产生多种细胞谱系，包括前脑、中脑、后脑、脉络丛、视网膜以及中胚层细胞。相比之下，引导性类脑器官方法则需要大量使用外源因子，将人多能干细胞（hPSCs）定向诱导为特定脑区类型的神经谱系，例如内侧神经节隆起3、前脑4、中脑5、下丘脑6、小脑7和脉络丛8。这种能够生成具有不同细胞谱系的多种脑区，并按需融合这些类器官的能力，使类脑器官成为研究人类大脑发育及解析脑部相关疾病机制的优秀模型。尽管这些类脑器官生成方法在模拟人类脑区方面取得了突破，但类器官之间的变异性与异质性仍是系统性与定量研究（如药物筛选）中的重要限制因素。
本方案基于我们近期发表论文中建立的方法9 并利用双SMAD抑制剂（SB-431542和LDN 193189）诱导hPSC细胞集落选择性分化为神经外胚层（NEct）命运，随后在FGF2信号作用下于4天内自组织形成三维神经上皮球状体。这些神经上皮球状体可稳定生成具有均一性的皮层类器官，其具备 体内-样细胞组成。本文所述方案基于我们先前的研究发现，即抑制双SMAD（Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic）信号通路可促进人多能干细胞向源自神经外胚层前体细胞的前脑神经干细胞分化。10 通过抑制内胚层、中胚层和滋养层细胞命运的选择等机制11此外，将神经上皮球体包埋于适用于人胚胎干细胞的基底膜基质中，可显著诱导神经上皮出芽，形成具有顶-基极性的脑室样结构。大规模培养结果表明，无论细胞系、克隆来源或批次如何，皮层类器官均表现出良好的可重复性与均一性，因此该系统代表了一种可靠且稳定的干细胞模型，可用于模拟健康与疾病状态下的人类早期皮层发育过程 体外我们进一步概述了一种检测长期培养的hPSCs来源的皮质脑类器官中衰老神经元细胞标志物的方案。
在以20%-30%的接种密度接种hPSCs后，细胞需用双SMAD抑制剂处理3天，以诱导hPSC&#160;集落向神经外胚层集落分化。随后用dispase轻柔地将这些集落剥离，并接种至添加了FGF2的超低吸附6孔板中。悬浮的二维集落在过夜时间内自组织形成三维神经外胚层类球体，并在添加每日新鲜FGF2的N2培养基中维持培养4天。一旦类球体形成神经上皮层，即可将其包埋于基底膜基质中。通过定期添加新鲜的终末分化培养基，研究人员将观察到皮质类器官中神经上皮的逐步扩展和出芽。研究人员可能希望将这些类器官解离，以进行转录组和蛋白质组分析。此外，建议使用明场成像来监测皮质类器官的质量。分析可通过固定、冷冻切片和免疫染色进行。这些技术的描述和方法此前已有报道12。最终，本方案使研究人员能够快速、稳定地生成均一的皮质脑类器官，用于模拟发育中的人类皮质脑，且成本低、所需设备有限，并可用于研究细胞神经元衰老的各个方面，如本文所述。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛（W/V），无甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>将4% PFA溶于1×PBS中</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 50 mL（1000×）</td><td>Life Technologies Australia (TFS)</td><td>21985023</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>B27添加剂 10 mL</td><td>Life Technologies Australia (TFS)</td><td>17504044</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>CKX53显微镜配SC50相机</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 6孔细胞培养板</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>CLS3516-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td>将粉末溶于HBSS中，经0.22 &amp;micro;m滤膜过滤，分装为10 mL每份，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>DMEM/F12营养混合物（10×，500 mL）</td><td>Thermofisher</td><td>11320082</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>DMSO 二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Matrigel hESC认证基质</td><td>In Vitro Technologies Pty Ltd</td><td>FAL354277</td><td>分装为100 &amp;micro;L每份，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>GlutaMAX添加剂（100×）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>人诱导性多能干细胞（EU79）</td><td></td><td></td><td>由皮肤成纤维细胞在本实验室重编程获得</td></tr><tr><td>人诱导性多能干细胞（G22）</td><td>Genea Biocells</td><td></td><td>购自Genea Biocells（美国圣迭戈）</td></tr><tr><td>人诱导性多能干细胞（WTC）</td><td></td><td></td><td>由Bruce Conklin教授惠赠</td></tr><tr><td>InSolution TGF-&amp;Beta;RI激酶抑制剂VI，SB431542</td><td>Merck</td><td>US1616464-5MG</td><td></td></tr><tr><td>人重组胰岛素溶液</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>I9278</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>LDN193189二盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>SML0559-5MG</td><td>分化过程中使用</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100×）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>100-0276</td><td>用于在NM培养基诱导分化前维持hiPSC集落</td></tr><tr><td>N2添加剂 5 mL（100×）</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>17502048</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>用于DM培养基</td></tr><tr><td>OCT包埋剂 Sakura Clear（118 mL/瓶）</td><td>Tissue Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M卷膜 4英寸×125英尺</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>用于NM和DM培养基</td></tr><tr><td>六氰合铁(II)酸钾三水合物</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>CP1087</td><td></td></tr><tr><td>六氰合铁(III)酸钾</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>455946</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies Australia (TFS)</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性FGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-01M</td><td>分装为20 &amp;micro;g/mL，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td>分化过程中使用</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>&amp;nbsp;PHR1001-1G</td><td>将30%蔗糖溶于1×PBS中</td></tr><tr><td>超低吸附多孔板，24孔，聚苯乙烯</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>X-GAL EA</td><td>Life Technologies Australia (TFS)</td><td>R0404</td><td>分装为20 mg/mL，于-80 &amp;deg;C保存</td></tr></tbody></table>

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

脑类器官是发育中人脑的三维模型，为疾病建模以及大规模基因组学和药物筛选提供了极具吸引力的前沿平台。由于脑类器官中细胞具有自我组织的特性，且其制备方法的种类日益增多，类器官之间存在异质性和变异性的问题已逐渐显现。在本实验方案中，我们描述了一种稳健且可重复的制备流程，该流程在很大程度上克服了上述问题，可在1个月内由神经外胚层前体细胞生成皮层类器官，并可维持培养超过1年。该高度可重复的方案可在标准组织培养室中轻松实施，所获得的类器官包含发育中人脑皮层中常见的多种细胞类型。尽管这些类器官处于早期发育状态，但在长期培养后，其中的神经元及其他人脑细胞类型将开始表现出神经细胞典型的衰老特征

关键词：脑类器官，皮层类器官，神经外胚层前体细胞，疾病建模，药物筛选，基因组学，细胞衰老，三维培养，类器官培养，神经发育 体外 培养，使其成为研究衰老相关神经元过程的宝贵且实用的平台。本方案还概述了一种利用衰老相关β-半乳糖苷酶染色在皮层脑类器官中检测此类衰老细胞的方法。

在此，我们描述了一种可靠的方案，该方案可使研究人员生成均一的由人多能干细胞（hPSC）衍生的皮质脑类器官，以模拟 体内 在培养1-3个月内形成人皮层脑区。首先将人多能干细胞（hPSC）集落置于分化培养基中培养，以生成神经外胚层集落，随后用于形成神经球状体。这些球状体继而被包埋于基底膜基质中，并长期维持培养，以生成可用于模拟神经元衰老的类器官（参见 图1 关于实验方案的概述，请参见相应部分）。值得注意的是，在超低吸附24孔板中培养这些类器官会引发细胞应激，并在13周内促进与衰老相关的表型 体外 培养。通过本方案获得的类器官还可置于搅拌式生物反应器中，或在气液界面培养，以促进皮质板神经细胞的最佳生长与分化。
首先，在开始神经外胚层分化前，将人多能干细胞（hPSC）集落培养1天。关键在于，hPSC集落的融合度应仅为20%–30%，且必须保持最高质量：呈紧密、扁平的单层结构，集落中无任何分化细胞污染（图2A，B）。应通过检测NANOG等多能性标志物的表达来确认hPSC集落的多能性（图2C）。经验证的hPSC集落随后被置于含SB-431542和LDN 193189的N2神经外胚层分化培养基中。在此培养基中维持培养3天后，hPSC集落应已分化为神经外胚层集落，不再呈现hPSC典型的紧密扁平单层形态（图2B），而是转变为细长的柱状细胞（图2B）。这些细胞对NANOG等多能性标志物呈阴性表达（图2C）。
在此阶段，使用dispase酶法分离神经外胚层克隆，每个健康且成功分离的克隆均可自行组织并形成年轻的神经球（图2D，补充视频1）。只有健康、洁净的神经外胚层克隆才会在dispase作用规定的时间范围内脱落；其余克隆应予以忽略，因其将导致神经球质量较差。在N2培养基中每日添加FGF2的作用下，这些神经球中的神经干细胞（SOX2+）（图2D，第1天）将增殖并形成大量神经玫瑰花环结构（图2D，第4天）。这些玫瑰花环结构在位于结构中心及神经球外缘的细胞中表达紧密连接和上皮标志物ZO1，表明神经球具有顶-基底极性（图2D，第4天）。关于神经球整体三维成像的方法已有先前报道13。每日观察应可发现神经球形成致密、深色的外缘及明亮的周边区域，此即为神经上皮层。该层通常在3–4天后充分形成，直径约为500 µm，此时可将神经球包埋于基底膜基质中。若该层缺失或仅微弱形成，则表明神经球发育不足，不宜继续使用。建议再等待一天以观察是否出现变化；若仍无改善，则应弃用这些神经球。
培养3天后类球体的代表性明场图像如图所示 图 2D选择具有紧密神经上皮层、未与其他邻近类球体融合、组织呈半透明且表现出神经玫瑰花环结构形成的类球体，将其包埋于基底膜基质中。包埋后，类球体将迅速增殖并开始出芽：致密组织结节从类球体主体向外扩展并逐渐显现。该现象在包埋后的1至3周内尤为明显，且可在多种细胞系中观察到。图3A). 对包埋类球体的定量分析证实，在三种不同细胞系中，高达100%的类球体中均存在上皮细胞，表明本方案具有预期的均一性和可重复性（图3B）。类器官直径的定量分析在培养过程中 体外 分化进一步证实了不同hPSC细胞系之间结果的可重复性（图3C）。如果未出现出芽现象，则表明类球体发育不正常，应予以弃用。一旦类球体被包埋于基质中，其发育将继续进行，此时的类球体被称为类器官。免疫荧光染色还可证实类器官中存在神经前体细胞（PAX6），以及具有清晰分层结构的类器官中表达皮层分层标志物CTIP2和SATB2图3D,E）。这种分层现象在类器官维持的不同时间点均可观察到（图3D,E）。组织的免疫组织化学方法此前已有描述14.
这些类器官的一个可能应用是研究神经元衰老相关过程如何影响大脑。为探究这一点，从多个不同时间点收获成功生成的类器官，进行切片并针对衰老的标准分子生物标志物（如衰老相关β-半乳糖苷酶和p21）染色。图4A展示了类器官在基底膜基质中包埋后第4周和第13周时衰老相关β-半乳糖苷酶染色的代表性图像。在第4周至第13周期间，衰老相关β-半乳糖苷酶的表达显著增加，表明在培养过程中已发生细胞衰老——这是机体衰老公认的驱动因素之一。在第13周对类器官进行免疫荧光染色，证实了另一衰老标志物p21的存在，并与成熟皮层神经元标志物（CTIP2）共标记，如图4B所示。然而需要注意的是，p21的存在仅提示细胞周期阻滞，其本身并非衰老的确切标志物；建议同时检测其他衰老标志物（如p16及SASP（衰老相关分泌表型）因子），以明确鉴定衰老细胞。
<img alt="iPSC 到类器官过程示意图；步骤包括神经外胚层诱导、球状体形成、包埋。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63714/63714fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：生成可重复皮质脑类器官的示意图。 该示意图展示了从在无饲养层培养基中维持的 hPSCs 生成皮质脑类器官的实验流程。该流程概述了将二维培养的 hPSCs 分化为三维模式化皮质板人类组织类器官所涉及的六个步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63714/63714fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="人诱导多能干细胞向神经外胚层集落分化，NANOG、SOX2、ZO1免疫染色，显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63714/63714fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2由神经外胚层样集落-人多能干细胞衍生的神经球体的生成 (A代表性的人类多能干细胞（PSC）图像，显示形态良好的集落（白色对勾）和已分化集落（白色叉号）。比例尺： 200 µm，4倍放大。 (B) 人多能干细胞经3天双SMAD抑制剂处理后衍生的神经外胚层克隆代表性图像。比例尺： 200 µm，4倍放大倍数。(C人多能干细胞（PSC）集落向神经外胚层集落分化。图像显示了PSC（第1天）和神经外胚层（第3天）集落的免疫荧光染色结果，SOX2（红色）、NANOG（绿色），所有细胞核用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺： 40 µm，100倍放大倍数。 (D) 培养过程中皮质脑类球体发育阶段的时序图像 体外 在明场下观察，并在第1天对整体样本进行SOX2（红色）免疫染色，第4天进行SOX2（红色）和ZO1（绿色）双重免疫染色。明场图像的比例尺为 500 µm，4倍放大，底部图像的比例尺为 40 µm，20倍放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63714/63714fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="皮质类器官在Matrigel中生长；显微镜图像、直方图。免疫染色显示标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63714/63714fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3不同人多能干细胞系来源的皮质脑类器官的表征 (A来自G22、WTC和EU79人iPSC系培养3周后的皮质脑类器官的代表性图像 体外所有图像的比例尺为 500 µm，2倍放大。B) 皮质脑类器官在3周时成功生成的百分比 体外 不同hPSC细胞系（G22、WTC和EU79）中的分化情况。n = 3。数据以均值 ± 标准差表示。C) 柱状图显示皮质脑类器官在第1周和第3周的生长情况（基于平均直径） 体外 不同人多能干细胞系（G22、WTC 和 EU79）中的分化情况。n = 3。数据以均值 ± 标准差表示。D) 来自G22 hPSCs的6周龄和9周龄皮质脑类器官切片的代表性图像，经免疫染色显示脑室区PAX6（红色）和皮质板CTIP2（绿色）。所有切片均用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺 = 140 µm，20倍放大。W 为周。E) 来自WTC hPSCs的10周龄和13周龄皮质脑类器官切片的代表性图像，经免疫染色显示皮质第IV层SATB2（绿色）。所有切片均用Hoechst 33342复染（蓝色）。10周图像比例尺 = 50 µm，40倍放大。13周图像 比例尺 = 150 µm，40倍放大。W 为周。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63714/63714fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="通过β-半乳糖苷酶染色结合CTIP2/p21荧光显微镜显示皮质类器官中的衰老现象。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63714/63714fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：利用人多能干细胞衍生的皮质脑类器官中衰老特征的表征 (A来自培养4周和13周的WTC人多能干细胞衍生的人类皮质脑类器官切片的代表性图像 体外 并用SA-β-gal染色。比例尺 = 500 µm，放大图像的标尺 = 250 µm，4倍放大。虚线框表示放大图像。B13周龄人EU79 hPSCs来源皮质脑类器官切片的代表性图像，经免疫染色标记皮质神经元CTIP2（绿色）和p21（红色）。所有切片均用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺 = 25 µm，放大图像的标尺 = 10 µm，40倍放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63714/63714fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养基成分</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 培养基（10x 500 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 补充剂 5 mL (100x)</td>
			<td>添加至终浓度 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 补充剂 10 mL</td>
			<td>添加至终浓度 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td>
			<td>添加至终浓度 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素溶液 (10,000 U/mL)</td>
			<td>添加至终浓度 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇 50 mL (1000x)</td>
			<td>添加至终浓度 0.1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：N2培养基。该表格列出了配制N2培养基所需的试剂。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养基成分</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 营养混合物 10x 500 mL (DMEM/F-12)</td>
			<td rowspan="2">DM 培养基由 DMEM/F12 与 Neurobasal 培养基按 1:1 比例配制</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 添加剂 5 mL (100x)</td>
			<td>添加浓度为 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 添加剂 10 mL</td>
			<td>添加浓度为 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td>
			<td>添加浓度为 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 添加剂 100x</td>
			<td>添加浓度为 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td>
			<td>添加浓度为 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人重组胰岛素溶液</td>
			<td>每 50 mL 培养基加入 12.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇 50 mL (1000x)</td>
			<td>每 50 mL 培养基加入 17.5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：分化培养基（DM）。 该表格列出了制备分化培养基所需的试剂。
补充视频 1. 在 bFGF 处理下诱导 hNEct 二维细胞层/克隆向三维结构转化的活体成像。按照上述方法，用 dispase 轻柔地将诱导生成的 hNEct 克隆从培养皿中分离，并转移至低吸附性 6 孔培养板中。hNEct 二维克隆在 12 小时内转化为 hNEct 三维球状体。每隔 5 分钟拍摄一次连续图像。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63714/Supplementary%20Video-1.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频</a>

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

脑类器官是发育中人脑的三维模型，为疾病建模提供了有力且前沿的研究平台，以及……

该方案解决了类器官生成过程中存在的若干关键问题，例如稳健性和可靠性，且我们已能将这些改进的类器官应用于神经元衰老的创新性研究。在生成皮质脑类器官时，异质性和可重复性是显著问题。为克服这些问题，我们首先将人多能干细胞（hPSCs）分化为神经外胚层样集落，随后形成神经上皮球体，从而获得可重复的组织结构。这些皮质脑类器官在长期的体外培养后开始表现出典型的衰老迹象，使其成为研究与衰老相关的神经元过程的有用平台。首先，将一个六孔板中一孔的hPSC集落以60%融合度接种到含hESC级基底膜基质的三个孔中，达到20%至30%的密度，随后进行二维神经外胚层集落的诱导。在接下来的三天中，每天向每孔加入新鲜的N2培养基，并补充双SMAD抑制剂。为了从诱导的二维神经外胚层克隆生成三维神经外胚层球体，从六孔板中移除两毫升 N2 培养基，并用 HBSS 洗涤一次，以确保完全去除所有 N2 培养基。向每个含有克隆的孔中加入一毫升 dispase。将培养板在 37 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟，并定期检查克隆是否脱落。孵育结束时，为终止dispase酶的活性，向孔中加入1毫升N2培养基。使用宽口P1000移液枪头或用无菌剪刀剪裁过的改良P1000移液枪头，将细胞集落转移至15毫升离心管中，并依靠重力使集落团块自然沉降至管底。随后，使用标准P1000移液枪头小心吸除上清液。加入一毫升新鲜的N2培养基，重复洗涤三次，以确保完全去除分散酶。将细胞团块与N2培养基重悬后，转移至六孔板中的一个孔，并添加40纳克/毫升的bFGF。对类器官进行冷冻切片后，将载玻片转移至带盖的染色缸中以去除多余的封片液，并用PBS在室温下洗涤切片后的类器官组织三次，每次10分钟。然后将切片与新配制的β-半乳糖苷酶染色液在37摄氏度下孵育过夜。用PBS在室温下清洗染色组织三次，每次10分钟，以去除β-半乳糖苷酶溶液。接着用玻璃防淬灭封片剂封片，并在室温下静置30分钟，使封片剂完全固化，然后在显微镜下观察。在神经外胚层分化之前，hPSC 克隆呈现紧密的扁平单层形态，克隆内无分化细胞污染。NANOG 的表达也证实了 hPSC 克隆的多能性。在 hPSC 克隆分化为神经外胚层克隆后，观察到更长的柱状形态，且 NANOG 表达呈阴性。经过中性蛋白酶处理并在 N2 培养基中暴露于 FGF2 后，这些类球体中的神经干细胞增殖并形成了大量神经玫瑰花环结构，通过类球体中心和外缘细胞表达 ZO1，显示出类球体的顶-基极性。一旦包埋，类球体迅速增殖并开始出芽，表现为致密组织结节的出现及其在 1 至 3 周内从主体向外扩展，定量分析进一步证实了这一现象，且类球体直径在三周内显著增加。免疫荧光染色证实类器官中存在神经前体细胞及皮层分层标志物，并呈现出清晰的分层结构，该特征在不同时间点均可观察到。还研究了神经元衰老相关过程对大脑的影响。随着时间推移，观察到衰老相关β-半乳糖苷酶的表达显著增加；在第13周时检测到p21的表达，这表明细胞进入衰老状态。必须确保彻底去除残留的dispase，并轻柔地分离和重新接种完整的神经外胚层克隆，以形成健康的球状体。该平台不仅为我们提供了研究人类大脑衰老生物学的独特机会，还允许开展关键的大脑发育研究，前提是这些类器官通过生物反应器进行培养。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

强大且高度可重复的皮质脑类器官生成，用于在体外模拟大脑神经元衰老

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

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生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本方案提供了由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的脑类器官可重复生成、维持及老化过程的逐步操作流程。该方法能够长期培养和成熟脑类器官，从而有助于模拟与脑老化及年龄相关疾病发生机制有关的生物学过程。...

用于衰老研究的iPSC衍生脑类器官长期培养的稳健组织制备技术

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

本文介绍一种高效冻存和复苏皮层脑组织块的方法，以建立高度富集的神经元培养物。该简单方案为后续建立神经元、星形胶质细胞及神经前体细胞培养提供了灵活性。...

皮质组织块的低温保存用于生成高度富集的神经元培养物

学习利用hPSC分化技术构建高度可重复的皮质脑类器官，用于在体外模拟大脑神经元衰老过程。该方法为研究人类脑发育及神经退行性疾病提供了可靠的实验平台。

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老体外

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稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

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