稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

该方案解决了类器官生成过程中存在的若干关键问题，例如稳健性和可靠性，且我们已能将这些改进的类器官应用于神经元衰老的创新性研究。在生成皮质脑类器官时，异质性和可重复性是显著问题。为克服这些问题，我们首先将人多能干细胞（hPSCs）分化为神经外胚层样集落，随后形成神经上皮球体，从而获得可重复的组织结构。

这些皮质脑类器官在长期的体外培养后开始表现出典型的衰老迹象，使其成为研究与衰老相关的神经元过程的有用平台。首先，将一个六孔板中一孔的hPSC集落以60%融合度接种到含hESC级基底膜基质的三个孔中，达到20%至30%的密度，随后进行二维神经外胚层集落的诱导。在接下来的三天中，每天向每孔加入新鲜的N2培养基，并补充双SMAD抑制剂。

为了从诱导的二维神经外胚层克隆生成三维神经外胚层球体，从六孔板中移除两毫升 N2 培养基，并用 HBSS 洗涤一次，以确保完全去除所有 N2 培养基。向每个含有克隆的孔中加入一毫升 dispase。将培养板在 37 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟，并定期检查克隆是否脱落。

孵育结束时，为终止dispase酶的活性，向孔中加入1毫升N2培养基。使用宽口P1000移液枪头或用无菌剪刀剪裁过的改良P1000移液枪头，将细胞集落转移至15毫升离心管中，并依靠重力使集落团块自然沉降至管底。随后，使用标准P1000移液枪头小心吸除上清液。

加入一毫升新鲜的N2培养基，重复洗涤三次，以确保完全去除分散酶。将细胞团块与N2培养基重悬后，转移至六孔板中的一个孔，并添加40纳克/毫升的bFGF。对类器官进行冷冻切片后，将载玻片转移至带盖的染色缸中以去除多余的封片液，并用PBS在室温下洗涤切片后的类器官组织三次，每次10分钟。

然后将切片与新配制的β-半乳糖苷酶染色液在37摄氏度下孵育过夜。用PBS在室温下清洗染色组织三次，每次10分钟，以去除β-半乳糖苷酶溶液。接着用玻璃防淬灭封片剂封片，并在室温下静置30分钟，使封片剂完全固化，然后在显微镜下观察。

在神经外胚层分化之前，hPSC 克隆呈现紧密的扁平单层形态，克隆内无分化细胞污染。NANOG 的表达也证实了 hPSC 克隆的多能性。在 hPSC 克隆分化为神经外胚层克隆后，观察到更长的柱状形态，且 NANOG 表达呈阴性。

经过中性蛋白酶处理并在 N2 培养基中暴露于 FGF2 后，这些类球体中的神经干细胞增殖并形成了大量神经玫瑰花环结构，通过类球体中心和外缘细胞表达 ZO1，显示出类球体的顶-基极性。一旦包埋，类球体迅速增殖并开始出芽，表现为致密组织结节的出现及其在 1 至 3 周内从主体向外扩展，定量分析进一步证实了这一现象，且类球体直径在三周内显著增加。免疫荧光染色证实类器官中存在神经前体细胞及皮层分层标志物，并呈现出清晰的分层结构，该特征在不同时间点均可观察到。

还研究了神经元衰老相关过程对大脑的影响。随着时间推移，观察到衰老相关β-半乳糖苷酶的表达显著增加；在第13周时检测到p21的表达，这表明细胞进入衰老状态。必须确保彻底去除残留的dispase，并轻柔地分离和重新接种完整的神经外胚层克隆，以形成健康的球状体。

该平台不仅为我们提供了研究人类大脑衰老生物学的独特机会，还允许开展关键的大脑发育研究，前提是这些类器官通过生物反应器进行培养。