骨骼肌中脂质液滴含量的纤维类型和亚细胞特异性分析
2022年6月8日
越来越多的证据表明，脂质在骨骼肌内的过度浸润会导致脂毒性和糖尿病。在这里，我们提出了一个完整的方案，包括组织处理，使用Bodypy染色，图像采集和分析，以纤维型特定方式量化脂质液滴的大小，密度和亚细胞分布。
该协议允许以纤维型特定方式定量脂质液滴并分析其形态和亚细胞分布。该技术可以同时处理不同的肌肉，节省时间并避免独立处理时可能发生的伪影。它还允许脂质液滴定量的自动化。
肌层沉积症在海洋肌肉中进行了评估，但该方案可以转化为不同条件下的人类，例如肥胖，衰老和癌症。在平行部分识别相同的纤维可能很困难，但轴突调整或肌肉纺锤体等显着结构是很好的里程碑，可以帮助研究人员在两张载玻片上找到相同的纤维。首先将肌肉标本的两个连续冷冻冷冻横截面放在两个预先标记的粘附载玻片上。
一张载玻片用于确定纤维类型，另一张载玻片用于量化脂质含量。对于肌肉纤维类型的免疫组化检测，用疏水笔绘制的轮廓包围切片。将其置于潮湿的腔室中，并在室温下用冰冷的0.1摩尔PBS冲洗一分钟。
接下来，取出PBS，将封闭溶液加入载玻片中，并在37摄氏度下孵育90分钟。然后取出封闭溶液，并将载玻片在37摄氏度下与含有一抗的溶液孵育90分钟。用PBS在室温下洗涤载玻片三次，每次五分钟。
加入含有二抗的溶液，并在室温下在黑暗中孵育载玻片一小时，然后确保载玻片远离光线，并在PBS中进行三次洗涤，每次洗涤五分钟，然后在双蒸馏水中冲洗载玻片，除去多余的水后，用抗淬灭试剂安装载玻片并将其储存在四摄氏度的避光状态。要用身体染色脂质液滴，请用疏水笔绘制的轮廓包围肌肉部分，然后用冰冷的0.1摩尔PBS冲洗10分钟。两张载玻片必须同时染色。
在室温下用冷的4%多聚甲醛固定切片，不含甲醇10分钟。第一次快速冲洗后，用PBS洗涤载玻片三次，持续五分钟。在PBS中用5%正常山羊血清在人腔室中阻断载玻片一小时。
然后用含有2%正常山羊血清和大鼠抗层粘连蛋白的一抗溶液在PBS中孵育载玻片90分钟。在PBS中洗涤载玻片三次后，在室温下与含有山羊，抗大鼠，Alexa Fluor 647抗体的二抗溶液在PBS中孵育一小时。确保幻灯片受到保护，不受光线照射。
孵育后，用PBS洗涤载玻片三次。接下来，用dapi和体液孵育该部分20分钟。快速冲洗后，用PBS洗涤三次，用双蒸馏水洗涤一次，然后除去多余的水并用抗褪色试剂安装切片。
扫描肌肉后，将捕获的数字图像上传到任何图像处理软件中进行重建。根据纤维形态和肌肉部分的组织学，以合适的格式保存图像，并合并所有通道。对于body图像观察和采集，设置共聚焦显微镜的参数，使用40 X油浸式物镜和1.4的数值孔径，如手稿中所述。
避免身体与558，568和层粘连蛋白Alexa Fluor 647之间的串扰;在共聚焦软件上使用顺序扫描模式。激发体体和493，503使用488纳米激光线或氩激光线，并且激发体体和555，568使用561纳米二极管激光线。最后，用640纳米二极管激光线检测层粘连蛋白Alexa Fluor 647，根据选择的染料，将发射速率设置为570至650纳米的bodpy和493，503。
在565到620纳米的body和558，568。将层粘连蛋白的发射范围设置为656至700纳米。接下来，适当地设置增益和数字增益，以避免在量程指示器上检测到饱和像素。
通过调整偏移来校正背景信号。要在共聚焦显微镜上识别纤维类型，请使用笔记本电脑，在该笔记本电脑上可以检查先前重建的具有纤维型免疫检测的载玻片的图像。一旦正确识别出一组纤维，就获取具有体皮和层粘连蛋白通道的图像。
在斐济的生物格式进口商的帮助下打开每个图像。在带有选项的视图堆栈下，选择超堆栈，然后选择颜色模式和默认值。确保已选择自动缩放窗口。
使用自由手选择工具，根据层粘连蛋白通道手动选择纤维的肌层。然后按键盘上的 T 键，在 ROI 窗口中记录感兴趣的区域。转到斐济的主窗口，然后单击"分析"并设置测量值。
然后在弹出窗口中选择区域，对于凸起的直径，将其余框保留为未选中状态，而其他参数则默认显示。单击ROI窗口上的测量值，以获得所选光纤的面积和最小直径，并记下它们以供以后使用。计算凸起直径的最小值的六分之一，以限定纤维的中心部分。
单击 ROI 窗口，单击添加以复制第一个 ROI，然后选择窗口上显示的第二个 ROI。在斐济的主窗口中，单击编辑，然后选择并放大。要介绍先前计算的值，请在数字前加一个减号，然后单击"确定"。
在 ROI 窗口中，单击添加，必须显示第三个 ROI，然后删除以删除第二个 ROI。在 ROI 窗口中，选择两个 ROI，然后单击更多 ZOR 并添加，等待出现与光纤外围相对应的第三个 ROI。如果需要重新分析相同的光纤，请通过单击更多来保存ROI，然后保存。
选择body频道，然后单击斐济主窗口中的图像，调整和阈值选项卡打开阈值工具。在阈值弹出窗口中，将值设置为 70 和 255。然后选择日元和黑白方法。
在单击深色背景之前。最后点击应用选项卡。转到斐济的主窗口，然后单击"分析"并设置测量值。
在弹出窗口中，选择面积，面积分数和阈值限制。将其余框和参数保留为默认值。转到 ROI 窗口，然后选择第一个 ROI。
在斐济的主窗口中，单击分析，然后分析粒子工具。在分析的粒子窗口中，将值设置为从 2 到无穷大的值，然后选中像素框。保持默认的圆度值，并在单击"确定"之前选择"汇总"。
要获得光纤的中心和外围的值，请每次重复选择第二个和第三个ROI。然后通过单击文件保存结果，然后在摘要窗口中另存为。在文件名中包含光纤类型。
这种免疫组织化学方案允许识别小鼠，慢氧化纤维，如1型和2A型，快速糖酵解纤维，如2X型和2B型，以及杂交纤维的存在。通过测量肌肉纤维的面积和最小值，施加尺寸依赖性减小以获得每根纤维的中心和外围区域。每个肌肉部分的显着结构，如轴突树枝或肌肉纺锤体，都是很好的地标，可以帮助定位两侧的相同纤维。
所描述的通过共聚焦显微镜检查获取体皮层粘连蛋白染色的设置。允许同时对三到六根纤维的脂质液滴的大小、数量和分布进行可视化和分析。该方法还允许量化三个重要参数，即脂质液滴占据的纤维面积百分比，密度和脂质液滴的平均大小。
不正确的冷冻程序和未能达到正确的异戊烷温度导致肌肉纤维内部形成冰晶。当切片未横向对齐时，无法进行纤维，肌肉或动物之间的脂质液滴定量和比较。第二张幻灯片的处理必须与第一张幻灯片同时进行。
冷冻切片后空气干燥载玻片15分钟将显着减小脂质液滴的大小和数量。Bodipy可用于研究脂质液滴与其他亚细胞器的相互作用，或具有不同光谱荧光的蛋白质堆栈，或与转基因GFP模型的相互作用。据报道，肌层沉积是几种疾病的不良预后因素。
因此，该技术可用于监测疾病的进展或评估治疗的效果。
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概述
该协议允许以特定纤维类型的方式对脂质滴进行定量分析并进行其形态学分析。它可以同时处理不同的肌肉样本，减少时间和潜在的人为误差。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 肌肉生理学
背景
- 骨骼肌中过度的脂质渗入可能导致脂质毒性和糖尿病。
- 肌肉脂肪变性可以在各种类型的肌肉中进行评估。
- 该协议可以适用于肥胖和癌症等人类研究。
- 在并行切片中识别相同的肌纤维可能具有挑战性。
研究目的
- 量化肌纤维中脂质滴的大小和密度。
- 分析脂质滴的亚细胞分布。
- 自动化定量过程以提高效率。
使用的方法
- 处理冷冻肌肉切片。
- 使用Bodipy染色以可视化脂质。
- 获取图像以进行分析。
- 对不同类型的肌肉进行脂质滴的定量分析。
主要结果
- 展示了一种特定纤维类型分析脂质滴的方法。
- 显示了同时处理肌肉样本的有效性。
- 提供了肌肉组织中脂质滴形态学的见解。
- 确定了在串联切片中定位纤维的标志物。
结论
- 该协议对研究肌肉中的脂质滴动力学是高效的。
- 它可以应用于各种研究背景，包括人类健康。
- 未来的研究可以在此方法的基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of lipid droplet content and morphology in skeletal muscle fibers enables mechanistic de-risking of metabolic and muscle-related disease models. This protocol supports predictive confidence in target validation by distinguishing fiber-type specific lipid dynamics, which are critical for translational research in obesity, aging, and related pathologies. The approach enhances portfolio decision-making by providing standardized, reproducible data on subcellular lipid distribution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of lipid metabolism pathways in disease-relevant muscle systems.
- Supports functional target validation by quantifying fiber-type specific lipid accumulation.
- Facilitates mechanistic de-risking for metabolic and muscle degeneration targets.
- Provides standardized outputs for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated muscle tissue systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative lipid droplet measurements for assay standardization.
- Enables scalable, automated analysis using image processing macros.
- Supports reliable evaluation of interventions targeting lipid metabolism.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of metabolic endpoints.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in metabolic and muscle disease pipelines.
- Enables monitoring of disease progression or treatment effects in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting lead identification and translational continuity in metabolic and muscle disease programs.
- Discovery Biology: Quantifies lipid droplet content and distribution to clarify metabolic pathway involvement.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible measurements for compound evaluation.
- Analytics: Outputs include fiber area, lipid droplet density, and size for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment with disease progression and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol and automation facilitate cross-study and cross-team adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metabolic research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable lipid quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and muscle disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle histology and confocal imaging.
- Needs access to cryosectioning, immunofluorescence, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible data generation.
- Adaptable to various model systems, including human and animal tissues.
- Dependent on precise sample handling to avoid artifacts and ensure data integrity.
