Name: 骨骼肌中脂质液滴含量的纤维类型和亚细胞特异性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学习使用Bodipy染色和共聚焦显微镜技术定量分析骨骼肌中脂质液滴的形态和亚细胞分布。该方法支持纤维类型特异性研究，可应用于肥胖、衰老和癌症等人类疾病研究。

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本工作由以下基金资助： 比利时科学基金会 （FNRS-研究信贷 J.0022.20）以及 法国糖尿病学会 （SFD-罗氏糖尿病护理）。C.M.S. 获得了比利时法语区基础研究基金会（FRIA，FNRS）的博士奖学金。M.A.D.-L.d.C. 获得了瓦隆-布鲁塞尔国际卓越计划的奖学金。
作者感谢Alice Monnier在本实验方案开发过程中的贡献，以及Caroline Bouzin在图像采集过程中提供的专业知识和技术帮助。我们还感谢2IP-IREC成像平台提供切片机和显微镜的使用权限（2IP-IREC成像平台，实验与临床研究中心，天主教鲁汶大学，比利时布鲁塞尔1200）。最后，作者感谢Nicolas Dubuisson、Romain Versele和Michel Abou-Samra对稿件提出的建设性批评意见。本文部分插图使用BioRender.com制作。

作者声明无利益冲突。

本文所述方案介绍了一种在纤维类型和亚细胞特异性基础上定量标记Bodipy的脂滴（LDs）的高效方法。近年来，传统的脂质染料（如油红O或苏丹黑B）已被一系列新型细胞通透性、亲脂性荧光染料所取代，这些染料可结合中性脂质（例如Bodipy）。Bodipy以不同偶联形式提供，已被证实可高效标记脂滴，用于研究其形态、动态变化以及与其他细胞器的相互作用，不仅适用于多种固定组织和细胞23,38,39,40，也适用于活细胞41,42。
在该实验方案中，研究人员必须考虑若干关键因素，以获得最佳结果。必须将选定的肌肉正确放置在软木上，以确保肌纤维的完美对齐和方向，因为一旦冷冻，切片机上的样品托只能进行轻微调整。此外，切片完成后应立即...

骨骼肌中的脂质浸润被称为肌内脂肪变性（myosteatosis），其程度随肥胖和衰老而增加。肌内脂肪变性与肌肉质量、肌肉力量以及胰岛素敏感性呈负相关1。此外，近期研究表明，肌内脂肪变性的程度可作为心血管疾病2、非酒精性脂肪性肝病3或癌症4等其他疾病的预后因素。脂质可在骨骼肌纤维之间以细胞外肌脂（extramyocellular lipids）的形式积聚，也可在肌纤维内部以细胞内肌脂（intramyocellular lipids, IMCLs）的形式储存。IMCLs主要以甘油三酯的形式储存在脂滴（lipid droplets, LDs）中，在运动过程中作为代谢燃料被利用5,6。然而，当脂质供应超过需求，或线粒体功能受损时，IMCLs会参与导致肌肉胰岛素抵抗，这在代谢不健康的肥胖个体及2型糖尿病患者中可见7。有趣的是，耐力运动员体内的IMCLs水平与2型糖尿病肥胖患者相似甚至更高，却仍保持较高的胰岛素敏感性。这一现象被称为“运动员悖论”（athlete's paradox）8,9，其解释在于对肌肉脂滴更为细致的理解，包括其大小、密度、定位、动态变化以及脂质种类的组成。
首先，脂滴大小与胰岛素敏感性和身体素质呈负相关10,11事实上，较小的脂滴具有相对更大的表面积供脂肪酶作用，因此可能具有更强的脂质动员能力。12其次，脂滴密度（数量/表面积）在胰岛素作用中具有争议性的作用8,10然而，在运动员中似乎有所增加。第三，脂滴的亚细胞定位非常重要，因为位于细胞膜下方（肌膜下或外周）的脂滴对胰岛素敏感性的不利影响大于中心区域的脂滴8,9,13后者为中枢线粒体提供燃料，这些线粒体具有更高的呼吸活性，更专精于满足收缩过程所需的高能量需求14相比之下，外周脂滴为肌膜下线粒体提供能量，这些线粒体参与膜相关过程8最后，除了甘油三酯外，肌肉中某些特定的复杂脂质可能比其他脂质更具危害性。例如，当甘油三酯周转率较低时，二酰基甘油、长链脂酰辅酶A和神经酰胺可能在肌肉中积聚，从而损害胰岛素信号传导。9,15回到“运动员悖论”，耐力运动员的I型（氧化型）肌纤维中含有数量较多但体积较小的中心脂滴，且其周转率较高；而肥胖和糖尿病患者的II型（糖酵解型）肌纤维中则含有体积较大但周转率较低的周边脂滴。8,15,16除了在能量储存和释放中的作用外，脂滴（LDs） 通过 衍生脂肪酸（FA）和一种包被蛋白（perilipin 5）也可作为脂肪酸氧化和线粒体生物发生转录调控中的关键参与者8由于脂滴在生理学和病理生理学中具有至关重要的意义，因此有必要深入研究其动态变化与功能。
尽管存在多种研究IMCL的方法，但并非所有技术都适用于准确量化特定肌纤维中脂滴（LD）的大小、密度和分布。例如，磁共振波谱法虽然具有非侵入性，但其分辨率不足以研究脂滴在肌纤维内的大小和精确定位，且无法区分肌纤维类型17,18。同样，对整块肌肉匀浆进行的生化技术19也无法评估脂质的位置和大小。因此，分析脂滴形态和位置最适宜的方法是定量透射电子显微镜13，但该技术成本高且耗时。因此，使用如油红O（ORO）20,21、单丹磺酰戊烷（MDH）22或Bodipy23,24,25等染料对样本进行共聚焦荧光成像，已成为此类研究的最佳工具。
本文描述了一套完整的实验方案，包括组织取样与处理、Bodipy染色，以及共聚焦图像的采集与分析，用于定量小鼠肌肉冷冻切片中脂滴（LD）的大小、数量和定位。由于肌内脂滴（IMCL）在氧化型和糖酵解型肌纤维间的分布并不均匀，且不同类型的肌纤维对脂滴动态的调控机制各异，因此对IMCL的研究必须基于肌纤维类型进行16,25,26,27。为此，本方案采用连续切片上的免疫荧光染色来鉴定每根肌纤维所表达的肌球蛋白重链（MyHC）同工型。该方案的另一优势在于，可在冷冻前将一块糖酵解型肌肉（趾长伸肌，EDL）与一块氧化型肌肉（比目鱼肌）并排放置，同时进行处理（图1）。这种同步处理方式不仅节省时间，还可避免因样品单独处理而带来的实验变异性。
<img alt="组织制备、冷冻切片及显微镜分析的实验方案示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验流程示意图。 肌肉解剖（1）后，选取大小相近的肌肉进行共同制备和冷冻（2）。使用冷冻切片机获取10 µm的连续横切面，并直接贴附于黏附载玻片上（3）。从两张连续切片中，第一张（4A）用层粘连蛋白进行免疫标记，并用Bodipy染色以识别脂滴（LDs），第二张（4B）则使用抗肌球蛋白重链同工型（MyHCs）抗体进行免疫染色，以识别肌纤维类型。采用共聚焦显微镜采集Bodipy信号图像（5A），采用落射荧光显微镜采集肌纤维类型图像（5B）。在Fiji软件中对图像进行分析，通过设定阈值并量化颗粒（6A），获得脂滴的数量、平均大小、密度以及占总区域的百分比（7）；或通过细胞计数（6B）获得切片中各类肌纤维所占的百分比（7）。缩写：LDs = 脂滴；EDL = 拇长伸肌；MyHCs = 肌球蛋白重链同工型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono 6 Mpix 相机</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1.4MPix CCD 相机&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>Potteau Labo</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>软木圆片（&amp;oslash; 20 mm，厚 3 mm）&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>低温手套</td><td>Tempshield</td><td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>解剖体视显微镜 SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>F.S.T</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>超细 Bonn 剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand 一次性底座模具（0.7 × 0.7 cm）</td><td>ThermoFisher</td><td>22-363-552</td><td>用于切割一块材料以将肌肉固定在软木上进行冷冻</td></tr><tr><td>玻璃培养皿（高 25&amp;nbsp;mm，&amp;oslash; 150&amp;nbsp;mm）</td><td>BRAND 培养皿，MERK</td><td>BR455751</td><td>用于在解剖过程中将肌肉置于冰上</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>用于在肌肉切片周围创建疏水屏障</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（24×50 mm）</td><td>Assistent&amp;nbsp;</td><td>40990151</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片盒&amp;nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>用作免疫组织化学的湿盒</td></tr><tr><td>颈部固定器</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>用作固定不锈钢杯的带子</td></tr><tr><td>15 号无菌碳钢手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>用于处理冷冻切片</td></tr><tr><td>永久性黑色记号笔</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>用于标记载玻片</td></tr><tr><td>Pierce 固定镊子</td><td>F.S.T</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯箱&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>高 12 cm × 长 25 cm × 宽 18 cm，用作液氮容器并用于将样品运送至冷冻切片机</td></tr><tr><td>手术刀柄，125 mm（5&quot;），3 号</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢杯 10oz&amp;nbsp;</td><td>Eboxer</td><td>B07GFCBPFH</td><td>用于盛装异戊烷以冷冻肌肉</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 载玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>外科镊子，1/2 齿</td><td>Medische Vakhandel</td><td>1303152</td><td>也称为 &quot;大鼠齿镊子&quot;</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>VWR international</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>荧光全切片扫描仪</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 山羊抗小鼠 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>最终使用浓度为 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21121</td><td>最终使用浓度为 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgM</td><td>Abcam</td><td>ab175702</td><td>最终使用浓度为 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td>最终使用浓度为 1:500</td></tr><tr><td>BODIPY-493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并）</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>最终使用浓度为 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>BODIPY-558/568 C12（4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并-3-十二烷酸）</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>最终使用浓度为 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>最终使用浓度为 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>用于溶解 BODIPY 以配制 1 mg/mL 储存液。&lt;strong&gt;注意&lt;/strong&gt;：有毒且易燃。蒸气可能引起刺激。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液，缓冲，pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004969011</td><td>&lt;strong&gt;注意&lt;/strong&gt;：可能引起过敏性皮肤反应。怀疑可导致遗传缺陷。可能致癌。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>异戊烷 GPR RectaPur</td><td>VWR international</td><td>24872.298</td><td>&lt;strong&gt;注意&lt;/strong&gt;：极度易燃液体和蒸气。吞咽并进入呼吸道可能致命。可能引起嗜睡或头晕。反复接触可能导致皮肤干燥或开裂。应佩戴防护手套/防护服/护目镜/面部防护。</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;注意&lt;/strong&gt;：&amp;nbsp; 极度低温。应佩戴手套。操作时应缓慢，以减少沸腾和飞溅，并在通风良好的区域进行。应使用专为低温液体设计的容器。</td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠封闭试剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td><td>使用浓度为 1:30</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链 I 型（BA-D5-s 一抗），基因：MYH7，单克隆牛抗小鼠 IgG2b</td><td>DSHB 爱荷华大学</td><td>BA-D5-上清液</td><td>最终使用浓度为 1:10</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链 IIA 型（SC-71-s 一抗），基因：&amp;nbsp; MYH2，单克隆牛抗小鼠 IgG1</td><td>DSHB 爱荷华大学</td><td>SC-71-上清液</td><td>最终使用浓度为 1:10</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链 IIX 型（6H1-s 一抗），基因：&amp;nbsp; MYH1，单克隆兔抗小鼠 IgM</td><td>发育研究杂交瘤库，爱荷华大学</td><td>6H1-上清液</td><td>最终使用浓度为 1:5</td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1 M</td><td></td><td></td><td>组织学实验室常用</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗层粘连蛋白-2（&amp;alpha;-2 链）一抗（单克隆）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>最终使用浓度为 1:1,000</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>用于设计图像</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>共聚焦软件</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td><td>用于设计图像</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td><td>用于分析获取的图像</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft</td><td></td><td>用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像</td></tr><tr><td>Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像</td></tr></tbody></table>

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

骨骼肌脂肪浸润，即肌内脂肪变性（myosteatosis），随着肥胖和衰老而增加。最近研究发现，肌内脂肪变性也是多种其他疾病（如心血管疾病和癌症）的不良预后因素。过度的脂肪浸润会减少肌肉质量和力量，并可能导致脂毒性及胰岛素抵抗，其程度取决于肌细胞内总脂质含量、脂滴（LD）形态以及亚细胞分布。肌纤维类型（氧化型与糖酵解型）也具有重要作用，因为氧化型纤维具有更强的脂质利用能力。鉴于其在病理生理过程中的关键意义，有必要针对不同肌纤维类型深入开展对脂滴动态变化及其功能的深入研究。
本文提供了一种完整的实验方案，用于定量分析肌细胞内脂质含量，并以肌纤维类型特异性的方式对脂滴（LD）的形态及亚细胞分布进行分析。为此，采用荧光染料Bodipy及针对肌球蛋白重链同工型的抗体对连续肌肉冷冻切片进行染色。该方案可同时处理不同肌肉样本，节省时间并避免潜在的人为假象；同时，借助Fiji软件中自定义宏的创建，还可实现脂滴分析的自动化。

本文所述方案提供了一种高效的方法，可轻松地以肌纤维类型和亚细胞特异性的方式定量脂滴（LDs）。该方法表明，通过将两块大小相似的肌肉（如趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌）一同冷冻，后续步骤所耗费的时间和资源可减少一半。
本文提供了针对成年小鼠肌肉中表达的不同MyHC同工型进行免疫染色、图像采集和分析的完整实验方案。该方案基于Schiaffino等人于1989年首次设计的方法33，并进行了若干调整，例如增加了一种用于标记层粘连蛋白的抗体。这一后续改进对于识别IIb型肌纤维尤为关键，因为此类纤维未被任何抗体染色，呈现黑色。如图5所示，该免疫组织化学方案不仅能够区分小鼠的慢收缩-氧化型（I型和IIa型）与快收缩-糖酵解型（IIx型和IIb型）肌纤维，还能识别出混合型肌纤维（见图5D中的星号标记）。此外，将两种肌肉的横切面置于同一张载玻片上，可实现对所选两种肌肉中各类肌纤维比例的直接...

越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy 染色、图像采集和分析，以按肌纤维类型特异性地定量脂滴的大小、密度及亚细胞分布情况。

骨骼肌脂质浸润，即肌少脂变（myosteatosis），随肥胖和衰老而增加。近年来，肌少脂变还被发现是一种负面……

本方案可实现对脂滴的定量分析，并以肌纤维类型特异性的方式对其形态和亚细胞分布进行研究。该技术能够同时处理不同肌肉样本，节省时间，并避免单独处理时可能产生的假象。此外，该方法还允许对脂滴进行自动化定量。在骨骼肌中评估了肌内脂肪变性，但该方案也可应用于不同状况下的人体组织，例如肥胖、衰老和癌症。在连续切片中识别相同的肌纤维可能较为困难，但一些显著的结构，如轴突扭曲或肌梭，可作为良好的解剖标志，帮助研究人员在两张切片上定位相同的肌纤维。首先，将肌肉样本的两张连续冷冻横切片分别置于两张预先标记的黏附载玻片上。一张切片用于确定纤维类型，另一张用于定量脂质含量。进行肌肉纤维类型的免疫组织化学检测时，用疏水笔在切片周围画出轮廓。将其置于湿盒中，于室温下用冰冷的0.1摩尔PBS冲洗1分钟。接着，移除 PBS，向切片中加入封闭液，在 37 摄氏度孵育 90 分钟。随后去除封闭液，加入含一抗的溶液，在 37 摄氏度孵育切片 90 分钟。在室温下用 PBS 洗涤切片三次，每次五分钟。加入含二抗的溶液，在室温下避光孵育切片一小时，之后确保将切片远离光线，并用 PBS 洗涤三次，每次五分钟，然后用双蒸水冲洗切片，除去多余水分后，用抗荧光淬灭剂封片，并于 4°C 避光保存。使用 Bodipy 染色脂滴时，先用疏水笔在肌肉切片周围画出轮廓，再用冰浴的 0.1 摩尔 PBS 冲洗 10 分钟。两张切片必须同时进行染色。用不含甲醇的4%冷多聚甲醛在室温下固定切片10分钟。初次快速漂洗后，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。在湿盒中用含5%正常山羊血清的PBS封闭载玻片1小时。随后将载玻片与含2%正常山羊血清和大鼠抗层粘连蛋白抗体的PBS溶液在室温下孵育90分钟。PBS洗涤载玻片三次后，加入含山羊抗大鼠Alexa Fluor 647抗体的PBS二抗溶液，室温避光孵育1小时。确保孵育过程中载玻片避光。孵育后，用 PBS 洗涤载玻片三次。接着，将切片与 DAPI 和 BODIPY 溶液共同孵育 20 分钟。快速漂洗后，用 PBS 洗涤三次，再用双蒸水洗涤一次，然后除去多余水分，使用抗荧光淬灭试剂封片。完成肌肉扫描后，将采集的数字图像上传至任意图像处理软件进行重建。根据肌纤维形态及肌肉切片的组织学特征，将图像以合适格式保存，并合并所有通道。对于Bodipy图像的观察与采集，按照文中所述，设置共聚焦显微镜参数，使用40倍油镜物镜，数值孔径为1.4。为避免Bodipy与558、568以及层粘连蛋白Alexa Fluor 647之间的串色，请在共聚焦软件中使用顺序扫描模式。使用488纳米激光线或氩离子激光线激发Bodipy 493、503，使用561纳米二极管激光线激发Bodipy 555、568。最后，使用640纳米二极管激光线检测层粘连蛋白Alexa Fluor 647。根据所选染料，将Bodipy 493、503的发射波长范围设置为570至650纳米。对于Bodipy，在565至620纳米范围内设置发射波长，对于558和568则设置为558、568。将层粘连蛋白（laminin）的发射范围设置为656至700纳米。接下来，适当调节增益和数字增益，以避免在范围指示器上检测到饱和像素。通过调整偏移量来校正背景信号。为了在共聚焦显微镜下识别纤维类型，使用笔记本电脑查看先前重建的载玻片图像，该图像包含纤维类型的免疫检测结果。一旦正确识别出一组纤维，即用Bodipy和层粘连蛋白通道采集图像。使用 Fiji 的 Bio-Formats 导入器打开每张图像。在视图堆栈中选择“超堆栈”选项，然后选择颜色模式为默认。确保已选中自动缩放窗口。使用自由选择工具，根据层粘连蛋白通道手动选择纤维的肌膜。然后按键盘上的 T 键，在 ROI 窗口中记录感兴趣区域。转到 Fiji 主窗口，点击分析并设置测量参数。然后在弹出窗口中选择区域，并针对突起直径保留其余复选框未选中状态，其他参数保持默认设置。在 ROI 窗口中点击“测量”，以获取所选纤维的面积和突起直径的最小值，并记录这些数值以供后续使用。计算突起直径最小值的六分之一，以界定纤维的中心部分。单击 ROI 窗口，然后单击“添加”以复制第一个 ROI，并选择窗口中出现的第二个 ROI。在 Fiji 主窗口中，单击“编辑”，然后选择“选区”和“扩大”。输入先前计算的数值，数值前加上负号，然后单击“确定”。在 ROI 窗口中，单击“添加”，此时将出现第三个 ROI，然后单击“删除”以移除第二个 ROI。在 ROI 窗口中选择前两个 ROI，然后单击“更多”，选择“ZOR”并单击“添加”，等待出现第三个 ROI，该 ROI 对应于纤维的周边区域。如果需要对相同的纤维重新分析，请单击“更多”后选择“保存”，以保存 ROI。选择 bodipy 通道，通过点击 Fiji 主窗口中的图像、调整和阈值标签，打开阈值工具。在阈值弹出窗口中，将数值设置为 70 和 255。然后选择 YEN 和黑白方法。在点击深色背景之前，最后点击应用标签。转到 Fiji 的主窗口，点击分析并设置测量选项。在弹出窗口中，选择区域、区域分数并限制为阈值。其余选项和参数保持默认设置。转到 ROI 窗口并选择第一个 ROI。在 Fiji 的主窗口中，点击“analyze”（分析），然后选择“analyze particles”（分析颗粒）工具。在“analyzed particles”（分析颗粒）窗口中，将数值范围设置为从 2 到无穷大，并勾选“pixels”（像素）复选框。保持默认的圆形度值，并在点击“okay”（确定）前选择“summarize”（汇总）。为了获取纤维中心和边缘的数值，每次重复选择第二个和第三个 ROI。然后在汇总窗口中点击文件，再点击另存为以保存结果。在文件名中包含纤维的类型。该免疫组织化学实验方案可用于识别小鼠骨骼肌中的慢收缩氧化型肌纤维（如Ⅰ型和ⅡA型）、快收缩糖酵解型肌纤维（如ⅡX型和ⅡB型），以及杂交型肌纤维的存在。通过测量肌纤维的横截面积和最小外径，采用基于尺寸的校正方法，以确定每根肌纤维的中心区域和周边区域。每块肌肉切片中的显著结构，例如轴突细支或肌梭，可作为良好的解剖标志，有助于在两侧切片上定位同一根肌纤维。通过共聚焦显微镜获取 bodipy 标记层粘连蛋白染色的设置条件。允许同时对三至六条肌纤维中的脂滴大小、数量和分布进行可视化观察与分析。该方法还可用于量化三个重要参数，即脂滴所占肌纤维面积的百分比、脂滴密度以及脂滴的平均大小。不正确的冷冻程序以及异戊烷温度未达到理想状态，会导致肌纤维内部形成冰晶。若切片未保持横断面方向，则无法在肌纤维、肌肉或动物之间进行脂滴定量与比较。第二张载玻片的处理必须与第一张同时进行。冷冻切片后将载玻片空气干燥15分钟，可显著减少脂滴的大小和数量。Bodipy可用于研究脂滴与其他亚细胞器的相互作用，或与不同荧光光谱的蛋白共定位，或与基因修饰的GFP模型结合使用。肌内脂肪变性已被报道为多种疾病的不良预后因素。因此，该技术可用于监测疾病的进展或评估治疗效果。

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医学

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本方案展示了如何从冻干的人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并利用点印迹技术根据肌球蛋白重链（MHC）同工型进行纤维类型分类。鉴定出的MHC...

人类骨骼肌纤维类型鉴定

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

学习使用Bodipy染色和共聚焦显微镜技术定量分析骨骼肌中脂质液滴的形态和亚细胞分布。该方法支持纤维类型特异性研究，可应用于肥胖、衰老和癌症等人类疾病研究。

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

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