Name: 使用MALDI-TOF质谱法鉴定酶降解产生的RNA片段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习使用MALDI-TOF质谱法鉴定酶降解产生的RNA片段，该方法适用于体外生化反应研究，仅需微量样品即可完成分析，操作简便且可广泛应用于DNA、RNA及蛋白质等生物大分子的表征研究。

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需要指出的是，本研究是三家机构、两个研究团队以及一个核心设施共同合作完成的。具体分工与工作分配如下：蛋白质（Xrn-1）的表达在丹佛大学（科罗拉多州丹佛市）完成；寡核苷酸的合成、定量及实验操作（主要是酶促降解）在科罗拉多大学丹佛分校（科罗拉多州丹佛市）进行，优化工作也在此完成；MALDI-TOF点样、数据采集与分析则在科罗拉多州立大学分析资源核心设施（科罗拉多州福特柯林斯市）完成。SS感谢获得了科罗拉多大学丹佛分校的UROP奖和Eureca资助项目的支持。E. G. C. 感谢美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）提供的资助支持。 通过 R00GM115757。MJER 承认获得 NIGMS 的支持， 通过 1R15GM132816。K. B. 感谢亨利·德雷福斯基金会（Henry Dreyfus Foundation）提供的教师学者奖（Teacher-Scholar Award，MJER，TH-21-028）以及资源编号：SCR_021758 的支持。

本研究使用无RNase的超纯水（表1）。
1. RNA 溶液浓度测定
<ol>
	<li>按照以下步骤制备RNA样品。
	<ol>
		<li>使用微量离心管（0.6 mL）通过稀释1 µL储存液（获得的）来制备RNA溶液 通过 固相合成19 加入159 µL无RN酶的H2O. 用移液器反复吹打混合液 10 次以混匀溶液。 
		注意：由于市面上有多种比色皿可供选择，所需体积可能有所不同。本研究中使用的是光程为1 cm、样品体积较小（150 µL）的比色皿。</li>
		<li>用甲醇冲洗紫外-可见光谱比色皿（2次），随后用超纯水冲洗2O，3次，参见 材料表). 使用氮气流彻底干燥比色皿。</li>
		<li>使用移液器将溶液（步骤1.1.1）转移至比色皿中，确保无气泡产生。盖上比色皿盖，置于一旁备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计测定所制备RNA溶液的浓度。
	<ol>
		<li>打开仪器背面的开关以启动紫外-可见分光光度计。等待仪器完成启动程序，然后点击 UV WinLab 打开仪器操作/控制窗口的图标。</li>
		<li>打开 帕尔帖温度控制器 使用位于仪器右侧的开关打开分光光度计。</li>
		<li>下 基础方法，点击 扫描 - Lambda 365. 另一个界面将打开，并提示用户确保细胞架为空。点击 好的 并让仪器执行系统检查。系统将显示一系列检查项目，请确保所有项目均通过 &#34;通过&#34; 并点击 好的. 
		注意：建议按照提供的顺序执行步骤 1.2.1–1.2.3；更改此操作顺序可能导致软件故障。</li>
		<li>调整扫描参数，方法是选择 数据采集. 在新窗口的下方 扫描设置 改变 开始 到 350 nm 和 结束 到 215 nm.</li>
		<li>通过选择激活帕尔帖装置 + 在左侧 附属装置. 点击 多细胞帕尔帖装置，更换 温度 °C 到 25，然后点击 帕尔帖开启.</li>
		<li>导航至 样本信息 按 Tab 键，然后根据需要输入样本数量、名称和细胞位置。</li>
		<li>点击 自动归零 插入含有背景溶液的比色皿，并确保将其置于将要进行测量的同一插槽中。</li>
		<li>点击 开始 并将比色皿（步骤 1.1.3）插入目标样品池中，确保比色皿的透光面与仪器前表面平行。点击 好的 从25 °C开始进行第一次扫描。</li>
		<li>对于较高温度下的测量，重复步骤 1.2.5–1.2.8，并将温度调整至所需的样品温度（本实验中为 90 °C）。</li>
		<li>点击 文件 &#62; 导出 并选择所需的文件保存位置。选择 XY 数据 以获取一个 .txt 文件。 
		注意：步骤 1.2 的图示说明可参见 补充文件 1 (S1-S7)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行数据采集以测定RNA浓度。
	<ol>
		<li>在以下位置找到每个光谱对应的文件 结果 标签。要获得吸光度，将光标悬停在线条上，定位至260 nm处，记录显示的吸光度值。或者，通过 文件 &#62; 导出 级联，将数据导出为 .txt 文件，以便使用其他绘图软件进行进一步的图形分析。 
		注意：如果 0.1 &#60; A ≥ 1 时，需稀释或提高步骤 1.1.1 中制备的 RNA 样品浓度。</li>
		<li>利用比尔-朗伯定律计算溶液的浓度。 
		注意：比尔定律：A = εcl，其中： 
		A:&#160;吸光度（此处为步骤 1.3.1 中 260 nm 处的吸光度） 
		ε：消光系数。对于本实验所用序列，为 208,000 L mol-1cm-1 是从 OligoAnalyzer 工具获得的值。 
		l光程，1 cm 
		c样品浓度</li>
		<li>使用这些计算来配制适用于后续实验的所需RNA溶液。本研究中使用了[RNA] = 200 µM的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Xrn-1 介导的 RNA 寡核苷酸水解
<ol>
	<li>按照以下步骤对RNA进行5'端磷酸化。
	<ol>
		<li>使用一个0.6 mL的微量离心管配制以下溶液（总体积为50 µL）。
		<ol>
			<li>加入无RN酶的H2O（33.5 µL）；体积可根据[RNA]浓度调整。</li>
			<li>然后，加入溶液A（5 L， 表1).</li>
			<li>加入三磷酸腺苷（ATP）的水溶液（参见 材料表)（6 L，10 mM，60 nmol）。</li>
			<li>加入RNA水溶液（1 µL，200 µM，200 pmol）。</li>
			<li>加入多核苷酸激酶（PNK酶，参见 材料表）溶液（4.5 L，45 单位）。用移液器轻轻吹打混合 10 次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将反应混合物置于37 °C水浴中孵育45分钟。</li>
		<li>将反应管放入预热的金属浴（65 °C）中，孵育溶液10分钟以灭活酶。</li>
		<li>让溶液冷却至室温（RNA磷酸化反应已表征 通过 MALDI-TOF 分析，参见代表性结果），得到终浓度为 4 µM 的 50 µL 5'-磷酸化 RNA 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤使用Xrn-1进行RNA水解。
	<ol>
		<li>使用步骤 2.1.4 中的溶液（50 µL），进行以下操作。
		<ol>
			<li>加入溶液B（5 L， 表1).</li>
			<li>加入 Xrn-1 溶液（0.5 L，1 ng，30 fmol），轻轻吹打混匀（10 次）。</li>
			<li>将反应管在室温下孵育2小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将反应混合物（步骤 2.2.1.3）转移至一个孔径为 10 kDa 的离心过滤装置中（参见 材料表），并通过离心（700 × g）过滤酶液 g 室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将滤液转移至0.6 mL离心管中。</li>
		<li>用无RNase的H2O冲洗离心管中的残留RNA（步骤2.2.2）。2O（20 L），随后进行离心（700 × g 室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将滤液与步骤 2.2.3 中获得的滤液合并。</li>
		<li>将含有终产物的试管储存于冷冻箱（0 °C）中，或运送至检测机构进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNA 溶液脱盐，MALDI-TOF 芯片点样
<ol>
	<li>使用市售的阳离子交换 C18 吸头对样品进行脱盐和浓缩（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将一个 10 µL C18 吸头（吸头末端固定有 C18 色谱介质填料）安装到 10 µL 移液器上，然后按以下步骤操作：
		<ol>
			<li>用 50% 乙腈水溶液（10 µL）清洗 C18 吸头两次，每次将废液弃入单独的废液管中。</li>
			<li>用含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（10 µL）平衡 C18 吸头两次，每次将废液弃入单独的废液管中。</li>
			<li>手动将 C18 吸头从移液器上取下，并固定到装有 P200 吸头的 200 µL 移液器上（此时 C18 吸头将连接在 P200 吸头上）。</li>
			<li>将 C18 吸头浸入溶液中（步骤 2.2.6），通过 C18 吸头反复吸取-释放溶液十次。 
			注：RNA 样品将结合在吸头内的阳离子交换树脂上。</li>
			<li>将 C18 吸头从 P200 移液器上取下，并重新安装到 10 µL 移液器上。</li>
			<li>用 0.1% TFA 水溶液（10 µL）清洗 C18 吸头两次，每次将废液弃入单独的废液管中。</li>
			<li>用无 RNase 的水（10 µL）清洗 C18 吸头两次，每次将废液弃入单独的废液管中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤点样至 MALDI 板上。
	<ol>
		<li>将 C18 吸头中的 RNA 寡核苷酸洗脱（步骤 3.1.1.7）：将吸头浸入所需基质溶液中（10 µL，C 和 D 的 1:1 溶液，表 1），然后将溶液重新排回离心管中，重复此过程十次。</li>
		<li>将步骤 3.2.1 中的溶液分别点样至板上的两个不同位置（每点 1 µL，20 pmol），静置使其自然干燥（图 1A 和 视频 1）。 
		注：可在同一位置重复点样以提高每个点的样品浓度。</li>
		<li>将所需校准物（1 µL）点样至靠近样品位置的两个独立位点，并静置使其自然干燥。 
		注：本研究中使用的测试标准品来自商业来源（参见 材料表）。</li>
		<li>在[完全干燥的]校准物上覆盖所需基质（1 µL），静置使其自然干燥。 
		&#8203;注：在将样品板插入仪器前，务必记录样品和校准物的点样位置。请使用板坐标系统进行记录，例如：样品 1 位于位置 (C,3)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据采集与处理
注意：通常情况下，THAP 需要更高的激光功率才能实现电离。此外，寡核苷酸在不发生断裂的情况下较难电离。因此，通常需要尽可能使用较低的激光功率，并提高检测器增益和/或降低激光频率，以最大化检测灵敏度并最小化碎片化。
<ol>
	<li>按照以下步骤进行数据采集。 
	注意：分子量测定采用质谱仪（参见材料表）在正离子线性模式下进行，离子源电压为 20 kV，检测器增益约为 2.8 kV，激光频率为 20 Hz。扫描范围根据预期的分子量设定，并以质荷比（m/z）表示，其中电荷为 1。使用蛋白质校准混合物（Bacterial Test Standard，参见材料表）在样品邻近位点进行外部校准。原始数据随后在 flexAnalysis 软件中进行处理（参见材料表）。
	<ol>
		<li>打开&#34;Flexcontrol 软件&#34;以进行操作。按下仪器的绿色进出按钮，等待目标载台移动并释放真空。打开盖子，将完全干燥的靶板放入仪器中。确保正确对齐方向（图 1B）。</li>
		<li>轻轻合上盖子，然后按下绿色的进出按钮。等待靶板缩回，仪器重新抽真空。当软件窗口右下角的状态栏显示“就绪”时，继续进行校准。</li>
		<li>使用软件对仪器进行校准，操作如下：
		<ol>
			<li>通过点击文件 &#62; 选择方法或按下加载方法旁的选择按钮，选择所需的方法。点击校准品位点的坐标。转至校准选项卡，并确认已选择正确的校准品。确保在样品载体选项卡中关闭随机行走功能。</li>
			<li>按下开始，手动将激光沿晶体移动（在相机视图中点击鼠标箭头至所需位置）。根据需要调整激光功率。设置满意后，按下开始以采集谱图并将其加入累加缓冲区。</li>
			<li>持续累加谱图，直至达到足够的强度。切换以仅查看累加缓冲区，扣除基线并进行平滑处理。然后点击自动分配。检查每个已分配的峰并记录其 ppm 误差。若对分配结果和误差满意，则点击应用。</li>
			<li>清除累加缓冲区，并导航至第一个样品的位置。</li>
			<li>确认所需的扫描范围（“检测”选项卡）。调整&#34;质量范围&#34;中的滑块，使绿色区域代表预期的质量范围。</li>
			<li>直接点击放大倍数窗口，使十字准线对准所需结晶片段（较大的晶体通常能获得最佳结果，图 2）。</li>
			<li>沿大晶体采集若干谱图，并根据需要调整激光功率。合适的设置为峰出现时所需功率的 5%–10% 以上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为获取谱图，请执行以下操作：
		<ol>
			<li>点击开始，观察激光闪烁与谱图强度增加（显示在右上角窗口中）同步。通过在晶体上上下移动鼠标箭头并点击，沿晶体长度方向移动激光（视频 2）。</li>
			<li>在开始按钮正下方点击添加。</li>
			<li>重复此操作数次，直至达到所需的强度/射击次数（反映在谱图窗口的 y 轴上）。</li>
			<li>若初始扫描结果不理想，调整激光功率和/或速度和/或检测器增益。根据需要重复步骤 4.1.4.1–4.1.4.3。</li>
			<li>若对谱图满意，点击另存为，以指定名称保存谱图。然后，若需处理其他样品，点击清除累加，并重复步骤 4.1.4 中的操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行数据处理。 
	注意：步骤 4.2 描述了使用 flexAnalysis 软件分析数据的一种方法。
	<ol>
		<li>打开所需软件，然后通过选择文件打开谱图（a）。从下拉菜单中选择打开。</li>
		<li>将显示一个新窗口。点击浏览以定位步骤 4.1.4 中保存的文件。勾选所需文件，然后点击左侧的打开。若仅需分析单个谱图，可直接将文件拖拽至软件窗口中。</li>
		<li>高亮已加载的文件以进行批量分析。转至工具栏中的处理选项卡。在下拉菜单中选择扣除质谱基线。 
		注意：扣除所用算法由步骤 4.1.3 中选择的方法决定。</li>
		<li>转至工具栏中的处理选项卡。在下拉菜单中选择平滑质谱。 
		注意：平滑所用算法由步骤 4.1.3 中选择的方法决定。</li>
		<li>点击质量列表选项卡；在下拉菜单中选择查找。该命令将自动为峰标注其质量，并在屏幕右侧显示质量列表。</li>
		<li>如需添加或删除峰，请进入质量列表选项卡。在下拉菜单中点击编辑。</li>
		<li>将鼠标悬停于谱图的 x 轴上，垂直线将表示光标所在位置。 
		注意：当可点击添加新质量时，会出现一个带有图表和光标的图标。当悬停于可点击删除的峰上时，该图标也会出现（参见补充文件 1中步骤 4.2.7）。</li>
		<li>对其他谱图重复步骤 4.1.3–4.1.7。通过点击并拖拽左侧文件以高亮，然后执行以下菜单操作：文件 &#62; 导出 &#62; 质量列表至 Excel，导出所有谱图的质量列表。</li>
		<li>如需导出屏幕上显示的谱图，可截取屏幕截图，或将其导出为报告。后者操作为：转至报告菜单，在下拉菜单中选择另存为 PDF。 
		注意：可通过谱图下方的三个选项卡和/或更改高亮文件来调整谱图显示方式。弹出窗口后，按需命名 PDF 文档，调整设置/布局，然后点击保存以生成谱图图像。</li>
		<li>生成的图像将反映软件程序中的谱图视图。为调整视图，请执行以下操作：
		<ol>
			<li>放大：点击工具栏中的放大按钮。</li>
			<li>将鼠标悬停于 x 轴并点击，直至达到所需范围。</li>
			<li>缩小/撤销：点击缩小按钮，并在谱图任意位置点击以恢复全图视图。 
			注意：步骤 4.1 和 4.2 的图示说明可参见补充文件 1（分别为第 S8–S23 页和 S24–S30 页）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该工作流程中的主要挑战出现在实验完成与进行质谱分析之间。实验在科罗拉多大学丹佛分校完成，随后通过隔夜快递运送至科罗拉多州立大学的设施。数据采集在收到样品后根据实际情况进行。由于若干意外情况，导致该过程出现时间延迟。例如，因仪器突发故障，样品在点样和采集前曾被冷冻（其中一次长达21天）；然而，尽管不能排除RNA降解（导致信号强度降低）的可能性，但此次时间延迟似乎并未影响实验结果。
所述实验在RNA浓度方面的局限性在于，实验所用的[RNA]高于单个RNA序列在体内（in vivo）可达到的水平23,24。我们发现，当实验使用20 pmol RNA（点样量为2 pmol）或更低量时，无法观察到预期的峰信号。采用激光功率更优的光谱仪可能会增强信号，从而降低检测限。
预计可以省略使用10 kDa过滤装置过滤酶以分离酶的步骤。不进行此步骤的实验也获得了类似的结果。但是，如果样品需要运输或长期保存，则建议进...

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）1,2,3 是一种广泛用于表征和/或检测不同大小及特性的分子的技术。其应用包括多种领域，例如从天然资源中检测单宁4、对食品中的代谢物进行成像5、发现或监测细胞中药物作用靶点或标志物6，以及临床诊断7等。与本研究相关的是 MALDI-TOF 在 DNA 或 RNA 上的应用，该技术用于寡核苷酸已有三十多年历史8，当时已注意到若干局限性。如今，该技术已发展为一种可靠且常用的方法，可用于表征生物大分子9，并识别或理解化学与生化反应，例如 RNA 中铂化位点的表征10、链断裂后 RNA 片段的鉴定11,12，以及蛋白质-DNA 交联物的形成分析13。因此，阐明并突出该技术应用中的关键环节具有重要意义。MALDI-TOF 的基本原理已有视频形式的描述14，本文不再赘述。此外，该技术在 DNA 或蛋白质背景下的应用也已在前述视频中被描述和展示15,16,17。
本文报道了检测酶解后形成RNA片段的实验方案。实验模型的选择基于本课题组近期发表的一项发现18，其中采用MALDI-TOF质谱技术确定了外切核糖核酸酶Xrn-1与含有氧化损伤8-oxoG的RNA寡核苷酸之间的特异性反应活性。所用20个核苷酸长度的RNA链通过以下方法获得 通过 固相合成19，[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 和 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]，而 Xrn-1 的表达与纯化则依照先前报道的方法进行20简而言之，Xrn-121 是一种具有多种重要生物学功能的5'-3'外切核糖核酸酶，可降解包括氧化RNA在内的多种类型RNA22发现该酶在遇到8-oxoG时其持续性受到阻碍，导致产生含有5'-磷酸化末端的RNA片段[5'-H2PO4-(8-氧代G)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-氧代G)(8-氧代G) CUA AAA GU]，以及[5'-H2PO4-(8-氧代G) CUA AAA GU]18.
最后，需要指出的是，质谱法是一种强大的方法，通过多种技术手段可适用于其他目的23,24；因此，选择合适的电离方法以及其他实验条件至关重要。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL MCT 带刻度紫色管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-三羟基苯乙酮一水合物 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 99.9%，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷，10 mM</td><td>New England Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸氢二铵 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>氟化铵 98.0%，ACS 级</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 细菌检测标准品</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>市售 Xrn-1 来源</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯，97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Flex 分析软件</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis 软件版本 3.4，Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 紫外-可见分光光度计</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI 板：MSP 96 磨砂钢靶板</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF 质谱仪（Bruker Daltonics，Billerica，MA）</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Milipore Sigma</td><td></td><td>本研究中所有用水均使用 Mili-Q 系统进行纯化</td></tr><tr><td>Nanosep 离心过滤装置，OmegaTM 膜 10 K，蓝色（24 个/包）</td><td>Pall Corporation</td><td>OD010C33</td><td>滤膜材料：Omega（改性聚醚砜），孔径 10 K</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>此为溶液 B</td></tr><tr><td>Oligo 分析工具</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>P10 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>P200 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B0201S</td><td>此为溶液 A</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 外切核糖核酸酶</td><td>本实验室表达</td><td>参见参考文献 20</td><td></td></tr><tr><td>用于样品制备的 ZipTip 吸头</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &amp;micro;L 吸头，装有 C18 标准填料，床体积 0.6 &amp;micro;L</td></tr></tbody></table>

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定酶降解产生的rna片段

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA 是存在于所有生命域中的一种生物大分子，其可与多种其他分子和/或活性物质相互作用，例如 DNA、蛋白质、离子、药物以及自由基等，这类相互作用广泛存在于各类生物体系中。因此，RNA 会发生多种化学反应，包括断裂、降解或修饰，从而生成具有不同生物学功能和意义的产物。一个典型的例子是鸟嘌呤在活性氧（ROS）存在下被氧化为 7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）。总体而言，能够表征此类产物及化学转化过程的实验方法对科学界具有重要价值。为此，基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术是一种被广泛应用的分析手段。本实验方案旨在描述如何对酶切处理后生成的 RNA 片段进行表征。所采用的模型体系为 RNA 与外切核糖核酸酶 Xrn-1 的反应，其中酶促消化过程会在氧化位点处停止。本研究使用了两条长度为 20 个核苷酸的 RNA 序列：[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 和 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] 通过 固相合成，通过紫外-可见光谱法进行定量，并加以表征 通过 MALDI-TOF。获得的链随后进行（1）5'端磷酸化并进行表征 通过 MALDI-TOF；（2）经 Xrn-1 处理；（3）过滤并脱盐；（4）分析 通过 MALDI-TOF。该实验设置实现了对与 Xrn-1 停滞相关的片段的明确鉴定：[5'-H2PO4-(8-氧代G)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-氧代鸟嘌呤)(8-氧代鸟嘌呤) CUA AAA GU]，以及[5'-H2PO4-(8-氧代G) CUA AAA GU]。本研究所描述的实验使用了200皮摩尔的RNA（MALDI分析使用20皮摩尔）；然而，若采用比本研究中所用激光源功率更高的质谱仪，即使使用更少的样品量也可能获得可检测的峰信号。重要的是，所述方法具有通用性，可推广并可能扩展应用于涉及RNA和DNA的其他反应产物鉴定，有助于表征或阐明其他生物化学通路。

本研究中所用的寡核苷酸在使用前均已完成合成、表征与定量。所有寡核苷酸的浓度均已测定 通过 紫外-可见光谱记录于 90 °C 为避免因可能形成二级结构而导致的错误读数。 图3 显示了本研究中使用的RNA模型寡核苷酸在室温下及加热后的光谱。
整个实验流程以及导致 Xrn-1 停滞的氧化损伤结构如图4所示。寡核苷酸（1）在第11位含有一个8-oxoG，此处Xrn-1的活性受到阻断，导致RNA链的水解过程停止。需要特别指出的是，本图所示结果对应于使用含有200 pmol母链（1）的溶液进行的实验，尽管仅将20 pmol点样于板上。所有计算均采用平均分子质量，且观察到的偏差在1–3个原子质量单位（amu）之间。该图展示了两个过程：（1）RNA高效发生5'-磷酸化，表现为仅出现一个对应于预期产物的峰（1'）；（2）样品混合物经Xrn-1处理后产生的停滞片段。对照实验中，在不添加激酶（PNK）和核糖核酸酶（Xrn-1）的条件下对母链进行处理，其结果与<stro...

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对氧化RNA与外切核糖核酸酶Xrn-1反应产生的片段进行表征。本方案所描述的方法可应用于涉及RNA和/或DNA的其他过程。

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定酶降解产生的RNA片段

RNA 是存在于所有生命域中的一种生物大分子，它可与其他分子和/或活性物质发生相互作用，例如 DNA、蛋白质、离子、药物等。

质谱技术已被广泛应用于多种研究领域。本文所述方法可对体外酶促反应获得的RNA片段进行明确的表征。该技术的优势包括能够获得分子离子峰，可在体外应用中使用少量样品进行实验，以及该方案仅需 minimal 培训即可完成。所述方法可广泛应用于涉及DNA、RNA或蛋白质的研究过程，例如生物化学转化、交叉信息分析、化学修饰的鉴定，或其他生物大分子相互作用与反应活性的研究。一个可能的困难是获取基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱仪或提供该服务的核心设施的途径有限。另一个方面是确定检测限，检测限可能因仪器不同而有所升高或降低。首先，打开紫外-可见分光光度计，然后单击 PerkinElmer UV WinLab 图标以打开仪器操作控制窗口。使用位于仪器右侧的开关打开帕尔贴温控器分光光度计，然后单击“基本方法”下的 Scan-Lambda 365。另一个界面将打开，并提示用户确保细胞架为空。单击“确定”，使仪器进行系统检查。接下来，通过选择“数据采集”来调整扫描参数。在新窗口的“扫描设置”下，将起始波长改为 350 纳米，终止波长改为 215 纳米。通过点击附件左侧的加号来启动帕尔贴装置。然后点击“多池帕尔贴”，将温度设为 25 摄氏度，并点击“帕尔贴开启”。转到样品信息标签页，输入所需的样品数量、名称及样品池位置。单击“自动调零”按钮，插入含有背景溶液的比色皿。单击“开始”按钮，将比色皿插入目标样品池中，并确保比色皿的透光面与仪器前面平行。然后单击“确定”按钮，开始在25摄氏度下进行第一次扫描。若需在较高温度下进行测量，请点击“多单元帕尔帖”（Multiple Cell Peltier），将温度调整至所需样品温度，然后重复扫描。点击“文件”（File），选择“导出”（Export），指定目标文件保存位置，并选择“XY 数据”（XY Data）以生成文本文件。为进行 RNA 的 5'端磷酸化修饰，取一个 0.6 微升的微量离心管，依次加入 33.5 微升无 RNase 水、5 微升溶液 A、6 微升 10 毫摩尔/升三磷酸腺苷（ATP）、1 微升 200 微摩尔/升 RNA 水溶液以及 4.5 微升多核苷酸激酶，轻轻混匀溶液。将反应混合物置于37摄氏度水浴中孵育45分钟。随后将反应管放入预热至65摄氏度的金属浴中加热10分钟，以灭活酶。让溶液冷却至室温，得到终产物5'磷酸化RNA溶液。孵育后，取50微升该溶液，加入5微升溶液B以及5微升1飞摩尔的Xrn-1溶液，进行RNA水解反应。将反应管在室温下孵育2小时。将此反应混合物转移至截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中，于700 × g离心10分钟以去除酶。将滤液转移至0.6毫升离心管中。然后，加入 20 微升无 RNase 水以洗涤离心管上的残留 RNA，随后进行离心。最后，将此滤液与之前使用 10 千道尔顿孔径离心装置离心所得的滤液合并，在 0 摄氏度下冷冻或送检分析。为脱盐并浓缩样品，使用市售的阳离子交换 C18 吸头，其末端装有 C18 色谱介质填料。为此，将10微升移液枪头安装到10微升移液器上，并用50%乙腈水溶液清洗该枪头两次。每次使用后的液体弃入单独的废液管中，并用10微升0.1%三氟乙酸水溶液平衡C18枪头两次。手动将C18枪头从移液器上取下，并将其固定到装有P200移液枪头的200微升移液器上。然后将C18吸头浸入Xrn-1酶解RNA寡核苷酸后所得的溶液中，通过C18吸头反复吸取并释放溶液10次。接着，将C18吸头从P200移液枪上取下，将其安装到10微升移液器上，用0.1%三氟乙酸水溶液清洗C18吸头两次。每次清洗后，将废液分别弃入独立的废液管中。用 10 微升无 RNase 水清洗 C18 小柱两次。将样品浸入所需基质中，并将溶液反复移液至离心管中 10 次，从而将 RNA 寡核苷酸从 C18 小柱上洗脱。将此溶液分别点样到基质辅助激光解吸电离（MALDI）靶板上的两个独立位点，每点 1 微升，静置使其自然风干。本研究中所用 RNA 的浓度通过在 90 摄氏度下记录的紫外-可见光谱法测定，以避免因 RNA 可能形成二级结构而导致的测量误差。整个实验流程包括两个部分。其一，RNA 的高效 5' 磷酸化，其产物仅出现一个对应于预期产物的峰，证明反应成功。其次，是样品混合物经Xrn-1处理后产生的停滞片段。使用包含两个氧化损伤位点的不同序列也获得了相同的结果。可考虑的优化方案包括取消过滤装置的使用，或尝试MALDI点样时采用不同的基质材料。例如，芥子酸或吡啶甲酸。RNA 片段是通过酶促过程获得的。该过程通过结合基质辅助激光解吸电离、电泳分析、固相合成和圆二色性技术而建立。所述方案具有广泛的应用潜力，可应用于从化学科学研究到生物医学领域应用的多个领域。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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