利用组织透明化后三维重建方法检测和定量小鼠门齿中的标记滞留细胞
2022年6月10日
小鼠门齿的干细胞微环境中含有宝贵的标记滞留细胞。我们建立了一种无偏倚检测和定量标记滞留细胞的新方法；本研究采用EdU标记，并在对下颌骨进行PEGASOS组织透明化处理后，结合三维重建技术进行分析。
本方案描述了一种用于体内及三维可视化和定量小鼠门齿干细胞微环境中标记保留细胞的方法。该技术节省时间，对初学者而言操作简便。三维图像的获取无需破坏组织。
三维定量使数据更加可靠和准确。首先，解剖下颌骨。将样品固定在4%多聚甲醛中，并在室温下保存过夜。
孵育结束后，将肌肉从下颌骨中取出。将其浸入0.5摩尔的乙二胺四乙酸溶液中，在37摄氏度摇床中脱钙四天，每天更换溶液。将下颌骨置于15毫升25% Quadrol溶液中，在37摄氏度摇床中脱色一天，以去除残留的血红素。
对于整体5-乙炔基-2'-脱氧尿苷染色，按照文中所述配制新鲜的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记混合液。在37°C摇床上，用含Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗下颌骨30分钟。再用磷酸盐缓冲液清洗下颌骨三次，每次三分钟，随后在新鲜配制的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记混合液中，于摇床上4°C过夜孵育。
用磷酸盐缓冲液重复清洗三次，然后将下颌置于文中所述溶液中，在37摄氏度摇床中每六小时进行一次连续脱脂处理。在叔丁醇-聚乙二醇（tB-PEG）溶液中于37摄氏度下脱水两天，每天更换培养基。两天后，将下颌置于含75%苯甲酸苄酯、22%平均分子量为500的聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（PEG-MMA500）和3%Quadrol的苯甲酸苄酯-聚乙二醇透明介质中透明化，直至实现折射率匹配并达到透明状态。
将透明化处理后的完整下颌骨置于含有苯甲酸苄酯-聚乙二醇透明介质的载玻片凹槽中，并用盖玻片封片。在共聚焦成像软件中设置所需的图像采集参数。在荧光激发面板中，启用可最佳激发荧光染料的激光器。
在荧光检测面板中，移动滑块以选择需要测量的波长。在盖玻片上滴加一滴折射率为1.52的浸油，以匹配玻璃盖玻片与物镜的折射率，然后将安装好的下颌骨置于显微镜载物台上。打开荧光灯，选择合适的放大倍数物镜以成像目标区域。
在实时扫描模式下，确定视野范围，以在 X 和 Y 维度上完整观察下颌区域。设置上下 Z 轴采集参数，准确覆盖小鼠门齿中干细胞微环境的体积。Z 轴步长设为 2 微米，或根据您的需求进行设定。
以 lif 格式获取并保存 Z 轴层扫图像文件。使用成像软件的文件转换工具将 Z 轴层扫图像文件转换为原生格式文件类型。在成像软件中，单击 Arena 按钮，然后选择图像。
选择原始的 lif 文件，并选择合并后的文件。图像将被导入成像软件中。双击已导入的文件以打开图像数据集。
在成像软件中，进入“显示调节”面板。在“显示调节”面板中，点击通道的名称。该通道在默认模式下通常标记为红色。
在图像属性窗口中，单击“映射颜色”选项卡。在颜色表文件选项中，选择 Fire Flow，然后单击“确定”。选择显示颜色，以区分样本的背景荧光和阳性荧光。在屏幕左上方的场景属性窗格中，单击标有“添加新表面”的蓝色图标。
取消选择体积图标，以去除大部分背景荧光，从而使阳性荧光在手动分割过程中清晰可见。接下来，点击“创建”选项卡，并选择“跳过自动创建，手动编辑”选项，开始对感兴趣区域（ROI）进行手动分割。在手动表面创建向导中，点击“轮廓”选项卡，根据样本方向选择合适的取向，以便于勾画ROI轮廓。
接下来，确保右上角的指针菜单处于选择模式。调整切片位置，以在组织中定位感兴趣区域（ROI）。如前所述，大部分背景荧光已被去除。
单击“绘制”按钮，绘制一个初步的兴趣区域。选择“可见性”选项为“无”，以避免非兴趣区域部分的干扰，随后逐层分割兴趣区域。完成兴趣区域绘制后，单击“创建表面”以获得该兴趣区域的三维几何结构。
单击手动表面创建向导中的“编辑”按钮，然后选择“遮罩全部”。在弹出的“遮罩通道”窗口中，于通道选择选项中选择通道1。随后，在应用遮罩前选择“应用遮罩前复制通道”。
在掩膜设置中，选择“表面内部/外部为常量”，并将表面外部的体素设为零。在场景属性窗格中，取消选中表面对象，选择体对象。在显示调整中，取消选中原始的红色通道，选择经过掩膜处理的红色通道。
调整颜色强度，以获得所需的三维渲染且正向标记的荧光感兴趣区域（ROI）。单击“Spots”图标创建新的点状对象，通过生成与三维渲染的标记保留细胞相匹配的三维点状结构，来定量分析这些细胞。使用底部箭头在点状对象创建向导的各个步骤之间切换。
单击“完成”按钮，然后选择“统计”按钮。接下来，选择“总体”选项卡，以查找图像中斑点总数的数值。经过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记以及聚乙二醇相关溶剂体系的组织透明化处理后，获得了透明的下颌骨。
将经过修饰的样本与未经透明化处理的正常下颌骨进行比较，并对经5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记的透明下颌骨进行共聚焦成像。门齿的光学切片在XY平面上显示出位于门齿尖端干细胞微环境中的标记保留细胞。门齿尖端的三维图像重建显示，在上皮性和间充质性干细胞微环境中均存在5-乙炔基-2'-脱氧尿苷阳性的标记保留静息干细胞。
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷阳性细胞被转移至与间充质标记滞留细胞相对应的位置进行定量。图像中可见仅为间充质标记滞留细胞和仅为上皮标记滞留细胞所创建的位置。同时对上皮和间充质标记滞留细胞进行了定量分析。
处理和透明化过程中的各项参数是最关键的步骤，应根据组织的具体用途进行优化，以获得满意的结果。该方法还可进行修改，用于可视化S2VGFP水平的静息细胞（LRCs），以及在细胞谱系示踪中获取子代细胞位置及其定量或贡献的详细信息。
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概述
本研究提出了一种用于活体可视化及定量小鼠门齿干细胞微环境中标记滞留细胞的新方法。通过EdU标记结合PEGASOS组织透明化后的三维重建技术，该方法提高了数据采集的可靠性和准确性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞研究
- 三维成像技术
背景
- 标记保留细胞对于理解干细胞微环境至关重要。
- 小鼠门齿是研究这些细胞的模型。
- 传统方法可能无法提供准确的定量结果。
- PEGASOS 组织透明化技术可实现对细胞结构的更好可视化。
研究目的
- 建立一种用于定量标记滞留细胞的用户友好型方法。
- 提高生物样本三维成像的准确性。
- 促进干细胞生物学和组织再生研究。
使用的方法
- 小鼠下颌骨的解剖。
- 室温下用4%多聚甲醛固定过夜。
- EdU标记以鉴定标记滞留细胞。
- 利用PEGASOS组织透明化技术进行三维重建。
主要结果
- 成功实现三维空间中示踪标记保留细胞的可视化。
- 细胞定量分析显示准确性显著提高。
- 该方法被证实具有节省时间且操作简便的优点。
- 数据支持进一步开展干细胞微环境的相关研究。
结论
- 该新方法增强了对标记保留细胞的研究。
- 三维成像为干细胞生物学提供了有价值的见解。
- 该技术可被相关领域的研究人员采用。
常见问题
行业重要性概述
小鼠门齿中示踪标记保留细胞（LRCs）的定量三维可视化，能够高可信度地探究成体干细胞的稳态及其更新动态。该方法增强了对干细胞微环境动态的预测可靠性，有助于再生医学和组织工程研究领域的早期发现及机制性风险排除。该技术具备无偏倚的定量能力与良好的可重复性，可作为转化研究和临床前模型开发中的战略性工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过假设驱动的靶点验证，实现对静息干细胞群体的直接定量分析。
- 通过区分上皮和间充质干细胞的贡献，支持作用机制层面的风险评估。
- 提供稳健且可重复的干细胞微环境数据，助力项目组合的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的三维生物系统。
- 提供标准化的定量输出，以确保检测的可重复性以及跨研究的可比性。
- 实现对化合物在干细胞维持与分化中作用的可靠评估。
转化与临床前研究
- 与疾病相关模型相一致，可用于研究组织再生和干细胞动态。
- 通过实现谱系示踪和子代细胞定量，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 支持在再生医学和组织工程项目中基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
这种3D LRC定量方法贯穿早期发现到临床前研究，连接了假设验证、靶点确证和转化模型开发。
- 发现生物学：支持干细胞稳态中的假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可用于化合物评价的即用型、可重复的三维成像检测结果。
- 分析：提供定量的因变量测量，以实现可靠的统计学比较。
- 转化研究：实现从发现阶段到临床前阶段的生物标志物对接与连续性分析。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，用于跨多个项目进行干细胞定量和谱系追踪。
运营与企业影响
- 科学价值：提高干细胞研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化三维定量与成像工作流程，提升可重复性与可扩展性。
- 战略价值：通过提供可靠、定量的数据，优化决策流程，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的再生医学与组织工程资产的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备组织透明化、共聚焦成像和三维图像分析的专业技术。
- 需要使用先进的成像设备及兼容的分析软件。
- 需要跨团队对样本制备和定量分析流程进行标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种组织类型及谱系示踪应用。
- 依赖于针对特定组织环境优化透明化和处理步骤。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Tissue Clearing of Mandible Using PEGASOS Technique
3:03
Confocal Imaging of Tissue-Cleared Mandible
4:37
Image Processing, 3D Image Reconstruction, and Quantification of Label-Retaining Cells
8:25
Results: Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors
9:50
Conclusion
