利用离子淌度-质谱法研究镍(II)和锌(II)三元配合物的热化学性质

这项新技术结合了离子淌度-质谱法、分子模拟和反应动力学理论，用于确定三元复合物两种竞争性解离反应的相对热化学性质。这些技术的联用可表征反应物与产物的反应路径、构象结构以及配体与金属离子形成三元复合物的亲和力。本研究模拟了两种潜在肽标签在重组蛋白纯化中的反应活性，其中标签与固定化金属亲和层析柱中由氮川三乙酸螯合的金属离子发生反应。

首先，将2毫升样品加入2.5毫升平头注射器中，并使用仪器的注射泵以10微升/分钟的流速将样品注入仪器的电喷雾源。将仪器设置为负离子迁移率-质谱（IM-MS）模式。打开质谱软件并选择“Spectrum”（谱图），通过分析质谱图中负离子的质荷比同位素分布，鉴定带负电荷的替代金属结合三元复合物（即amb-metal-NTA复合物）。

然后，选择“工具”，接着选择“同位素模型”。在弹出的窗口中，列出该复合物的分子式，勾选“显示带电离子”复选框，在电荷值处输入 1 表示负一电荷，然后点击“确定”。在显示的复合物同位素分布图中，记录最低质量的峰。在仪器软件中，选择“设置”，然后选择“四极杆轮廓”。

然后，选择手动固定并输入最低同位素峰的质量。单击更新并关闭窗口。再次选择设置，然后单击分辨率四极杆。

使用5分钟的运行时间和2秒的扫描时间，从第一个传输碰撞能量开始采集负离子IM-MS谱图。重复该步骤，以采集其他各碰撞能量下的IM-MS谱图。利用三元amb-金属-NTA复合物以及两种产物（NTA-金属复合物和amb-金属复合物）的积分到达时间分布（ATD面积），将其归一化为相对百分比尺度。

根据重复的阈值碰撞诱导解离（TCID）测量结果，计算每个数据点的平均值和标准偏差。然后，将实验室坐标系中的转移碰撞能量转换为中心质心坐标系中的碰撞能量。为测量碰撞截面，使用仪器工作条件，采集10 ppm聚-DL-丙氨酸（PA）样品的负离子离子淌度-质谱（IM-MS）谱图，持续10分钟。

然后，采集每种三元复合物的离子迁移-质谱（IM-MS）谱图，持续5分钟。提取每种PA及三元复合物的到达时间分布（ATD），并使用“保留漂移时间”选项将其文件导出至质谱分析软件。根据相应ATD曲线的峰值确定平均到达时间。

采用横截面校准方法，将平均到达时间转换为三元复合物的碰撞横截面。从 CRUNCH 主菜单中打开包含质心能量或 ECM 依赖性产物相对强度的 GB5 文本文件。当提示读取参数时，回答“否”。

然后，选择“建模”，接着选择“设置所有参数”。在反应模型选项中，选择默认的“阈值CID”选项，然后选择对三元复合物的能量转移分布进行积分的RRKM方法。输入要建模的独立产物通道数为2，并选择“计算截面”。

对于简单的模型类型，选择0开尔文截面，该选项包含由于从碰撞池到飞行时间检测器的50微秒时间窗口所引起的动力学偏移的统计RRKM校正。对于卷积选项，选择Tiernan双积分方法，该方法包含三元复合离子与氩碰撞气体之间平动能分布的卷积。对于数值积分方法，选择高斯求积法，并使用预先保存的截面数据。

在输入分子参数的选项中，输入 G 以读取包含三元复合物 PM6 振动和转动频率的结构建模文件。对问题“是否有反应物为原子？”回答“是”。输入建模文件的位置和名称。

输入离子电荷为 1，氩气的极化率为 1.664。离子质量与靶分子质量分别对应于三元复合物和氩气，将从 GB5 文本文件中自动读取。谐振振动项输入 0。

按 Enter 键从结构建模文件中读取一维和二维转动常数。对于受阻转子处理，选择默认值 0；对于分子对称性，选择默认值 1。反应物温度选择默认的 300 开尔文。

选择“积分”作为态密度数组的归约方法。选择“是”以截断能量分布。输入40000波数作为能量分布的最大能量，2波数作为区间大小，32作为能量分布中的点数。

对于 TCID/RRKM 模型的参数，选择“是”以进行更改，将“固定时间”设为 0，将检测时间窗口的上限设为 0.000050 秒。对于产物通道 1，在解离通道选项中选择 1，表示单个过渡态，选择 0 表示无连续解离。对于过渡态类型，选择 1 表示轨道型过渡态。

选择 G 以读取包含 amb-金属配合物与 NTA 产物的 PM6 转动和振动参数的建模程序文件。对于“相空间极限过渡态（PSL TS）物种是否为原子？”这一问题，输入 No。然后输入 amb-金属配合物文件的位置和名称。

使用 1.062 作为频率缩放因子，输入原子数量后按 Enter 键，并在“分子是否为线性？”时输入 No。对包含 NTA 产物振动和转动频率的建模文件重复相同操作。输入绕行过渡态（TS）的描述。输入 amb-金属离子的电荷为 1.0，然后输入 NTA 的极化率和偶极矩。

选择旋转温度为 0 开尔文，并将轨道过渡态处理为固定偶极子。输入 amb-金属离子和 NTA 的平均质量。按 Enter 键从建模文件中读取一维和二维旋转常数。

对于受阻转子选择 0，分子对称性选择 1，反应简并性选择 1。选择“无更改”选项。对于产物通道 2，单个过渡态选择 1，依次解离选择 0（无），过渡态类型选择 1（轨道化）。

选择 G 以读取包含 NTA-金属配合物及 amb 产物的 PM6 转动和振动参数的建模文件。然后输入绕轨过渡态（TS）的描述。NTA-金属配合物离子的电荷输入为 1.0，并输入 amb 的极化率和偶极矩。将转动温度设为 0 开尔文，过渡态的处理方式选择“固定偶极”（locked-dipole）。

输入NTA-金属配合物和amb产物的平均质量。按Enter键从建模文件中读取一维和二维转动常数。对于受阻转子选择0，分子对称性选择1，反应简并度选择1。

然后，输入“无变化”。为处理非活性的二维旋转，请选择统计角动量分布的默认选项，并对J分布积分P-E, G。在积分的点数中使用默认值32。

在“模型”菜单中，选择“优化参数以拟合数据”，并分别输入最小能量值和最大能量值，以确定数据拟合的起始和终止范围。权重模型的实验标准偏差选择1。根据数据情况，通常选择0.01至0.001作为可接受的最小标准偏差。

使用默认的 E0 收敛限值，选择“否”以不将任何参数保持在当前值，下限和上限分别为 0.5 和 2.0 电子伏特，导数计算方法选择 2。从“优化”菜单中选择“开始优化”。CRUNCH 程序将对选定的 TCID 模型进行优化以拟合实验数据。

最后，在“模型”菜单中选择 delta-H 和 S at T，以对两个解离通道进行热化学评估。代表性图像显示了替代性金属结合肽 A 和 H 的一级结构。颜色标示了潜在的金属结合位点。

此处展示了形成amb-金属和NTA-金属产物离子的能量依赖性。图中包含了amb-金属-NTA三元复合物在质心碰撞能量下发生50%解离的情况。代表性图像显示了能量分辨TCID方法的动力学模型。

ambH-锌-NTA复合物与氩气之间的碰撞会导致其解离为ambH-锌复合物和游离NTA，或NTA-锌复合物和游离ambH产物。阈值能量E1和E2分别对应于反应ambH-锌-NTA复合物解离为ambH-锌复合物和游离NTA，以及ambH-锌-NTA复合物解离为NTA-锌复合物和游离ambH在0开尔文时的解离焓。此处展示了A和H的PM6几何优化后的三元amb-金属-NTA复合物结构。

这些构象体用于实验数据的TCID建模，并通过比较其PM6电子能以及计算得到的碰撞截面与离子迁移谱-质谱（IM-MS）实测碰撞截面的匹配程度，从其他候选结构中筛选而出。这四张图像展示了四种amb-金属-NTA配合物的能量分辨TCID结果。对于物种A和H，图中显示了amb-金属和NTA-金属产物离子，并叠加了经卷积CRUNCH阈值拟合的结果。

能量值是指在 0 开尔文下，从 amb-金属-NTA 解离为 amb-金属和游离 NTA，或从 amb-金属-NTA 解离为 NTA-金属和游离 amb 的解离焓。此处展示了基于解离焓、净零开尔文下的吉布斯自由能（单位为千焦每摩尔）以及结合常数的比较结果，这些数据通过使用 PM6 参数的统计力学计算得出。NTA-镍与游离 ambA 反应生成 ambA-镍-NTA 复合物的过程具有最高的形成常数，代表了在亲和柱中 ambA 标记蛋白被 NTA-镍固定化的反应过程。

CRUNCH 拟合需要对反应物和产物进行仔细筛选，以获得准确的阈值能量。该过程要求具备分子建模的专业知识，以获取分子结构和可靠的分子参数。本文所述的整体方法可进一步发展用于筛选设计用于结合金属辅因子及蛋白质活性位点以阻断酶功能的分子的有效性。