Name: 离体 啮齿动物三叉血管系统中降钙素基因相关肽的释放 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解离体啮齿动物三叉血管系统中降钙素基因相关肽释放的实验方法。该技术可精确评估药物对CGRP释放的影响，为偏头痛等疼痛疾病的神经生物学机制研究提供重要工具。

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本工作由Candys基金会资助。

所有动物护理和实验操作均遵循欧盟关于动物护理和使用的指南（2010/63/UE）。本方案使用10周龄雄性C57BL/6JBomTac小鼠和10周龄雄性Sprague Dawley大鼠进行演示。
1. 合成组织间液的制备
<ol>
	<li>根据以下配方制备合成间质液（SIF）：108 mM NaCl、3.48 mM KCl、3.50 mM MgSO4、26 mM NaHCO3、11.70 mM NaH2PO4、1.50 mM CaCl2、9.60 mM 葡萄糖酸钠（Na-gluconate）、5.50 mM 葡萄糖和 7.60 mM 蔗糖（见材料表）。 
	注意：SIF 可根据刺激目标进行调整，例如在研究钙通道时可使用无钙溶液。</li>
	<li>将 pH 值调节至 7.4，并通过碳酰气（5% CO2 和 95% O2）通气稳定 pH 值46。</li>
</ol>
2. 安乐死
<ol>
	<li>使用70% CO2 和30% O2 的混合气体麻醉成年小鼠和大鼠。使用剪刀剪下小鼠头部，使用断头台剪下大鼠头部（参见 材料表）。 
	注意：应选用符合研究目的的小鼠品系和年龄。该模型可使用雄性和雌性动物&#160;。</li>
	<li>在脊髓C3-C4水平将头部与身体分离。 
	&#8203;注意：也可通过腹腔注射戊巴比妥（100–150 mg/kg）实施安乐死。</li>
</ol>
3. 解剖
<ol>
	<li>按照以下步骤准备大鼠组织。
	<ol>
		<li>使用剪刀去除头颈部周围的皮肤和肌肉（图1A）。</li>
		<li>使用骨剪和剪刀将下颌从头部分离（图1B-C）。</li>
		<li>将骨剪从脊椎背侧尾端插入，打开脊髓，并去除脊椎背侧部分，以暴露脊髓和脑干（图1D）。</li>
		<li>沿枕骨和顶间骨的边界切割颅骨尾端，去除这些骨结构以暴露小脑（图1E）。 
		注意：在切割和去除椎骨时，务必避免损伤脑干和脊髓。</li>
		<li>使用弹簧剪在脑干背外侧进行切割，从每侧bregma后约13–16 mm处分离尾侧三叉神经核（Sp5C）。将左右两侧的TNC浸入SIF中（图1E-I）。 
		注意：本描述适用于成年大鼠。</li>
		<li>使用锯子沿中矢状面切割头部，将颅骨分为两半（图1J-L）。</li>
		<li>使用刮匙小心取出脑组织，避免触碰附着在颅骨上的硬脑膜，并在三叉神经进入脑干处将其切断（图1M-P）。</li>
		<li>为分离三叉神经节（TG），沿其可见边界将其连同分支一并剪下。在下颌支进入卵圆孔处将其切断。眼支和上颌支因在大体上无法明显区分，需在进入颅骨处切断。解剖TG时，应去除覆盖其表面的硬脑膜（图1Q-T）。</li>
		<li>将颅骨两半和TG浸入SIF中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤准备小鼠组织。
	<ol>
		<li>使用&#160;小剪刀去除头颈部周围的皮肤和肌肉（图2A-B）。</li>
		<li>将一对小剪刀从脊椎背侧尾端插入，打开脊髓，并去除脊椎背侧部分，以暴露脊髓和脑干（图2C）。 
		注意：在切割和去除椎骨时，务必避免损伤脊髓。</li>
		<li>沿枕骨和顶间骨的边界切割颅骨，去除这些骨结构以暴露小脑（图2D-F）。</li>
		<li>随后沿中矢状面切割顶骨，并移除骨片以暴露大脑半球（图2G-I）。</li>
		<li>使用刮匙小心移除小脑，以暴露脑干（图2J）。</li>
		<li>使用&#160;弹簧剪分离包含TNC的脑干部分（图2K-N）。将带有TNC的脑干浸入SIF中（图2O）。</li>
		<li>取出脑组织，并在三叉神经进入脑干处将其切断（图2P-Q）。</li>
		<li>为分离TG，沿其可见边界将其连同分支一并剪下。在下颌支进入卵圆孔处将其切断。眼支和上颌支因在大体上无法明显区分，需在进入颅骨处切断。解剖TG时，应去除覆盖其表面的硬脑膜（图2R-S）。</li>
		<li>将TG浸入SIF中（图2T）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 洗涤
<ol>
	<li>在室温下，用 SIF 清洗颅骨半片、三叉神经节细胞（TNCs）和三叉神经节（TGs），每次更换 SIF，持续 30 分钟，每 5 分钟更换一次。 
	注意：清洗步骤可在塑料容器中进行，容器加盖网纱以方便更换 SIF（图 3A-B）。</li>
	<li>按以下步骤处理大鼠组织。
	<ol>
		<li>将 TNC 半片分别转移至含有 350 µL SIF 的微量离心管盖中（图 3C）。</li>
		<li>将 TGs 转移至微量离心管盖中——每个微量离心管盖放置一个 TG，并加入 350 µL SIF（图 3C）。</li>
		<li>将颅骨半片置于由黏土或 6 孔培养板制成的平台上，并向颅骨内加入 400 µL SIF（图 3C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤处理小鼠组织。
	<ol>
		<li>将带有 TNC 的脑干转移至含有 250 µL SIF 的微量离心管盖中（图 3D）。</li>
		<li>将两个 TGs 转移至含有 250 µL SIF 的微量离心管盖中（图 3D）。 
		注意：使用小鼠组织时，每个微量离心管盖中放置两个 TGs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大鼠颅骨以及含有大鼠和小鼠组织的微量离心管盖置于 37 °C 的湿润培养箱中。每 5 分钟用移液器更换一次 SIF，持续 20 分钟。 
	&#8203;注意：添加和移除 SIF 时，切勿触碰组织。</li>
</ol>
5. 药物测试
<ol>
	<li>测定基础状态下的降钙素基因相关肽（CGRP）释放水平。
	<ol>
		<li>最后一次洗涤后，向小鼠三叉神经节（TG）和三叉神经颈复合体（TNC）中加入 250 µL SIF；向大鼠 TG 和 TNC 中加入 350 µL，每个大鼠颅骨中加入 400 µL。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于微量离心管中，并加入 50 µL 10 倍浓度的 EIA 缓冲液（随 CGRP 酶联免疫分析试剂盒提供，参见材料表），用于测定基础 CGRP 释放量（步骤 6）。弃去剩余液体。 
		注意：所有样品的孵育时间必须保持一致。</li>
		<li>立即在 -20 °C 下保存样品。</li>
		<li>在完成基础 CGRP 释放水平取样后，选择以下三种方法之一进行操作：(A) 单次刺激（步骤 5.2）；(B) 浓度-反应刺激（步骤 5.3）；以及 (C) 刺激抑制实验（步骤 5.4）（图 4）。 
		注意：所用测试化合物及其浓度取决于研究目的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行单次刺激实验。
	<ol>
		<li>向组织中加入测试化合物或溶剂，孵育 10 分钟（体积：小鼠 TG 和 TNC 为 250 µL，大鼠 TG 和 TNC 为 350 µL，每个大鼠颅骨为 400 µL）。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于含 50 µL 10 倍浓度 EIA 缓冲液的微量离心管中。弃去剩余液体，并立即将样品在 -20 °C 下保存。 
		注意：所有样品的孵育时间必须保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行浓度-反应刺激实验。
	<ol>
		<li>将测试化合物或溶剂稀释至所需浓度。从最低浓度开始，依次递增添加测试化合物。 
		注意：所用测试化合物及其浓度取决于研究目的。例如，本研究中使用了 1 µM、10 µM 和 100 µM 的 supercinnamaldehyde。</li>
		<li>将最低浓度（本研究中为 1 µM）的测试化合物及其对应的溶剂分别加入两组相同的组织样本中，孵育 10 分钟（体积：小鼠组织为 250 µL，大鼠 TG 和 TNC 为 350 µL，每个大鼠颅骨为 400 µL）。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于含 50 µL 10 倍浓度 EIA 缓冲液的微量离心管中。</li>
		<li>弃去剩余液体，向组织中加入第二低浓度（本研究中为 10 µM）的测试化合物。</li>
		<li>立即在 -20 °C 下保存样品。</li>
		<li>对剩余浓度（本研究中为 100 µM）重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行刺激抑制实验。
	<ol>
		<li>向组织中加入阻断剂或溶剂，孵育 10 分钟（体积：小鼠组织为 250 µL，大鼠 TG 和 TNC 为 350 µL，每个大鼠颅骨为 400 µL）。 
		注意：所用阻断剂及其浓度取决于研究目的。例如，代表性结果中使用了 3 µM 的格列本脲（glibenclamide）（图 5）。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于含 50 µL 10 倍浓度 EIA 缓冲液的微量离心管中。弃去剩余液体，并立即将样品在 -20 °C 下保存。</li>
		<li>向组织中加入激动剂或激动剂 + 阻断剂（参见材料表），孵育 10 分钟。 
		注意：所用激动剂、阻断剂及其浓度取决于研究目的。本研究中使用了 3 µM 格列本脲（glibenclamide）和 1 µM 辣椒素（capsaicin）（图 5）。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于含 50 µL 10 倍浓度 EIA 缓冲液的微量离心管中。弃去剩余液体，并立即将样品在 -20 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行实验的阳性对照。
	<ol>
		<li>在实验流程结束时，根据需要向组织中加入阳性对照（例如 1–10 µM 辣椒素，参见材料表），孵育 10 分钟后，取 200 µL 样品置于含 50 µL 10 倍浓度 EIA 缓冲液的微量离心管中。 
		注意：加入阳性对照有助于确认实验系统和组织功能正常。辣椒素48,49,50 或高钾去极化刺激（40–60 mM KCl）46,47,49 常用于诱导三叉血管系统释放 CGRP。40–60 mM KCl 的 SIF 溶液配制方法与 SIF 相同，仅以等摩尔量的 KCl 替代 NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
CGRP浓度分析
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用酶免疫分析（EIA）试剂盒（见材料表）测定释放的CGRP含量。</li>
	<li>使用酶标仪在410 nm处测定吸光度。如果使用其他CGRP EIA试剂盒，则按照制造商说明书提供的波长测定吸光度。 
	注意：样品必须稀释至与标准曲线相匹配的范围。</li>
	<li>进行数据分析。
	<ol>
		<li>数据可表示为绝对浓度，或相对于特定组织的基础CGRP释放量进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方法是在研究证实降钙素基因相关肽（CGRP）在偏头痛病理生理学中的重要性之后开发的。该方法非常适合研究三叉神经血管系统中CGRP释放所涉及的机制，而CGRP的释放对于头面部区域的痛觉信号传递至关重要。本模型所测得的CGRP释放量可直接反映来自支配硬脑膜、三叉神经节（TG）和三叉神经脊束核（TNC）的三叉神经的CGRP释放情况。该模型中CGRP的释放量在定量上显著高于人体热凝固后血浆中测得的CGRP释放量45,54，也高于猫三叉神经刺激时39,55,56以及偏头痛发作期间所测得的释放量23。一种可能的解释是，CGRP在血液中被稀释并降解54。然而需要注意的是，化学直接刺激可能比病理生理激活更为有效。此外，该方法的其他优势还包括：能够分别定位三叉神经血管系统内三个不同部位的CGRP释放，且可与药理学干预联合使用，适用于基因修饰啮齿类动物的组织样本。
近年来，许多临床前啮齿类动物模型侧重于通过全身给药的方式施用物质，并利用 von Frey 测试57,58、面部表情疼痛评分59,60,61 或畏光反应62,63,64 等指标来评估疼痛或偏头痛相关的行为学结果。这些方法有助于理解不同物质的致痛或镇痛特性。然而，这些方法无法提供有关具体靶组织的信息。在本方法中，三叉神经血管系统被划分为三个结构：硬脑膜、三叉神经节（TG）和三叉神经脊束核（TNC）。这使得能够对每个结构进行局部暴露，并评估特定物质的作用部位。该方法曾被应用于2011年的一项研究，探讨了电压门控钙通道在大鼠中的作用，结果发现这些通道在三叉神经血管通路的三个结构中的抑制效应存在差异47。在解剖神经系统结构时，轴突切断（axotomy）不可避免。已有研究表明，轴突切断会改变多种基因的转录水平65。这些转录水平的变化速度较慢，不足以影响本方法的实验结果；但与体内原位（in vivo）情况相比，不能排除磷酸化状态发生改变的可能性46。尽管降钙素基因相关肽（CGRP）等神经肽在胞体中合成，但其释放和作用通常发生在中枢或外周的神经末梢。因此，在研究神经肽释放时，包含末梢的完整神经元研究具有重要意义。为此，已建立从分离的神经节获取神经元进行培养的方法，以作为神经末梢的模型。然而，神经元细胞培养存在多种问题，例如机械性解离可能破坏培养中的神经元46。细胞培养所需较长的时间使该方法易受轴突切断及培养条件引起的转录组变化的影响65。此外，添加生长因子以及在包被表面进行培养会改变神经元的特性，如递质和受体的表达水平66,67,68,69。相比之下，研究新鲜分离的完整神经节可避免上述问题，优于使用神经元细胞培养。
一个挑战在于 离体 CGRP释放实验方法中，精确的组织分离是获得可重复结果的关键。尤其是TNC的准确分离具有挑战性，因为TNC是脑干内一个无明显边界的结构。此外，硬脑膜较为脆弱，脑组织的取出需谨慎操作，以确保结构完整。这些困难可能导致所获取的组织大小不一，从而引起基础状态及刺激诱导的CGRP水平出现差异。然而，这种变异可通过将数据标准化至基础CGRP释放量来校正。还应注意，在从小鼠分离TNC时，通常获取的是脑干的整个下部，而非像大鼠那样分离出更精确的含TNC区域。总体而言，使用大鼠组织具有一定优势，因其可实现从硬脑膜测量CGRP释放，并能更精确地分离TNC。此外，组织尺寸也允许使用同一只大鼠作为其自身的对照（vehicle control），因为一只大鼠可提供两个颅骨半片、两个三叉神经节（TG）和两个TNC，其中一份组织用于药物刺激，另一份用于对照处理。而使用小鼠时，每项实验需要两只动物，因为两个TG需合并为一个样本，且两个TNC被合并为一个脑干样本。因此，实验组使用两只小鼠的TG和一个脑干，对照组则使用另一只小鼠的TG和脑干。这导致为获得相同数量的重复样本，所需小鼠数量是大鼠的两倍。为减少小鼠使用数量，已有研究提出可通过脑干切片来检测CGRP释放的方法。49该方法已被改进以适用于小鼠，这是一大优势。这使得研究人员能够利用许多现成的转基因小鼠品系，从而为研究信号通路等提供有力工具。实验结束时应设置阳性对照，以确保实验所用组织能够释放降钙素基因相关肽（CGRP）。阳性对照可采用瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）激动剂辣椒素，或去极化刺激物氯化钾（KCl），这两种物质均已被证实可在小鼠和大鼠的三叉神经血管系统中诱导CGRP释放。46,47,48,49,50此外，该方法还已被改进用于检测其他相关肽类的释放，例如垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）。&#160;- 偏头痛研究中备受关注的另一种肽70.
该方法为研究大鼠和小鼠特定靶组织中降钙素基因相关肽（CGRP）的释放提供了一种有用的工具。这是一种相对较快的方法，避免了神经元培养相关的问题。该方法的实验方案可轻松修改，用于研究浓度-反应关系，或不同药理学化合物对反应的抑制作用。离体 CGRP释放方法是多种可用于研究CGRP以及与偏头痛病理生理学中CGRP释放相关机制的临床前方法之一。

偏头痛是一种神经系统疾病，据世界卫生组织（WHO）估计，全球有超过10亿人受其影响，是全球致残的主要原因之一1。因此，偏头痛对患者个人和社会均造成重大影响。尽管近年来降钙素基因相关肽（CGRP）拮抗药物在临床上取得了一定成功，但仍有大量患者需要更有效的治疗方案2,3,4,5。迫切需要阐明偏头痛的发病机制，以开发新的有效治疗方法。三叉神经血管系统内的信号传导，包括脑膜、三叉神经节（TG）和三叉神经脊束尾核（TNC），在偏头痛的病理生理过程中起核心作用6,7。
37个氨基酸的神经肽降钙素基因相关肽（CGRP）于20世纪80年代初首次被发现，当时Amara及其同事证明，降钙素基因的初级RNA转录本可被加工处理，生成除降钙素外还编码CGRP的mRNA8,9。随后的研究提示CGRP与偏头痛的病理生理学之间存在关联10。CGRP是一种具有强效血管舒张特性的神经递质11,12,13,14,15,16,17，且广泛分布于中枢和外周神经系统13,14,18,19,20,21,22。CGRP在偏头痛中的作用在人类研究中得到进一步证实：在偏头痛发作期间，颅外循环中的CGRP水平升高23，且输注CGRP可在患者中引发类似偏头痛的疼痛24。两年后，首个关于CGRP拮抗剂olcegepant治疗偏头痛有效性的概念验证研究发表25。
CGRP 在三叉神经血管系统中含量丰富，这已在三叉神经节（TG）21,26、支配硬脑膜的感觉神经纤维27,28,29 以及三叉神经颈复合体（TNC）30 中得到证实。在三叉神经血管系统中，CGRP 存在于 TG 的小到中等大小神经元中，位于无髓鞘的 C 纤维内，并在 TG 神经元群体中约有近 50% 表达该肽。CGRP 受体主要表达于较大的神经元中，并存在于有髓鞘的 Aδ 纤维中31,32。CGRP 可在化学或电刺激下从神经元释放33,34。研究导致 CGRP 释放的通路及其激活部位，对于理解偏头痛的病理生理机制至关重要。在过去五十年中，临床前研究极大地增进了我们对偏头痛相关信号通路的认识，并推动了新疗法的开发35。许多涉及血管性和神经源性机制的方法已被改进并应用于偏头痛研究。例如，可采用体内（in vivo）和体外（in vitro）模型研究动脉对生物化合物或药物处理的反应17,36,37，以及电刺激神经的模型38,39。此外，可通过检测 TNC 区域 c-Fos 的表达40,41,42 或该区域的电生理记录43,44 来识别被激活的神经元。这两种方法均可测量从头部（如硬脑膜）传递至大脑的伤害性信号。单一的临床前模型无法全面反映偏头痛的病理生理全貌，因此，结合多种模型以尽可能覆盖偏头痛病理生理的各个方面显得尤为重要。随着新模型的持续开发，将逐步揭示偏头痛机制的不同层面，最终解开偏头痛病理生理的奥秘。
本文详细介绍了在小鼠分离的三叉神经节（TG）和三叉神经颈复合体（TNC）中进行化学刺激后，以离体（ex vivo）方式检测降钙素基因相关肽（CGRP）释放的技术方案。此外，CGRP 的释放也可在大鼠的硬脑膜组织中进行研究。因此，在大鼠的实验方案中，硬脑膜与 TG 和 TNC 一并加以描述。CGRP 释放检测方法的基础最早于 1999 年由 Ebersberger 及其同事首次报道，他们开展了先驱性研究，发现对大鼠硬脑膜传入神经进行化学和电刺激后，可引起硬脑膜组织释放 CGRP45。此后，该方法被扩展应用于 TG46 和 TNC47 中的 CGRP 释放研究。随后，该技术进一步改进，适用于小鼠的 TG 和 TNC 组织。迄今为止，在小鼠硬脑膜中检测 CGRP 释放仍具有挑战性。

<table><tbody><tr><td>6孔培养板</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>塑料容器盖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>辣椒素</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP试剂盒</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Strandm&amp;oslash;llen</td><td>4.6</td><td>用于SIF的碳合气体处理</td></tr><tr><td>精细骨剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>格列本脲</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>大鼠断头器</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>微量离心管及管盖</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>小型手锯</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Strandm&amp;oslash;llen</td><td>4.5</td><td>用于SIF的碳合气体处理</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Glostrup pharmacy</td><td>NA</td><td>复方制剂</td></tr><tr><td>塑料容器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪 - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200已停产，Tecan提供Infinite 200 PRO。&lt;br/&gt; 软件：SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>S9888</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钠</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>用于SIF缓冲液</td></tr><tr><td>超肉桂醛</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>纱布（织物）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>在当地织物商店购买</td></tr></tbody></table>

离体 条件下啮齿类动物三叉血管系统降钙素基因相关肽的释放

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

降钙素基因相关肽（CGRP）于20世纪80年代首次被发现，是降钙素基因的一种剪接变体。自发现以来，其在偏头痛病理生理学中的作用已得到充分证实，最初基于其强大的血管扩张特性，随后则因其在感觉三叉神经血管系统中作为神经递质的存在与功能而进一步明确。CGRP能够诱发偏头痛，这一特性促使制药行业开发出单克隆抗体和拮抗剂，以抑制CGRP的作用。一种新的治疗范式在偏头痛的预防性治疗中已被证明有效。为进一步理解偏头痛机制，一种有用的工具是三叉神经血管系统中CGRP释放的ex vivo模型。这是一种相对简单的方法，可结合多种药理学工具使用，有助于掌握开发新型有效偏头痛疗法所需的知识。本方案描述了一种CGRP释放模型，以及定量评估药理学试剂对啮齿类动物三叉神经血管系统释放CGRP量影响的技术。文中提供了从安乐死到蛋白质水平检测的完整实验操作流程。详细描述了从小鼠和大鼠中分离三叉神经节与三叉神经尾核的关键步骤，以及大鼠硬脑膜的制备方法。此外，还展示了来自两种动物（大鼠和小鼠）的代表性实验结果。该技术是研究偏头痛病理生理过程中涉及的分子机制的关键工具，可用于多种药理学化合物及基因修饰动物的研究。

该技术是研究偏头痛中与降钙素基因相关肽（CGRP）相关的分子机制的工具。其优势在于能够评估三叉神经血管系统不同水平释放的CGRP，并可结合多种药理学化合物，应用于野生型及转基因小鼠和大鼠。本文展示了大鼠的浓度-反应与阻断实验结果，以及野生型和转基因小鼠的浓度-反应结果。
采用CGRP释放方法研究KATP通道抑制剂格列本脲对雌性自发性三叉神经异常性疼痛（STA）大鼠三叉神经节（TG）和硬脑膜中CGRP释放的影响。首先通过浓度-反应实验设计确定辣椒素的最佳作用浓度。与溶剂对照组相比，辣椒素刺激可显著诱导硬脑膜和TG释放CGRP（图5）。在硬脑膜中，1 µM辣椒素诱导的CGRP释放达到最大值；而在TG中，最大CGRP释放出现在10 µM辣椒素刺激下（图5A-B）。根据浓度-反应实验结果，阻断实验采用1 µM辣椒素和3 µM格列本脲。采用单因素方差分析分析显示，格列本脲对硬脑膜（P = 0.441）和TG（P = 0.881）的基础CGRP释放无显著影响51。与仅用辣椒素加溶剂处理组相比，格列本脲可显著降低辣椒素诱导的硬脑膜CGRP释放达40%（P = 0.031），TG中CGRP释放降低39%（P = 0.003），差异具有统计学意义，经单因素方差分析验证（图5C-D）51。
在小鼠中，该方案用于研究瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）离子通道在硝酸甘油（GTN）诱导的偏头痛小鼠模型中的作用，其中GTN引起的高敏感性完全依赖于TRPA1通道。TRPA1激动剂超级肉桂醛（SCA）以剂量依赖的方式从三叉神经节（TG）释放降钙素基因相关肽（CGRP），当使用1 µM、10 µM和100 µM的SCA处理时，与对照组相比，CGRP释放量分别增加9%（P = 0.23）、51%（P = 0.011）和69%（P = 0.0097），经双因素方差分析（two-way ANOVA）确认。而在Trpa1基因敲除小鼠的三叉神经节中，该释放效应消失：暴露于1 µM、10 µM和100 µM SCA后，与对照组相比，CGRP释放量的变化分别为11%（P &gt; 0.99）、-13%（P &gt; 0.99）和9%（P = 0.97），同样经双因素方差分析确认。随后使用10 µM辣椒素（阳性对照）进行刺激，结果显示所有组织样本均能释放CGRP（图6）50。
<img alt="显示使用器械逐步进行组织解剖的过程，突出精确的生物实验室技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：大鼠组织的逐步解剖过程。 （A-T）的详细信息见实验方案部分（步骤 3.1）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑组织解剖步骤；详细操作；手术器械；组织提取；教学指南。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠组织的分步解剖示意图。（A-T）的详细说明见实验方案部分（步骤 3.2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织去细胞化过程；带有容器和组织样本的实验装置，用于分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：啮齿类动物组织的洗涤与孵育。（A-B）置于塑料容器中含SIF的新鲜分离组织。容器覆盖纱布以方便更换SIF。（C）大鼠组织——两个带有硬脑膜覆盖颅内内衬的颅骨半片，放置于6孔培养板上。右侧和左侧三叉神经脊束核分别置于独立的微量离心管盖中（上排管盖）。两个三叉神经节分别置于各自的微量离心管盖中（下排管盖）。（D）小鼠组织——包含三叉神经脊束核的脑干部分置于一个单独的微量离心管盖中（上）。两只小鼠的三叉神经节共同置于一个微量离心管盖中（下）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="刺激方案示意图；单次刺激、浓度-反应、抑制；溶液添加时间线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：CGRP释放实验的设计方案。 三种不同的CGRP释放实验操作方案。药物需用人工间质液（SIF）稀释。(A) 单次刺激。(B) 浓度-反应刺激。(C) 刺激的抑制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="辣椒素在不同浓度下对CGRP水平的影响；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：格列本脲抑制辣椒素诱导的大鼠硬脑膜和三叉神经节释放CGRP。 从雌性自发性三叉神经异常性疼痛（STA）大鼠（215–318 g，最初来源于Thomas Jefferson University52）分离得到的三叉神经节和硬脑膜中的CGRP水平使用商用的人CGRP酶免疫分析（EIA）试剂盒进行测定。(A–B) 在不同浓度辣椒素（10 nM、100 nM、1 µM 和 10 µM）处理后，(A) 硬脑膜和 (B) 三叉神经节中CGRP的释放（n = 4）。数据以单个数据点表示，并采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析。****p &lt; 0.0001。(C–D) 经10分钟暴露于溶剂对照、3 µM格列本脲（glib）、1 µM辣椒素以及1 µM辣椒素+3 µM格列本脲后，(C) 硬脑膜和 (D) 三叉神经节中释放的CGRP水平（n = 6–11）。数据以单个数据点及均值表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。*与溶剂对照组比较。#辣椒素组与辣椒素+格列本脲组比较。#P &lt; 0.05，** 和 ##P &lt; 0.01，****P &lt; 0.0001。所有分析均随后进行Bonferroni多重比较检验。所有检验的显著性水平设定为α = 0.05。本图经Christensen等.51修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="野生型和 Trpa1 基因敲除组中不同 SCA 浓度下 CGRP 浓度的柱状图，对比分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：SCA 暴露可导致小鼠三叉神经节中依赖 TRPA1 的 CGRP 释放。 使用大鼠 CGRP 酶免疫分析试剂盒检测来自野生型（WT）和 Trpa1 基因敲除（Trpa1tm1/Dpc）53 雄性小鼠（8–10 周龄）的离体三叉神经节在暴露于 1 µM、10 µM 和 100 µM 超级肉桂醛（SCA）以及作为阳性对照的 10 µM 辣椒素后释放的 CGRP 水平（n = 6）。每只小鼠的数据以单独的数据点表示，条形图表示平均值。统计学分析：采用双因素重复测量方差分析对各浓度下 SCA 与溶剂对照组之间以及基础水平与阳性对照组之间进行比较。显著性水平设为 α = 0.05。*P &lt; 0.05，**P &lt; 0.01。该图改编自 Christensen 等。50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本实验方案描述了 离体 降钙素基因相关肽（CGRP）释放模型及定量评估药理学药物对啮齿类动物三叉血管系统释放CGRP量影响的策略。

降钙素基因相关肽（CGRP）于20世纪80年代首次被发现，是降钙素基因的一种剪接变体。自发现以来，其在……中的作用

该方法是一种用于研究三叉神经血管系统中CGRP释放机制的工具。此方法的主要优势在于能够将三叉神经血管系统划分为三个不同部位，并分别评估每个独立部位中CGRP的释放情况。本次实验操作将由我本人以及来自我们团队的高级科学家Inger Jansen-Olesen共同演示。首先，使用剪刀去除头颈部周围的皮肤和肌肉，以制备大鼠组织。接着，使用骨剪和剪刀将下颌与头部分离。然后，将骨剪从椎骨的背侧尾端插入，暴露脊髓和脑干，并将其去除。然后沿枕骨和顶间骨的边界剪断颅骨的尾侧部分，以去除这些骨性结构，暴露小脑。为分离位于两侧、从前囟向尾侧约13至16毫米处走行的三叉神经脊束核（TNC），使用弹簧剪剪断脑干的背外侧部分。随后将左侧和右侧的TNC组织浸入SIF溶液中。接下来，使用锯子沿正中矢状面切割头部，将颅骨分为两半。现在用解剖刀小心地取出脑组织，注意不要触碰附着在颅骨上的硬脑膜。为分离三叉神经节（TG），需连同其分支一并切下，范围包括视觉边界处的下颌支穿行于卵圆孔，以及眼支和上颌支进入颅骨的区域。然后将颅骨半片和三叉神经节（TGs）浸入SIF中。制备小鼠组织时，使用剪刀去除头颈部周围的皮肤和肌肉。现在将剪刀从椎骨背侧尾端插入，暴露脊髓和脑干，并将其取出。然后沿枕骨和顶间骨的边界切断颅骨的尾部，去除这些骨结构以暴露小脑。将顶骨沿正中矢状面切开并移除骨片，以暴露大脑。使用刮匙小心地移除小脑，以暴露脑干。使用弹簧剪分离含有三叉神经节（TNC）的脑干部分，随后将脑干浸入SIF中。现在用解剖刀小心移除脑组织，并在三叉神经进入脑干处将其切断。为分离三叉神经节（TG），需沿其分支的可视边界进行切割，包括经卵圆孔进入的下颌支，以及进入颅骨的眼支和上颌支。接下来，将TGs浸入SIF中。为便于更换SIF，可在塑料容器上加装网格盖，然后开始用SIF清洗大鼠和小鼠组织，每次更换SIF，持续30分钟，每5分钟更换一次。在室温下清洗30分钟后，将大鼠TNC半片和大鼠TGs分别转移至含有350微升SIF的微量离心管管盖中。将带有三叉神经节（TNC）的小鼠脑干转移至含有250微升SIF的微量离心管管盖中。最后，将两只小鼠的三叉神经节（TG）转移至另一含有250微升SIF的微量离心管管盖中。将大鼠颅骨半片置于六孔培养板中，并向颅骨内加入400微升SIF。将大鼠头骨与大鼠和小鼠组织一起放入微量离心管盖中，置于37摄氏度的加湿培养箱内。用移液器每5分钟更换一次SIF，持续20分钟，操作时勿触碰组织。通过适当标记准备用于样品收集的微量离心管。然后向每个微量离心管中加入 50 微升 10 倍浓度的 EIA 缓冲液。接下来，通过在 SIF 中稀释配制所有浓度的待测化合物溶液和溶剂对照溶液。最后一次洗涤后，向小鼠 TG 和 TNC 中各加入 250 微升 SIF，向大鼠 TG 和 TNC 中各加入 350 微升 SIF，向每只大鼠颅骨中加入 400 微升 SIF。孵育10分钟后，取200微升样品加入预先标记的微量离心管中，加入50微升10倍浓度的EIA缓冲液，以检测基础降钙素基因相关肽（CGRP）的释放量。弃去剩余液体，并立即将样品在-20摄氏度保存。在相应的溶剂中按浓度从低到高的顺序加入待测化合物，每种浓度依次加入，并孵育10分钟。孵育10分钟后，取200微升样品加入预先标记的微量离心管中，管内含50微升10倍浓度的EIA缓冲液。弃去剩余液体，并向组织中加入第二低浓度的试剂。立即将样品置于-20摄氏度保存，并对剩余浓度重复此操作步骤。为实验设置阳性对照，在实验方案结束时向组织中加入阳性对照。孵育10分钟后，取200 µL样品加入含有50 µL 10倍浓度EIA缓冲液的微量离心管中。使用EIA试剂盒按照试剂盒提供的制造商说明书测定所收集样品中释放的CGRP浓度。在大鼠中，与对照溶剂相比，辣椒素暴露可显著诱导硬脑膜和三叉神经节（TG）释放降钙素基因相关肽（CGRP）。在硬脑膜中，辣椒素浓度为1微摩尔时CGRP释放量达到最高；而在三叉神经节中，辣椒素浓度为10微摩尔时CGRP释放量达到最高。采用单因素方差分析时，格列本脲对硬脑膜和三叉神经节（TG）的基础降钙素基因相关肽（CGRP）释放无影响。与溶剂对照组相比，格列本脲显著降低了辣椒素诱导的硬脑膜CGRP释放40%，以及三叉神经节CGRP释放39%，该结果经单因素方差分析确认。瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）激动剂超级肉桂醛可浓度依赖性地促进三叉神经节释放CGRP，当使用双向方差分析时，1、10和100微摩尔的超级肉桂醛分别导致CGRP释放量较溶剂对照组增加9%、52%和69%。在瞬时受体电位锚蛋白1基因敲除小鼠的三叉神经节中，该CGRP释放增加效应消失；使用双向方差分析时，暴露于1、10和100微摩尔的超级肉桂醛后，CGRP释放量相对于溶剂对照组的变化分别为11%、-13%和9%。在样本采集过程中，必须注意避免触碰组织，并在所有样本的孵育时间上保持精确。如果有充足的ELISA试剂盒，可应用此方法检测三叉神经血管系统中其他肽类的释放情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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