离体 啮齿动物三叉血管系统中降钙素基因相关肽的释放

本协议描述了 离体 降钙素基因相关肽（CGRP）释放模型以及量化药理学药物对啮齿动物三叉神经血管系统释放的CGRP量的影响的策略。

该方法是研究三叉血管系统CGRP释放机制的工具。该方法的主要优点是能够将三叉血管系统分为三个不同的部位，并评估每个不同部位内CGRP的释放。演示该程序的将是我和我们小组的资深科学家Inger Jansen-Olesen。

首先，通过使用剪刀去除头部和颈部周围的皮肤和肌肉来准备大鼠组织。接下来，使用骨头修剪器和一把剪刀将下颌与头部分开。现在通过将骨修剪器尾部插入椎骨的背侧并将其移除来暴露脊髓和脑干。

然后通过枕骨和顶间骨的边界切割颅骨的尾部以去除这些骨结构，露出小脑。为了隔离每侧距前膛约 13 至 16 毫米尾部的 TNC，请用弹簧剪刀剪断脑干的背外侧部分。接下来是将左右两侧的TNC浸入SIF中。

接下来，用锯子将头部切成两半。现在小心地取出大脑，不要用刮刀接触附着在颅骨上的硬脑膜。为了隔离TG，将其切割，包括其围绕视觉边界的分支，下颌分支进入卵圆孔，眼科和上颌分支进入颅骨。

然后将颅骨和TG浸入SIF中。要准备小鼠组织，请使用剪刀去除头部和颈部周围的皮肤和肌肉。现在通过将一把剪刀尾部插入椎骨的背侧并将其取出来暴露脊髓和脑干。

然后通过枕骨和顶间骨的边界切割颅骨的尾部，以去除暴露小脑的这些骨结构。在下垂中部切开顶骨并去除骨头以露出大脑。小心地取出小脑，用刮刀暴露脑干。

用弹簧剪刀分离含有部分脑干的TNC，然后将脑干浸入SIF中。现在用刮刀小心地取出大脑，并切断进入脑干的三叉神经。为了隔离TG，将其切割，包括其与下颌分支的视觉边界周围的分支，在那里它进入卵圆孔，眼科和上颌分支进入颅骨。

接下来，将 TG 浸入 SIF 中。为了便于更换SIF，请在塑料容器上添加一个收费盖，然后每五分钟更换一次SIF，开始在SIF中清洗大鼠和小鼠组织30分钟。在室温下洗涤30分钟后，将大鼠TNC和大鼠TG转移到带有350微升SIF的微量离心管盖中。

用TNC将小鼠脑干转移到装有250微升SIF的微量离心管帽中。最后，将两个小鼠TG转移到装有250微升SIF的微量离心管帽中。将大鼠头骨的两半放在六孔培养板上，并用400微升SIF填充颅骨。

将大鼠头骨放入带有大鼠和小鼠组织的微量离心管帽中，置于37摄氏度的加湿培养箱中。每五分钟使用移液器更换SIF，持续20分钟，不要接触组织。通过适当的标签准备用于样品收集的微量离心管。

然后向每个微量离心管中加入50微升10强度EIA缓冲液。接下来，通过稀释所有浓度的SIF来制备测试化合物溶液和载体溶液。最后一次洗涤后，向小鼠TG和TNC中加入250微升SIF，向大鼠TG和TNC中加入350微升SIF，向每只大鼠头骨添加400微升SIF。

孵育 10 分钟后，在带有 50 μL 10 强度 EIA 缓冲液的预标记微量离心管中收集 200 μL 样品，以便测量基础 CGRP 释放。丢弃剩余的液体，并立即将样品储存在零下20摄氏度。从最低浓度开始，将测试化合物以递增浓度加入相应的载体中，并孵育10分钟。

孵育10分钟后，将200微升样品收集在带有50微升10强度EIA缓冲液的预标记微量离心管中。丢弃剩余的液体，并将第二低的浓度添加到组织中。立即将样品储存在零下20摄氏度，并以剩余浓度重复此过程。

要对实验进行阳性对照，请在方案结束时将阳性对照添加到组织中。孵育10分钟后，在具有50微升10强度EIA缓冲液的微量离心管中收集200微升样品。收集的样品中释放的CGRP浓度是使用EIA试剂盒测量的，同时遵循EIA试剂盒随附的制造商说明。

在大鼠中，与载体相比，辣椒素暴露诱导硬脑膜和TG释放显着的CGRP释放。在硬脑膜中，在一微摩尔辣椒素处发现了CGRP的最大释放量。在TG中，在10微摩尔辣椒素中发现最大的CGRP释放。

当用单因子方差分析分析时，格列本脲对硬脑膜和TG的基础CGRP释放没有影响。当用单因素方差分析分析时，与辣椒素相比，格列本脲显着减少了硬脑膜中辣椒素诱导的CGRP释放40%，TG降低了39%。发现瞬时受体电位Ankyrin-1激动剂超级肉桂醛以浓度依赖性方式从TG释放CGRP，与载体相比，使用双向方差分析时，与载体相比，CGRP的释放分别增加了9%52%和69%。当用双向方差分析分析时，瞬时受体电位Ankyrin-1敲除小鼠的TG中不存在CGRP释放的增加，其中暴露于1，10和100微摩尔的超级肉桂醛导致CGRP释放分别减少11%负13%和9%变化。

重要的是在样品采集过程中注意不要接触组织，并且在确定所有样品的孵育时间时要精确。如果有足够的ELISA试剂盒可用，则可以应用该程序来测量三叉血管系统中存在的其他肽的释放。