Name: 结合人体类器官和芯片器官技术，对肠道区域特异性功能进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解如何将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术相结合，构建模拟人体肠道生理功能的微生理平台。该方法可用于预测药代动力学、药物相互作用及研究肠道屏障功能障碍。

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感谢 Mark Donowitz 教授提供肠道活检来源的类器官，感谢 Brett Clair 设计芯片、便携式设备和培养模块的科学示意图。其余所有科学示意图均使用 BioRender 生成。

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<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
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<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
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<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
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<li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li>
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<li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li>
<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
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Gauri Kulkarni、Athanasia Apostolou、Lorna Ewart、Carolina Lucchesi 和 Magdalena Kasendra 现为或曾为 Emulate 公司的员工，可能持有该公司股权。Emulate 公司是生产器官芯片设备的企业，并已就本文所述工作发表相关专利。

器官芯片技术与肠道类器官的结合为精确模拟人体肠道生理和病理生理过程提供了前景。本文提供了一种简单且可靠的分步操作方案（如图1所示），用于建立包含活检来源的小肠或结肠上皮以及肠道微血管内皮细胞的肠道芯片，这些细胞共培养于微流控装置中。该基于芯片的人体肠道模型整合了生理性的管腔和血管流动以及类似蠕动的运动。此外，我们还描述了评估关键肠道功能的操作流程，例如十二指肠芯片中的药物代谢和结肠芯片中的屏障功能。
为了重现上皮-内皮细胞相互作用（这对维持肠道稳态以及在芯片上准确模拟肠组织至关重要），必须在PDMS膜的两侧建立功能完整且结构完整的细胞单层。成功进行芯片接种的第一步是化学活化PDMS表面，以形成PDMS表面与细胞外基质（ECM）蛋白之间的稳定连接。活化不当可能阻碍细胞附着，导致形成不完整的细胞单层。活化溶液必须新鲜配制，因其对光敏感且易降解。在紫外（UV）活化及后续ECM包被过程中，需确保每条通道内试剂均匀分布。用于包被顶部和底部通道的溶液其具体成分和浓度已分别针对上皮细胞和内皮细胞的需求进行了优化。如果需要改变肠道芯片中的...

人类肠道是一个复杂且具有多种功能的器官，具备自我再生能力。它分为小肠和大肠。小肠的主要功能是进一步消化来自胃的食物，吸收所有营养物质，并将残余物输送至大肠，由大肠回收水分和电解质。小肠又进一步分为多个解剖结构上不同的区域：十二指肠、空肠和回肠，每个区域均适应执行特定功能。例如，十二指肠有助于&#160;分解食糜（胃内容物），从而促进空肠对蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质的充分吸收。小肠的这一近端部分也是肠道药物吸收和代谢的主要部位，其药物代谢酶（如 CYP3A4）的表达水平高于回肠和结肠1。除了消化和吸收营养物质的主要功能外，肠道还对潜在有害的管腔内容物（如致病微生物、微生物代谢产物、食物抗原和毒素）构成有效的屏障2,3。值得注意的是，人类结肠中栖居着大量微生物，其数量远超人体自身细胞总数，这些微生物在营养、代谢和免疫方面为宿主提供诸多益处。因此，维持由肠上皮细胞形成的黏膜屏障完整性至关重要，它通过物理隔离肠道微生物群与宿主细胞，防止不必要的免疫细胞活化，从而保障两者之间的共生关系2。此外，程序性肠细胞死亡作为一种自我保护机制，可防止感染细胞持续存在或增殖，从而阻止潜在病原体扩散3；与此同时，肠上皮每四到七天持续进行自我更新，以弥补细胞丢失，确保屏障完整性和组织稳态。上述肠道功能的损害，包括营养吸收障碍、屏障完整性受损，或肠细胞死亡与自我更新之间的失衡，可能导致多种胃肠道疾病的发生，包括&#160;营养不良和炎症性肠病（IBD）2,3。
此前，动物模型和转化的癌症来源肠道细胞系已被用于研究人类肠道组织的生理和病理生理功能。然而，由于动物与人类之间存在显著的物种差异，动物研究结果向人类的可转化性日益受到关注，这凸显了对与人类相关的替代方法的需求。4常用的 体外 肠上皮细胞系包括 T84、Caco-2 和 HT29 细胞。尽管这些细胞系可模拟肠道屏障功能和膜转运的某些方面，但其药物代谢酶的表达水平存在改变。5、表面受体和转运蛋白4此外，它们缺乏肠道节段特异性，且无法重现肠道上皮的复杂性，每种模型仅包含肠道五种上皮细胞类型中的一种6.
最近，利用小肠和结肠新鲜活检组织建立的人类肠道类器官培养体系7,8 或诱导性多能干细胞（iPSC）9 被引入作为替代性实验模型&#160;有望在未来补充、减少甚至替代动物实验。尽管iPSCs可通过非侵入性方式获取，但从iPSCs建立类器官需要采用复杂且耗时的实验流程（包含多个实验步骤），并产生类似于人类胎儿组织的培养物。相比之下，活检来源的类器官具有高度可扩展性，因其可利用肠道组织固有的自我更新能力，并可实现无限次传代与扩增 体外重要的是，活检来源的类器官能够维持其原始组织的疾病特征和肠道区域特异性，并模拟肠道上皮的细胞多样性。类器官可作为患者特异性的替身模型 体外 以揭示各种胃肠道疾病的生物学机制和发病过程，并改善其治疗管理。尽管肠道类器官已实现较高的生理功能水平，但由于缺乏关键的间质成分——包括血管、结缔组织、外周神经和免疫细胞——以及机械刺激，仍无法完全模拟天然器官的复杂性。已知流体流动、剪切应力、拉伸和压力等机械参数会影响组织的形态发生和稳态维持 体内 并且先前已被证明可促进细胞的成熟 体外10,11,12,13类器官系统另一个重要的缺点是其腔内环境难以接近，从而导致上皮细胞的顶膜侧无法触及。这为研究与离子和药物转运蛋白的极性表达、宿主-微生物组相互作用以及药物毒性检测相关的多种机制带来了挑战。最后，由于类器官培养具有一定的随机性，其在大小、形态和功能方面存在显著的变异性。&#160;体外 自组织过程与细胞命运选择。因此，为了充分发挥肠道类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学中的潜力，有必要探索新的策略，以减少类器官发育过程中的变异性，改善对腔内区域的可及性，并引入缺失的细胞间相互作用。
器官芯片技术已引入多种方法，将机械力和流体流动整合到肠道细胞培养中 体外然而，由于大多数初期概念验证研究使用的是癌症来源的细胞系，其细胞多样性不足，这些系统的相关性受到了质疑。最近，我们协同结合了肠道类器官与器官芯片技术，将两种方法的优势整合于一体 体外 系统14,15,16. 所获得的肠芯片可重现&#160;多细胞的&#160;肠道上皮结构、上皮-内皮组织界面的存在，以及流体流动和拉伸的机械力，从而实现器官水平功能的模拟 体外此外，使用源自原代组织的类器官（可取自人肠道的不同区域）作为起始材料，进一步提高了该模型的多功能性，因为通过类似的接种和培养流程，可建立代表人十二指肠、空肠、回肠和结肠的芯片模型。重要的是，肠芯片可实现对以下方面的实时评估：肠道屏障完整性；刷状缘及药物代谢酶活性；黏蛋白的生成；细胞因子的分泌；以及肠细胞与致病性和共生微生物的相互作用，这已在先前发表的研究中得到证实。值得注意的是，当利用不同个体组织来源的类器官构建肠芯片时，这些模型能够再现不同供体在对各种药物和处理产生功能反应时所预期的个体间差异。综上所述，&#160;将类器官与器官芯片技术融合，为更先进、个性化的研究开辟了新途径， 体内-相关&#160;可提高生理相关性和准确性的模型 体外 研究结果及其向人类的推演。本文提供了一项详细的实验方案&#160;建立肠芯片及其在研究十二指肠和结肠两个肠段生理功能中的应用。首先，评估药物代谢酶活性的方法&#160;CYP3A4&#160;在十二指肠芯片中描述了其由利福平和维生素D3等典型化合物诱导的情况。其次，该方案概述了在结肠芯片中建立“肠漏”模型所需的步骤，通过使用在炎症性肠病（IBD）发病机制中起关键作用的标志性细胞因子来破坏上皮屏障。简而言之，来源于人活检组织的类器官被扩增培养 体外，经酶消化处理后，引入芯片的上层通道中。在持续灌注含生长因子培养基的条件下&#160;它们会发育成具有三维结构和易于接触的顶端细胞表面的融合上皮单层。底部 &#34;血管的&#34; 芯片腔室中接种从小肠或大肠分离的微血管内皮细胞。上皮层与内皮层之间由一层多孔可拉伸膜隔开，该膜可促进两种组织之间的旁分泌相互作用，并在受到周期性形变时模拟人体肠道的蠕动样运动。共培养体系通过管腔和血管侧灌注适当的细胞培养基，维持动态流动条件。最后，我们描述了多种类型的检测方法及终点分析&#160;可直接在芯片上或从采集的细胞培养流出物中进行。

<table><tbody><tr><td>小肠 人肠微血管内皮细胞</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存</td></tr><tr><td>人肠微血管内皮细胞</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存</td></tr><tr><td>活检来源的人类十二指肠类器官</td><td>约翰斯·霍普金斯大学</td><td>-</td><td>类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。</td></tr><tr><td>活检来源的人结肠类器官</td><td>约翰斯·霍普金斯大学</td><td>-</td><td>类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。</td></tr><tr><td>动物学&amp;euml; CM-1&amp;trade;&amp;nbsp;培养模块</td><td>模拟&amp;nbsp;公司</td><td>-</td><td>培养模块</td></tr><tr><td>Orb-HM1&amp;trade;&amp;nbsp;集线模块</td><td>模拟&amp;nbsp;公司</td><td>-</td><td>5% CO2、真空拉伸和电源供应</td></tr><tr><td>Chip-S1&amp;trade; 可拉伸芯片</td><td>模拟&amp;nbsp;公司</td><td>-</td><td>器官芯片</td></tr><tr><td>豆荚&amp;trade; 便携式模块</td><td>模拟&amp;nbsp;有限公司</td><td>-</td><td>便携式模块</td></tr><tr><td>紫外光箱</td><td>模拟&amp;nbsp;公司</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>芯片支架</td><td>模拟&amp;nbsp;有限公司</td><td>-</td><td>每平方培养皿1个</td></tr><tr><td>Steriflip&amp;reg;-高压过滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;mu;m&amp;nbsp;PVDF滤膜</td></tr><tr><td>方形细胞培养皿（120 x 120 mm）</td><td>VWR</td><td>82051-068</td><td>-</td></tr><tr><td>手持式&amp;nbsp;真空&amp;nbsp;吸液器</td><td>康宁</td><td>4930</td><td>&amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>吸取&amp;nbsp;移液器</td><td>Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL，&amp;nbsp;聚苯乙烯，单独地&amp;nbsp;包裹</td></tr><tr><td>吸液头</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td><td>无菌（高压灭菌）</td></tr><tr><td>血清学&amp;nbsp;移液器</td><td></td><td>&amp;nbsp;-</td><td>2 mL，5 mL，&amp;nbsp;10 mL&amp;nbsp;和&amp;nbsp;25 mL&amp;nbsp;低内毒素，无菌</td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td>P20、P200&amp;nbsp;P1000&amp;nbsp;和标准多通道</td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;提示&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20，P200，&amp;nbsp;和&amp;nbsp;P1000</td></tr><tr><td>锥形管&amp;nbsp;（蛋白质&amp;nbsp;LoBind&amp;reg; 管子</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216;&amp;nbsp;0030122240</td><td>15 mL、50 mL 离心管</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;管子&amp;reg;&amp;nbsp;低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>1.5 mL 离心管</td></tr><tr><td>96孔黑色壁板</td><td>-</td><td>-</td><td>用于上皮通透性分析</td></tr><tr><td>显微镜（带相机）</td><td>-</td><td>-</td><td>明场&amp;nbsp;成像</td></tr><tr><td>水浴（或珠子）</td><td>-</td><td>-</td><td>设定为37&amp;deg;C</td></tr><tr><td>真空装置</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>-</td><td>最低限度&amp;nbsp;压力：-70 kPa</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>细胞培养瓶</td></tr><tr><td>Emulate Reagent-1&amp;nbsp;(ER-1)</td><td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>芯片包被液</td></tr><tr><td>Emulate Reagent-2&amp;nbsp;(ER-2)</td><td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>芯片包被液</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;（DPBS）</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>康宁</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>93595</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>TryplE&amp;nbsp;表达</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学的</td><td>12604013</td><td>类器官&amp;nbsp;解离&amp;nbsp;和内皮细胞&amp;nbsp;脱离&amp;nbsp;溶液</td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学的</td><td>12634028</td><td>培养基</td></tr><tr><td>IntestiCult&amp;trade; 类器官生长培养基（人源）</td><td>干细胞技术</td><td>06010</td><td>类器官生长培养基</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>内皮细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>血清</td></tr><tr><td>Primocin&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td><td>抗菌剂</td></tr><tr><td>附着因子&amp;trade;</td><td>细胞系统</td><td>4Z0-210</td><td>培养瓶包被液</td></tr><tr><td>基质胶 - 生长因子减量型</td><td>康宁</td><td>356231</td><td>可溶性基底膜基质</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>细胞外基质组分</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>康宁</td><td>356008</td><td>细胞外基质组分</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>干细胞技术</td><td>72304</td><td>类器官培养基添加剂</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>类器官培养基添加剂</td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>康宁</td><td>354253</td><td>基底膜基质解离溶液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30%，无菌</td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>康宁</td><td>MT25055CV</td><td>无菌水</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>3KDa 蓝色级联葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg 粉末</td></tr><tr><td>利福平（RIF）</td><td>Sigma</td><td>货号 R3501</td><td>CYP诱导剂</td></tr><tr><td>睾酮水合物</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>CYP 底物</td></tr><tr><td>1,25-二羟基维生素 D3（VD3）</td><td>Sigma</td><td>货号 D1530</td><td>CYP 诱导剂</td></tr><tr><td>含0.1%（v/v）甲酸的乙腈</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>LCMS终止液</td></tr><tr><td>IFN&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>抗Occludin</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学</td><td>33-1500</td><td>紧密连接标志物</td></tr><tr><td>抗Claudin 4</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学的</td><td>36-4800</td><td>紧密连接标志物</td></tr><tr><td>抗E-钙黏蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>上皮黏附连接标记物</td></tr><tr><td>抗VE-钙黏蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>内皮黏附连接标志物</td></tr><tr><td>抗紧密连接蛋白1（ZO-1）</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>紧密连接标志物</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学的</td><td>62248</td><td>核染色</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>RNA裂解、分离与纯化试剂盒</td></tr><tr><td>SuperScript&amp;trade; IV VILO&amp;trade; 预混液</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>TaqMan&amp;trade; 快速高级预混液</td><td>应用生物系统公司</td><td>4444557</td><td>qPCR 试剂</td></tr><tr><td>QuantStudio&amp;trade; 5 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>应用生物系统公司</td><td>A28573</td><td>实时荧光定量PCR仪</td></tr><tr><td>18S 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs99999901_s1</td><td>真核生物18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs00604506_m1</td><td>细胞色素&amp;nbsp; 家族3亚家族A成员4</td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;trade; 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23236</td><td>蛋白质定量试剂盒</td></tr><tr><td>MSD Tris 裂解缓冲液</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R60TX-3</td><td>蛋白裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Cleaved/Total Caspase-3 全细胞裂解液试剂盒</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15140D</td><td>Caspase 3 检测试剂盒</td></tr><tr><td>V-PLEX 血管损伤面板 2 人试剂盒</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX 人促炎因子Panel II（4重）</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>蔡司 LD Plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>20倍长距离物镜</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>明场显微镜</td></tr><tr><td>蔡司 LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>10倍物镜</td></tr></tbody></table>

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

肠道黏膜是一种复杂的物理和生化屏障，具有多种重要功能。它能够介导营养物质和外源性物质的转运、吸收与代谢，同时促进与微生物群的共生关系，并限制微生物的侵入。多种细胞类型与其物理和生化环境之间的功能相互作用，对于建立和维持肠道组织稳态至关重要。模拟这些复杂的相互作用以及整合的肠道生理功能 体外 是一个极具挑战性的目标，有望彻底改变新治疗靶点和药物候选物的发现与开发方式。
类器官与器官芯片技术近期已被结合，用于构建与人类相关的肠芯片，适用于在体外研究肠道生理学和病理生理学的功能特征。in vitro。来源于小肠（十二指肠）和大肠活检组织的类器官被接种至器官芯片的上层腔室，并成功扩展&#160;为单层细胞，同时保留各肠段特有的细胞、分子及功能特性。来源于人肠道组织特异性微血管内皮细胞被引入器官芯片的下层腔室，以重建上皮-内皮界面。这一新型平台可实现肠腔对营养物质、药物和微生物的暴露，从而支持对肠道转运、通透性以及宿主-微生物相互作用的研究。
本文提供了一种建立代表人十二指肠（十二指肠芯片）和结肠（结肠芯片）的肠芯片系统的详细方案，并在持续灌注和类似蠕动的机械形变条件下进行后续培养的方法。我们展示了利用典型诱导剂和底物在十二指肠芯片中评估药物代谢及CYP3A4诱导作用的实验方法。最后，提供了一套逐步操作流程&#160;对于 体外 在结肠芯片中模拟干扰素γ（IFNγ）介导的屏障功能障碍（肠漏综合征），包括评估细胞旁通透性改变、细胞因子分泌变化以及芯片内细胞转录组分析的方法。

图1D 总结了肠芯片培养的时间线，并展示了肠道内皮细胞和类器官在接种到芯片前后的情况。此外，该图还展示了十二指肠芯片与结肠芯片之间明显的形态学差异，其中十二指肠芯片中存在类似绒毛的结构，代表了小肠的组织架构特征。
图3A、B展示了来自三个不同类器官供体的十二指肠芯片中CYP3A4诱导反应的倍数变化。芯片分别暴露于20 µM RIF或100 nM VD3中48小时，用于评估CYP450酶的mRNA水平（A）和/或催化活性倍数（B）。在暴露于RIF和VD3的十二指肠芯片中，观察到睾酮代谢物6β-羟基睾酮（6β-OH-T）水平升高，与CYP3A4 mRNA基因表达上调一致，表明在所有三个供体中均出现了适当的诱导反应。数据表示n = 3个生物学独立芯片的均值±标准误（SEM）。
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将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。

肠道黏膜是一种复杂的物理和生化屏障，具有多种重要功能。它能够介导物质的转运、吸收……

本方案展示了如何利用活检来源的肠道类器官和器官芯片技术，构建具有生理相关性的肠道芯片，进而用于预测药物的药代动力学和药物相互作用，并研究肠道上皮屏障功能障碍。将类器官与器官芯片技术相结合，使我们能够重现肠道上皮的复杂性，同时还能更精确地控制机械信号、流体分布以及生化梯度等实验条件。该方法模拟了人类肠道复杂的生理环境，有助于更深入地理解正常和病理状态下肠道功能的细胞与分子基础，从而更好地预测药物的药代动力学、药效学特性以及潜在药物候选物对炎症损伤的预防作用。接种是该实验方案中的关键步骤。肠道类器官片段过度碎片化或接种密度不准确，可能会影响上皮屏障的发育与分化。首先，吸除静态培养类器官中的培养基。收集足够孔中的培养基，以达到每毫升八百万个细胞的最终接种密度。向每个孔中加入 500 微升预冷的 BMM 解离溶液，并将溶解的 BMM 从孔壁上脱离。将悬液收集至 15 毫升低蛋白结合离心管中，并置于冰上。每 15 分钟轻轻振荡试管一次，持续 1 小时。在4°C条件下，以300 × g离心5分钟，以获得类器官沉淀。若在沉淀物上方观察到透明凝胶层，则吸除管中的溶液。重悬沉淀物，并加入等体积的BMM解离溶液。冰上孵育10分钟，然后离心。重复操作直至无溶解的BMM残留物存在。弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL类器官消化液中。将离心管在37摄氏度下孵育1至3分钟，然后加入8毫升高级DMEM F12培养基以终止酶促反应。离心后，将沉淀重悬于完全类器官生长培养基中，调整细胞密度至每毫升800万个细胞。分装至无菌的1.5毫升低蛋白结合离心管中，每管360微升。接下来，移除包被芯片上层通道中的培养基，并加入 30 微升细胞悬液。将芯片置于 37 摄氏度培养过夜，使类器官片段贴附于膜上。向顶部入口储液池中加入 3 毫升预平衡的完全类器官生长培养基，向底部入口储液池中加入 3 毫升预平衡的内皮细胞生长培养基。向相应的顶部和底部出口储液槽中各加入 300 微升相同的培养基。将承载便携式模块的托盘转移至培养模块中。在培养模块上重复运行引液循环，直至形成足够数量的液滴，以成功连接芯片。然后将芯片载体滑入便携式模块中。接着启动持续两小时的调节循环，以对便携式模块及芯片内的培养基进行加压，之后将恢复程序设定的培养条件。接下来，调整拉伸参数并启动培养模块。24小时后，使用10%拉伸和相同频率重复该循环。配制给药培养基或溶剂对照时，将CYP诱导剂储备液或DMSO用完全类器官生长培养基和内皮细胞生长培养基稀释。暂停培养模块，并将培养托盘转移至生物安全柜中。将所有入口和出口储液槽中的培养基更换为含有诱导剂或对照溶剂的两毫升给药培养基。将便携式模块重新放回培养模块中，并以每小时30微升的流速恢复灌注。每隔24小时更换一次新配制的诱导溶液，继续培养48至72小时。然后将培养板移至生物安全柜中，吸除所有储液槽中的给药培养基。用温热的高级DMEM F12培养基洗涤并替换上端入口储液槽，下端储液槽则替换为内皮细胞生长培养基。将洗涤培养基替换为一毫升探针底物溶液。以每小时 1,000 微升的高流速灌注芯片 5 分钟，并吸除顶部和底部出口储液池中的液体。将芯片放回培养模块，在每小时 300 微升的恒定流速下孵育 1 小时。处理 1 小时后，停止流动，将托盘转移至生物安全柜中。从顶部出口储液池收集 100 微升流出液，并将其加入含有 200 微升终止液的离心管中。立即将离心管置于干冰上，并将样品在 -80 摄氏度条件下保存。用 200 微升无菌 DPBS 清洗两个通道。然后用200微升滤芯吸头封闭底部通道出口。通过底部通道灌注50微升解离液，并在室温下孵育2分钟。确保内皮细胞完全脱落，随后用移液器将解离液从通道中移除。重复洗涤一次。接着，封闭顶部通道出口，并灌注 75 µL 蛋白裂解缓冲液。保持移液器吸头插入状态，在室温下孵育 5 分钟。用移液器吹打5到10次，将细胞裂解物收集至1.5毫升离心管中。重复灌注和收集步骤，以确保细胞完全脱离，并将裂解物于-80°C保存至分析前。进行RNA裂解时，采用相同操作步骤，但使用150 µL RNA裂解缓冲液。首先，通过将原液稀释于脱气的内皮细胞生长培养基中，制备干扰素γ给药溶液。在生物安全柜中，从底部通道入口储液池中移除培养基，并每日更换为三毫升给药溶液。然后将培养板放入培养模块中，以每小时1,000微升的高流速对芯片灌注五分钟。将流速切换至60微升每小时，并继续进行流体培养。向96孔黑色壁板的每个孔中加入100微升DPBS。使用多通道移液器，将所有储液槽中的流出液各50微升分别加入对应的孔中。为制备标准曲线，使用含100微克/毫升三氨基三氯荧光素标记的3千道尔顿葡聚糖的DPBS缓冲液进行三倍稀释。随后使用内皮细胞生长培养基在DPBS中进行三倍系列稀释。十二指肠和结肠芯片的不同形态特征通过十二指肠芯片中类似绒毛结构的存在得以凸显，这些结构代表了小肠的组织架构。在暴露于细胞色素P450诱导剂利福平和维生素D3的十二指肠芯片中，药物代谢酶细胞色素P450 3A4的mRNA基因表达升高，且细胞色素P450酶的催化活性增强，表明在全部三个类器官供体中均出现了适当的诱导反应。当用干扰素γ处理结肠芯片的上皮单层时，观察到细胞形态受损以及柱状上皮的丧失。此外，与对照溶剂相比，干扰素γ处理导致紧密连接和黏附连接蛋白的胞质信号增强，表现为紧密连接标志物ZO-1和claudin 4的错位以及occludin和E-cadherin的内化。在结肠芯片上，经干扰素γ刺激48小时后，观察到上皮细胞旁通透性显著增加。同样，干扰素γ可诱导细胞凋亡活化，表现为裂解型Caspase 3细胞内含量升高。干扰素γ在结肠芯片中诱导促炎分子的极性分泌，表现为VCAM-1和白细胞介素-6向基底外侧分泌，ICAM-1和血清淀粉样蛋白A向顶端分泌。为成功培养肠道芯片，应使用未分化的类器官，并遵循碎片化及接种密度的操作说明。在成功构建肠芯片后，我们可以研究肠道吸收、转运和代谢、营养水平、肠道激素分泌、宿主与微生物病原体的相互作用、药物安全性与有效性、患者特异性疾病机制以及对治疗的反应。

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

结合人体类器官和芯片器官技术，对肠道区域特异性功能进行建模

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。...

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

一种用于研究肠道微生物组-神经系统轴的肠芯片模型

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。...

结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One...

利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

我们的详细方案概述了先进的肠芯片模型的构建与使用方法，该模型可模拟具有三维结构和多种细胞类型的肠黏膜，从而能够深入分析微生物定植引发的免疫反应和细胞功能。...

用于分析肠道黏膜免疫反应的免疫健全肠芯片模型

该方案结合了人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析，为此前尚未深入探索的肠道生物学提供了重要见解。...

利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

为了更好地模拟人体肠道的结构和功能，必须对人肠道类器官进行神经支配。本文介绍了一种将肠神经系统整合到这些类器官结构中的方法。...

人肠道类器官的神经支配

了解如何将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术相结合，构建模拟人体肠道生理功能的微生理平台。该方法可用于预测药代动力学、药物相互作用及研究肠道屏障功能障碍。

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

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