Name: 啮齿动物组织的霰弹枪脂质组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 了解啮齿动物组织的霰弹枪脂质组学方法，通过质谱技术定量分析400多种分子脂质和14个脂质类别。该方案可快速识别早期毒性生物标志物，为脂质机制研究提供高效工具。

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作者谨向研究团队致以感谢，尤其感谢PMI R的生物研究团队和气溶胶团队提供的技术协助与支持&amp;#38;D，菲利普莫里斯国际研究实验室有限公司，新加坡，和PMI R&amp;#38;D，菲利普莫里斯产品股份有限公司，瑞士纳沙泰尔。作者感谢 Sam Ansari 对生物样本库管理所做的工作，并感谢 Sindhoora Bhargavi Gopala 提供的支持&#160;Reddy 对稿件初稿进行了编辑。

所有涉及动物的实验程序均在获得国际实验动物评估和认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International）认证并由农粮署 &amp;#38; 新加坡兽医局，在机构动物护理与使用委员会批准下，并遵循国家实验动物研究咨询委员会《科研用途动物护理与使用指南》（NACLAR，2004）的规定。
1. 样本采集
<ol>
	<li>在载脂蛋白E基因敲除（ApoE−/−）小鼠暴露16–24&#8239;小时后，分别于暴露3个月和6个月时进行小鼠肺组织解剖。解剖后立即用液氮速冻组织样本，并于−80 °C保存，待后续开展脂质组学分析。每个&#34;组学&#34;解剖组需确保收集共计九个样本。</li>
</ol>
2. 组织样本的粉碎
<ol>
	<li>准备用于组织研磨的磁力破碎仪及耗材。将组织袋、镊子、带盖的组织转移管、&#34;V&#34;型塑料刮刀和2 mL塑料收集管预先在干冰上预冷。在磁力破碎仪上安装相应的管架。打开磁力破碎仪，将冲击功率设置为高。</li>
	<li>将样品装入组织袋中；如有需要，使用预冷的镊子从组织袋顶部开口处插入样品。将样品置于柔性袋的中央位置，远离边缘。</li>
	<li>通过将预冷的收集管拧到组织袋顶部来密封组织袋。</li>
	<li>将柔性袋浸入液氮中10秒，对样品进行速冻。</li>
	<li>释放收集管内的压力；将管盖松开约1/4圈以排气，防止磁力破碎仪冲击时袋体破裂。</li>
	<li>将冷冻的组织袋装入磁力破碎仪中。</li>
	<li>按下激活按钮启动磁力破碎仪，使样品粉碎。若袋中仍有未完全粉碎的组织块，需再次用液氮速冻样品，并进行第二次冲击。</li>
	<li>从磁力破碎仪上取下组织袋，确保粉碎后的样品留在底部。为防止样品融化，应立即再次进行速冻处理。</li>
	<li>将样品转移至收集管中。迅速将管子倒置，使组织袋位于上方，轻敲袋子以使组织颗粒落入收集管底部。 
	注意：此步骤应迅速完成，以避免组织融化。</li>
	<li>取10 mg组织样品分装至2 mL管中，用于后续脂质组学分析，并将样品在−80 °C保存，直至进行下一步操作。</li>
</ol>
3. 组织匀浆
<ol>
	<li>开启组织研磨仪，将振荡频率设置为30 Hz，振荡时间设置为2 min。配制组织匀浆缓冲液：将碳酸氢铵溶于水，配成150 mM的溶液，pH约为8.2。</li>
	<li>从储存冰箱中取出样品，置于冰上，向含有组织粉末的离心管中加入四颗不锈钢研磨珠。每份样品中加入0.5 mL的150 mM碳酸氢铵缓冲液。</li>
	<li>将样品管放入组织研磨仪的夹具中。确保两个夹具中的管子数量相同以保持平衡。将夹具固定到组织研磨仪的支撑臂上，进行组织破碎。</li>
	<li>将离心管放回冰上，肉眼观察管内是否仍有未破碎的组织团块。若组织破碎不完全（可见团块），则重复破碎步骤，再进行一个处理循环。处理后将样品置于冰上。</li>
	<li>取100 µL样品，转移至一个专用于蛋白定量的1.5 mL离心管中，标记为样品分装1。在10 °C条件下，以18,200 × g离心5 min。</li>
	<li>采用Bradford法测定样品分装1中的蛋白含量（见第4节）。测定期间将样品置于冰上保存。</li>
	<li>在新的2 mL离心管中，取20–100 µL原始匀浆液作为样品分装2，用于脂质提取（见第5节）。若样品不能立即分析，需保持在冰上直至开始提取。 
	注意：最终提取体积应根据总蛋白量确定，每份总分装液中的蛋白含量应在0.015–0.045 mg范围内。</li>
</ol>
4. 考马斯亮蓝蛋白定量测定实验
注意：分析开始前应对研究样本进行随机化处理，并在所有样本处理步骤中严格遵守随机化原则。
<ol>
	<li>用碳酸氢铵缓冲液将离心后的等分试样1上清液稀释2倍。 
	注意：稀释倍数取决于组织匀浆液的浓度。对于浓度较高的溶液，应使用更大的稀释倍数，以确保测定浓度落在检测方法的动态范围内。</li>
	<li>根据表1配制牛血清白蛋白（BSA）标准曲线。涡旋混匀各标准品管。在室温下以18,200 × g 离心15秒。</li>
	<li>从先前配制的标准品管中，按照图1所示的板式布局，分别取6 µL空白样和各标准品加入96孔平底板中。</li>
	<li>根据图1所述的板式布局，将先前制备的样品加入96孔平底板中。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入250 µL Bradford试剂，并混匀。孵育5分钟。</li>
	<li>使用酶标仪在595 nm波长下测定吸光度。</li>
	<li>根据标准曲线计算各等分试样中的蛋白质浓度。 
	注意：计算蛋白质浓度时，应考虑实验开始时所用的稀释倍数。</li>
</ol>
5. BUME 提取
注意：进行脂质组学提取时，应避免使用低结合塑料管，因为强有机溶剂会释放增塑剂，导致样品分析过程中产生较强的背景干扰。
<ol>
	<li>准备1.5 mL离心管，每管加入100 µL碳酸氢铵溶液，用于总空白（TB）、内标空白（ISB）和质控样品（QC），每10个样品之间插入1个QC样品。所有样品均需置于冰上保存。</li>
	<li>向所有QC样品中加入10 µL混合人血浆。向所有ISB、QC和研究样品（即除TB外的所有样品）中加入10 µL内标溶液。 
	注意：对于质控材料，可使用任何市售的K2EDTA混合血浆。收到后，使用上述方案测定混合血浆中的脂质浓度，并将这些浓度范围作为后续所有使用该质控材料的分析的参考值。仅在需要评估检测准确性的靶向应用或整体方法验证中使用NIST血浆。</li>
	<li>向每个样品中加入300 µL −20 °C的正丁醇/甲醇混合液（3:1, v/v）。在恒温混匀仪上，室温下以450 × g振荡10分钟。</li>
	<li>加入300 µL正庚烷/乙酸乙酯混合液（3:1, v/v）。在恒温混匀仪上，室温下以450 × g振荡10分钟。</li>
	<li>加入300 µL 1%乙酸混合液。在恒温混匀仪上，室温下以450 × g振荡5分钟。在室温下以2,800 × g离心5分钟。将360 µL上层相转移至新的2 mL自锁管2中。 
	注意：液-液萃取可能导致相界面位置因样品而异，从而导致上层相体积略有差异。必要时可调整上层相的收集体积。</li>
	<li>向水相管1中加入320 µL正庚烷/乙酸乙酯混合液（3:1, v/v）。在恒温混匀仪上，室温下以450 × g振荡5分钟。在室温下以2,800 × g离心5分钟。转移320 µL上层相，并与步骤5.11所得组分合并。 
	注意：必要时可调整上层相的收集体积。</li>
	<li>向管1中的水相中加入250 µL正庚烷/乙酸乙酯混合液（3:1, v/v）。在恒温混匀仪上，室温下以450 × g振荡5分钟。在室温下以2,800 × g离心5分钟。转移200 µL上层相，并与步骤5.11和步骤5.15所得组分在管2中合并。 
	注意：必要时可调整上层相的收集体积。</li>
	<li>在真空浓缩仪中35 °C下蒸发至干燥。 
	注意：如需保存，干燥后的样品可于−20 °C储存，直至分析。</li>
	<li>用300 µL质谱混合液（含7.5 mM乙酸铵的异丙醇/甲醇/氯仿溶液，4:2:1）重新溶解。每管涡旋振荡5秒，确保完全溶解。在4 °C下以18,200 × g离心5分钟。</li>
	<li>根据图2所示的板布局，将50 µL等分试样转移至微孔板中，用于正离子化模式分析（第1-6列），并用50 µL质谱混合液稀释。</li>
	<li>根据图2所示的板布局，将20 µL等分试样转移至MTP板中，用于负离子化模式分析（第7-12列），并用80 µL质谱混合液稀释。用铝箔包裹微孔板，并在分析前置于4 °C保存。</li>
</ol>
6. 质谱分析
<ol>
	<li>按照制造商说明，在分析前5天或更短时间内，对质谱仪（MS）进行正负离子模式下的校准。</li>
	<li>将直接进样纳米源安装到位，确保其与质谱仪的传输毛细管正确对齐。将一根4.1 µm喷嘴芯片插入芯片支架中，并在软件中进行相应配置。</li>
	<li>使用以下参数 阳性 和 负离子模式 方法设置： 气体压力 的 1.25 psi; 源电压 的 1.1 kV; 5 µL 的 样品进样体积; 输出触点闭合 Rel1 用于 2.5 s; 5 分钟 的 递送时间; 平板冷却 在 4 °C.</li>
	<li>在正离子模式下设置直接进样机器人的分析序列队列。</li>
	<li>建立质谱方法 正离子模式 使用以下质谱参数：
	<ol>
		<li>设置 毛细管温度 在 250 °C 和 S-透镜射频电平 在 65.0执行 全扫描 质谱采集自 0 到 1 分钟 在 550-1000 m/z 范围 在 140,000 分辨率 与 自动增益控制 的 1 ×106 和 最大注入时间 的 50 ms应用 锁质量 的 680.48022.</li>
		<li>设置 非依赖性数据 MS/MS 采集方法之间的 1 和 5 分钟时间 范围在 17,500 分辨率 与一个 固定第一质量 的 250 m/z. 使用一个 自动增益控制 用于MS2的 1 × 105 和 最大注入时间 的 64 ms，一个 碰撞能量 的 20 NCE，以及一个 分离窗口 的 1 m/z使用包含质量列表 550 到 1,000 m/z，其中包含一个 质量步骤 的 1 天.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于采集 负离子模式，设置 毛细管温度 在 250 °C 以及 S-Lens RF 水平 在 65.0 在质谱调谐文件中。
	<ol>
		<li>使用以下质谱方法参数：全扫描模式，扫描范围从 0 到 1 分钟 在 140,000 分辨率覆盖的范围 400-940 m/z 范围， 自动增益控制 的 1 × 106; 最大注入时间 的 50 ms；使用一个 锁质量 的 529.46262.</li>
		<li>设置 MS2 获取在 DIA 模式 之间 1 和 5 分钟 运行结束时的 分辨率 的 17,500 与一个 固定第一质量 的 150 m/z; 自动增益控制 的 1 × 105; 64 毫秒 的 最大注入时间；以及 35NCE 的 碰撞能量. 使用来自包含质量列表的 400 到 940 与一个 质量步骤 的 1 天.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在质谱软件中创建分析序列队列 阳性 模式。等待每个样品由直接进样机器人发出的触点闭合信号触发样品采集。</li>
	<li>当正离子模式分析完成后，为直接进样机器人创建序列队列 阴性 模式。</li>
	<li>在质谱软件中设置分析序列队列 阴性 模式。</li>
</ol>
7. 数据处理
<ol>
	<li>使用转换软件将正负模式下的数据文件从 .raw 格式转换为 .mzML 格式。 
	注意：正离子模式和负离子模式的数据文件必须分别进行转换（由于它们的采集参数和噪声阈值不同）。
	<ol>
		<li>填写以下设置以执行文件转换： 噪声阈值因子 是 3 和 5 用于 质谱 和 MS2分别； 激活 的 去噪功能 对于 MS 和 MS2 均 数据压缩, 平均 MS2 扫描，以及 峰提取设置 TIC 阈值 用于 阳性 和 负模式 （例如， 10,000 和 5,000；应根据特定仪器产生的特定样本的噪声水平来确定。处理结束时生成 XLC 和 PDF 报告。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行脂质鉴定。定义以下（示例） 文件导入设置 参数： 选择窗口 ±0.5 Da （取决于质谱方法中的选择窗口）； 时间范围 2-300 秒 （取决于质谱方法中的扫描时间）； 无校准质量物 用于 MS 和 MS2；转移并计数至整数 质量范围 来自 Peak by Peak 软件的元数据文件（min mass [MS]）和（min mass [MS2]）； 耐受性 的 3 ppm 和 10 ppm 用于 质谱 和 MS2，分别；保持空白 质谱 和 MS2 阈值 领域 频率滤波器, MS1 偏移量 和 PMO; 同位素校正 用于选择 MS 和 MS2； 转移分辨率梯度 来自转换器元数据文件中的（Resolution linear fit [MS]）和（Resolution linear fit [MS2]）。 
	注意：由于正负离子模式的采集参数不同，必须分别进行脂质鉴定。</li>
	<li>数据导入后，转到 运行 菜单中上传用于脂质鉴定的MFQL文件。 
	注意：有关 MFQLs 结构的详细信息，请参阅 Herzog 等人的出版物。25. 参见 https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library 上的 MFQL 文件示例，并参阅相关讨论。数据处理所用的全部 MFQL 文件均提供于下文&#160;补充材料.</li>
	<li>通过将脂质特征的前体离子质量强度除以相应标记内标的强度，再将所得商值乘以标记内标的浓度，从而在质谱水平上对鉴定出的物种进行定量。使用Bradford法测定的总蛋白量对最终的脂质浓度进行归一化。</li>
</ol>
8. 质量控制检查流程
注意：质量检查程序是验证方法技术可重复性的关键步骤。为此，使用商业混合血浆进行分析，以测定不同脂质在5天内的内源性水平，每天制备15个相同的等分试样，共五个批次（总计五个批次）。需要注意的是，本案例中使用R统计软件环境开发了一个Shiny网络应用程序，用于创建数据评估流程。
<ol>
	<li>将参考接受范围定义为所有五个批次计算出的平均值 ±3 倍标准差。</li>
	<li>对每个分析批次应用&#34;通过&#34;接受标准：90% 的参考目标必须通过，其中每个参考化合物代表一个脂质类别。例如，如果在质量控制验证中包含15个参考目标，则必须确保有13个目标通过，该批次方可被接受。 
	注意：换句话说，每个参考化合物的质控样本中必须有68%通过，该脂质类别的数据方可被接受。</li>
	<li>如果研究批次未达到质控检查的接受标准，则需重复该操作流程。</li>
</ol>
9. 共轭脂肪酸（相对）含量的估算
<ol>
	<li>针对每种脂质类别，根据其二级质谱（MS2）强度估算共轭脂肪酸的含量。 
	注意：由于碎片化和电离效率的差异，所得数值仅用于样本组间的相对丰度比较，而不能用于例如估算特定脂肪酸对某脂质类别中总共轭脂肪酸池的相对贡献。</li>
	<li>将脂肪酸碎片的MS2强度相对于相应内标物脂肪酸碎片的平均强度进行归一化。根据内标物的浓度和测定的组织重量，计算共轭脂肪酸的&#34;归一化浓度&#34;。将每类脂质中这些值加总，以估算每个样本中每种共轭脂肪酸的总量。</li>
</ol>
10. 统计学分析
<ol>
	<li>进行统计分析。对每种条件及其相应的对照组拟合线性模型，并基于对 log2 转化数据的 t 统计量计算 p 值。采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率方法对多重检验效应进行校正。 
	注意：经校正后 p 值 &#60; 0.05 的脂质被视为丰度差异显著。此处的统计分析在 R 统计环境26中完成。</li>
</ol>

所有作者均为菲利普莫里斯国际公司的员工。菲利普莫里斯国际公司是本项目的唯一资助方和赞助方。

尽管质谱技术的进步已产生多种方法，可准确监测多种脂质种类，但以往对各种哺乳动物组织的脂质谱分析结果并不一致，因此脂质在特定组织中的具体功能仍不明确。与蛋白质功能分析相比，后者已有更可靠的方法来敲除特定化合物的表达，而大多数脂质无法在组织中被选择性关闭或过表达，这使得脂质功能评估变得困难。对组织脂质组浓度进行深入谱型分析，可能为揭示循环脂质与人类疾病之间的关联提供一种替代途径。
在评估能够对任何小鼠组织内源性脂质谱进行定性和定量全面覆盖的脂质组学方法时，我们优先选择了鸟枪法脂质组学方法。通常，存在两种截然不同的样品分析方式：一种是基于液相色谱（LC）分离并结合质谱检测的完全非靶向脂质筛查，以揭示样品的总脂质复杂性；另一种为靶向分析方法，主要用于对特定目标脂质进行非常精确的定量。相比之下，本文所展示的鸟枪法脂质组学流程的显著优势在于，能够快速、全面地覆盖来自预定义脂质类别的数百种内源性脂质，同时仍可实现可靠的半定量分析。
不同脂质类别的电离效率具有结构依赖性，并且会因不同的实验电离条件而发生显著变化。与基于液相色谱（LC）的分离方法相比，鸟枪法分析通过在相同电离条件下直接同时注入全部脂质提取物进入质谱仪，从而最大限度地减少了这些差异。使用同位素标记的脂质类似物或结构相似的非内源性标准品，可实现对所有脂质类别的半定量分析。鸟枪法脂质组学在质谱分析过程中具有较低的批间和批内变异性；因此，该方法产生的变异系数21低于基于非靶向液相色谱的方法，后者需要多种标准品才能实现充分的定量。重要的是，尽管当前方法未使用外部校准曲线，但仍被视为完全定量的方法32。
每个脂质类别使用一种标记的内标物（或非内源性表达的未标记标准品）足以对大多数脂质进行定量。目前仅有少数文献报道了对 shotgun 脂质组学方法的部分方法学验证。例如，在 Gryzbek 等人17 和 Surma 等人21 的研究中，使用内标物和固定量的样本基质制备了反向校准曲线。通过脂质含量及其信号强度的对数转换值进行线性回归分析评估线性关系，并分别以R2 和斜率表示。检测限（LOD）和定量限（LOQ）则基于信噪比为 3（LOD）和 10（LOQ）的加权线性回归确定。对于大多数脂质类别，脂肪组织中的 LOQ 定义为 2–9.8 pmol，血浆中为 0.05–5 µM。在这两项研究中，每个类别均使用一种非内源性的单一内标物来估算该类别中所有脂质的含量。然而，本研究未提供 LOD/LOQ 数据，原因如下：内源性基质并非无化合物背景，且组织的替代基质不可获得，因此无法准确添加已知的小量标准品。我们未采用经典的靶向定量方法，即使用特定化合物及其同位素标记的标准品进行归一化的系列校准曲线，这是因为纯标准品不存在，且同位素标记的脂质极为有限。Orbitrap 检测器通过应用傅里叶变换自动完成瞬态信号的转换，部分信号已被替代；因此，低浓度范围仅在线性下降至某一最小信号值之前保持线性，低于该信号值后分子将无法被检测。Xcalibur 软件中的信噪比值依赖于分子的 m/z 比值；因此，每个脂质类别中包含不同脂肪酸组合的化合物将具有不同的噪声水平。此外，LOD/LOQ 值严格依赖于基质类型，当在不同啮齿类动物组织中进行脂质组定量时，应针对每种组织类型单独评估其 LOQ。
事实上，该方法提供了高达四个数量级的高线性动态定量范围33&#160;，并具有非常好的灵敏度，可覆盖最重要的内源性结构脂质，且通过质谱采集技术的改进还可进一步提高灵敏度32。脂质平均浓度的变异系数大多低于15%，表明鸟枪法脂质组学符合美国食品药品监督管理局（FDA）的要求，可作为符合良好实验室规范（GLP）和良好临床规范（GCLP）研究的方法34。
然而需要注意的是，由于不同脂质类别具有不同的极性，某些脂质类别受特定共轭脂肪酸（FAs）贡献的影响更为显著。这会导致在含有多种共轭脂肪酸的等摩尔混合物中，信号强度响应出现失真，从而引起定量偏差，Koivusalo 等人35在对磷脂类别的研究中已强调了这一点。值得注意的是，这些作者提供的数据涵盖了链长从24到48的广泛脂肪酸，这种情况很可能无法反映真实生物样品中的实际情况。多不饱和物种的响应比完全饱和物种高出40%，但这种效应仅在较高浓度下被观察到。当混合物逐步稀释时，不饱和度的影响逐渐减弱，并在每种成分浓度为0.1 pmol/µL时几乎完全消失。此外，所有测量均在离子阱和三重四极杆质谱仪上进行，而非在Q-Exactive设备上完成。
本方案的另一个优势是其技术灵活性，可根据特定项目需求进行调整。例如，在质谱分析前制备总脂质提取物时，可采用任意脂质提取方法，如改良的 Bligh 和 Dyer36 法、甲基叔丁基醚37 法或丁醇-甲醇38 法。氯仿-甲醇提取法的主要局限在于脂质组分位于下层相，这给常规操作尤其是自动化带来困难；此外，还需考虑氯仿的毒性。叔丁基醚提取法已广泛用于血浆样本的脂质分析37，并已有自动化版本被提出21。在本研究中，我们选择了 BUME 法，因为它对添加的 PG、PI、PA 和 PS 脂质类别具有更高的回收率38，溶剂消耗更低，并具备自动化潜力39，同时三种方法提取的组织样本中总体定量浓度相当。此外，尽管本研究中的样本提取为手动操作，但也可通过 96 孔板格式的自动化样本前处理和脂质提取，对大量样本获得可重复且精确的结果40,41。这使得脂质组学分析能够应用于大规模的临床和毒理学研究。
在本研究中，我们按照 Schuhmann 等人42所述方法，分别在不进行极性切换的情况下进行正离子和负离子模式的质谱采集。对于浓度略低的溶液，纳升级进样器（nanomate）信号在负离子模式下的稳定性优于正离子模式。此外，我们开发了一套完全可追溯的流程，使用从 .raw 文件转换为 mzML 格式的转换软件，可直接提供 LipidXplorer 软件所需设定的参数值，从而无需手动计算分辨率斜率。我们还针对不同噪声设置进行了调整，因为在正离子模式下，谱图的噪声水平高于负离子模式。所有步骤均经过优化，适用于可追溯的高通量常规分析。
在鉴定过程中，鸟枪法脂质组学分析可利用不同脂质类别在不同极性模式下形成的独特加合物行为。在该方法中，具有相同分子质量的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）在正离子化模式下信号重叠，但在负离子化模式下可被完全分离，因为PC会形成乙酸根或甲酸根加合物，而PE则以去质子化形式离子化。此外，该方法不仅利用分子式，还可结合整体脂肪酸结构，实现对脂质（部分）结构的解析。例如，基于总碳数和总不饱和度数的脂肪酸（FA）鉴定适用于所有磷脂、二酰基甘油（DAG）、三酰基甘油（TAG）以及溶血磷脂。对于部分磷脂类别，每种异构体形式的自下而上定量可部分实现43，但由于不同脂肪酸在MS2谱图中的信号响应不均，DAG和TAG的定量则复杂得多。
还必须强调实施适当的质量控制程序的重要性，这些程序应与该领域最近的倡议完全一致44。为了确保实验室内部及实验室之间的数据可追溯性和可重复性，已采取多项措施，包括在分析的各个步骤中对样本进行适当的随机化处理、使用供应商认证的标准混合物、纳入质量控制样本、建立批号接受或拒收的验证程序，以及构建内部数据库以长期跟踪质量控制表现。与这些倡议一致的还包括需要建立标准化方法来评估样本稳定性。通常情况下，大多数结构脂质不受脂质氧化的影响，而脂质氧化对氧脂素、氧化脂质和多不饱和脂肪酸更为显著，因此这些成分对储存和操作条件更为敏感。然而，对样本稳定性进行准确评估仍是一项技术上具有挑战性的任务。
然而，该方案在确定化合物的亚分子水平方面存在局限性。由于总提取物未经过分离，因此在质谱分析中，具有相同分子质量但脂肪酸组成不同的脂质同分异构体会被合并检测。对于大多数脂质类别，可通过MS2中残余脂肪酸碎片的裂解比例实现对结构的部分解析。但由于不同同分异构体之间的裂解行为差异较大，且缺乏足够种类的纯化学标准品来确定校正参数，因此对每种同分异构体进行独立定量仍是一项极具挑战性的任务。另一个局限性在于，电喷雾电离（ESI）过程不可避免地会产生干扰物，导致某些脂质（如二酰基甘油（DAGs）、磷脂酸（Pas）和游离脂肪酸（FAs））出现人为的峰信号，从而可能引起定量结果的错误。
接下来，我们根据经验总结了该实验方案中最关键的部分。第一点涉及每种小鼠组织类型在脂质含量和类别比例方面均具有独特的脂质谱。因此，在提取前必须根据组织的总蛋白含量仔细确定起始组织用量，以避免因高浓度脂质聚集而导致质谱信号饱和或超出动态定量范围。33 或者——在另一个极端情况下——提供足够的质谱信号，以覆盖每个脂质类别中的主要脂质化合物。
第二个关键方面是确保直接进样纳米源芯片出口与质谱仪传输毛细管的位置正确对齐。考虑到质谱仪在两种模式下的完整校准每周进行一次，校准源与纳米源芯片装置之间的切换可能导致安装过程中因对位不准而引起信号强度的显著波动。
该实验方案的另一个关键环节是对内标混合物的谨慎操作。由于该混合物含有大量二氯甲烷，一旦开启后应尽快使用完毕，以避免长期储存和多次使用导致溶剂挥发，从而引起人为的浓度变化。此外，在将标准混合物从−20 °C储存条件下取出后，保持一致的操作方式也至关重要，因为温度差异可能导致使用空气垫移液器移液时出现体积不一致的情况。一种替代方案是将标准品重悬缓冲液中的二氯甲烷替换为纯甲醇，这可能会提高操作便利性，但可能对某些脂质类别的溶解度产生不利影响，从而降低这些脂质类别的定量准确性。
最后的关键步骤是数据处理。数据处理流程包括使用“逐峰”（Peak by Peak）软件将原始数据从 .raw 格式转换为 .mzML 格式，进行 MS2 扫描平均化处理，以及对 MS1 和 MS2 数据进行噪声过滤、峰提取和数据压缩。作为替代方案，也可使用 ProteoWizard 软件进行数据转换，但此时需要在 LipidXplorer 中手动设置多个参数。 shotgun 脂质组学的所有复杂性尤其集中在直接进样获得的 MS1 和 MS2 谱图解卷积步骤上。开源的 LipidXplorer 软件依据质量精度、质量分辨率以及随着 m/z 增加其变化的斜率，从 mzML 文件格式导入已转换的谱图数据。该软件将一次分析运行中获取的多个独立 MS 和 MS/MS 谱图进行合并。随后，它对不同样品运行中的各个峰进行对齐，并在每个对齐后的峰簇中，用其强度加权平均质量替代各个峰的质量，而各数据文件中这些峰的丰度保持不变。对齐峰簇的代表性质量及各峰的强度值被存储于一个主扫描数据库中。该主扫描数据库包含批次中所有样品生成的全部 MS1 和 MS2 谱图，可通过分子碎片查询语言（MFQL）编写的查询语句对数据库进行解卷积，从而实现脂质鉴定。
总体而言，该方法基于正离子模式检测二酰基甘油（DAG）、三酰基甘油（TAG）和固醇酯（SE）类脂质，基于负离子模式检测磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）、鞘磷脂（SM）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）类脂质。在脂质鉴定过程中，对MS1和MS2进行同位素校正，并在输出的.xlsx文件中报告经校正后的强度值。此外，也可使用其他多种软件处理鸟枪法数据，例如ALEX45和LipidHunter46。
脂肪酸是细胞核和细胞膜的主要组成成分，以磷脂形式储存，可进一步转化为生物活性分子。它们可通过溶血磷脂酰基转移酶（lysophospholipid acyltransferase）经由Lands通路转化为溶血磷脂47。例如，LPCAT3酶被证实对将花生四烯酸（AA）整合入溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰丝氨酸中间体具有高度特异性。在炎症细胞（如肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞）中，这些酶的表达水平相对较高47，导致这些细胞释放出更高比例的含AA磷脂。然而，在被磷脂酶A2从膜磷脂中释放后，多不饱和脂肪酸（PUFAs）转化为多种脂质介质的过程由多种酶催化48。此外，这些多不饱和脂肪酸还可作为底物，在环氧化酶（COX）-1和COX-2酶的作用下生成促炎性和抗炎性前列腺素via47。磷脂是脂质介质的来源之一，这些介质在需要发挥其生物学效应的特定部位被释放。
肺是一个复杂的器官，包含多种细胞类型，每种细胞在促进正常肺发育和功能中发挥着重叠且特异的作用。目前仅有少数研究对小鼠或人肺中的不同细胞类型（例如肺泡Ⅱ型细胞）进行了分离和特征分析49,50；其他主要的肺细胞类型尚未被充分表征。另一项有趣的研究51对小鼠肺中的内皮细胞、上皮细胞、间充质细胞以及混合免疫细胞进行了分离，并开展了脂质分析。研究发现，免疫细胞中磷脂酰胆碱过氧化物（PCO）和磷脂酰甘油（PG）所含多不饱和脂肪酸（PUFAs）的浓度显著富集。考虑到香烟烟雾（CS）可诱导肺内免疫细胞数量增加（4-5倍），这一现象已通过支气管肺泡灌洗（BAL）得到证实52，因此本研究中观察到的总脂质变化可能归因于小鼠肺组织中免疫细胞募集的累积性增加。
综上所述，磷脂中掺入的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸（PUFAs）的结构改变可能反映了细胞内某些脂肪酸的过量积累，和/或构成在氧化应激和炎症条件下过量产生的氧化脂质前体的细胞内资源。然而，要阐明这一点，还需获得游离的EPA、DHA及其他氧化脂质的额外数据，而这些内容超出了当前方法应用的范围。

香烟烟雾（CS）被认为是与肺部慢性炎症性疾病（包括肺部癌变、支气管炎和慢性阻塞性肺疾病（COPD））发生相关的主要危险因素1。除了对肺部的影响外，接触香烟烟雾还在动脉粥样硬化性冠状动脉疾病和外周血管疾病等其他疾病的发展中起着重要作用1。心血管疾病和COPD分别为全球第一和第三大死亡原因。毒理学风险评估方法历来依赖于使用啮齿类动物等动物模型。体内实验中常用的仅有鼻部暴露或全身暴露的大鼠和小鼠模型，常用于研究长期接触香烟烟雾的影响。
例如，通常情况下，6个月的烟雾暴露会在小鼠肺部诱导出组织学和功能上的异常，这些异常与人类疾病相似，包括肺气肿、气道重塑和肺动脉高压，尽管与长期吸烟人群相比，这些变化相对较轻2。在动物和人类组织中，研究已观察到暴露于香烟烟雾（CS）后发生的一系列分子变化，包括氧化应激反应、炎症以及组织结构改变3,4。不出所料，已有报道指出，香烟烟雾暴露还会对肺脂质组产生广泛影响，包括对表面活性物质脂质、脂质信号介质以及结构脂质的影响4,5,6。
为了表征长期香烟烟雾（CS）暴露对小鼠肺组织中整体脂质变化的影响，我们采用了一种快速且定量的霰弹枪式直接进样质谱分析方法。自2005年霰弹枪脂质组学方法被提出以来7，该方法已有效应用于扩展我们对脂质细胞代谢的认识8,9,10，研究体系包括酵母11、Caenorhabditis elegans12 和 Drosophila melanogaster13 等模式生物，以及多种哺乳动物样本类型，如细胞系14,15,16、各类人类17,18 和啮齿类动物组织19,20 以及体液21,22。
近几十年来，研究揭示了细胞对环境变化响应的复杂性，这一过程涉及数千种相互关联的蛋白质、脂质和代谢物。这表明，采用先进的分析技术对于深入理解分子机制以及揭示外源性生理影响的全部程度至关重要。在此背景下，鸟枪法脂质组学方法所产生的全面且定量的脂质指纹图谱，能够有效增进我们对细胞脂质代谢的认识8,9,10。
鉴于香烟烟雾暴露是多种疾病的危险因素，毒理学风险评估方法历来依赖于啮齿类等动物模型。霰弹枪脂质组学质谱法（shotgun lipidomics MS）为评估多种样本类型中的脂质组扰动提供了一种快速、灵敏且定量的分析工具。该方法的独特之处在于，通过使用可产生电喷雾电离（ESI）纳米喷雾的导电纳米芯片，将添加了标记内标物的总脂质提取物直接自动进样至高分辨质谱仪中进行分析，而无需经过色谱分离步骤23。
在 MS1 模式下同时获得的质荷比信息可提供所有完整内源性脂质的总脂质图谱。可选地，通过 MS2/MS3 模式对母体脂质分子进行碎裂和分析，可获得额外的结构信息。数据分析需要专用软件，包括对混合谱图进行谱图去卷积和峰归属，从而实现脂质鉴定及推定化学结构的解析。此外，通过加入标记的内标混合物（每种目标脂质类别至少包含一种脂质标准品），可实现绝对定量。总体而言，利用该技术，每份样品仅需数分钟的质谱分析即可实现对啮齿类动物组织中 14 个脂质类别多达 800 种脂质的鉴定与定量24。

<table><tbody><tr><td>1、5 和 2 mL 自锁管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086, 30120094</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 不锈钢珠</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>4.1 &amp;micro;m 喷嘴芯片</td><td>Advion</td><td>HD-D-384</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45754-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Honeywell</td><td>14267-25G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白标准品，2 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>&amp;nbsp;23209</td><td></td></tr><tr><td>丁醇</td><td>Honeywell</td><td>33065-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650498-1L</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Honeywell</td><td>34856-1L</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Honeywell</td><td>33211</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 孔板</td><td>Sigma</td><td>M9686</td><td></td></tr><tr><td>庚烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34873-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>小鼠混合血浆</td><td>BioIvt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 SPLASH 标准品</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>330710X</td><td>内标</td></tr><tr><td>Nunc 96 孔平底透明板</td><td>VWR</td><td>62409-068</td><td></td></tr><tr><td>塑料刮勺</td><td>Sigma</td><td>Z560049-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x 染料试剂</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>血清稀释液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5197</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器/软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPrep CP02 冲击式破碎仪</td><td>Covaris</td><td>&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>磁力破碎锤</td></tr><tr><td>Centrifuge 5427R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>离心机</td></tr><tr><td>ChipSoft 8.3</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>用于在 Triversa Nanomate 机器人上设置方法和数据采集的软件</td></tr><tr><td>LipidXplorer 1.2.8.1</td><td>N/A</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>用于鉴定脂质的软件</td></tr><tr><td>Peak By Peak</td><td>SpectroSwiss</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>将质谱 .raw 数据转换为 .mzml 格式的软件</td></tr><tr><td>ProteoWizard</td><td>ProteoWizard</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>可选的（开源）软件，用于将质谱 .raw 数据转换为 .mzml 格式</td></tr><tr><td>Q-Exactive 质谱仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>高分辨率轨道阱质谱仪</td></tr><tr><td>Qiagen Tissue Lyser II 组织破碎仪</td><td>Qiagen</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>组织破碎仪</td></tr><tr><td>SpeedVac SPD140DDA</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>真空浓缩仪</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M nano plus</td><td>Tecan</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>恒温混匀仪</td></tr><tr><td>TriVersa Nanomate</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>直接进样纳米电喷雾源</td></tr><tr><td>Xcalibur 4.3</td><td>Thermo Scientific</td><td>.&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td><td>用于在 Q-Exactive 质谱仪上设置方法和数据采集的软件</td></tr></tbody></table>

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

脂质作为所有原核细胞和真核细胞的基本组成成分，发挥着至关重要的作用。随着质谱技术的持续进步，脂质组学已成为监测稳态及疾病状态下组织脂质组构成的强有力分析工具。本文介绍了一种鸟枪法脂质分析的逐步操作方案，该方法可在高通量条件下，对不同组织和生物流体样本中的数百种分子脂质物种实现同步检测与定量。该方法利用自动化纳流直接进样技术，将添加了标记内标物的总脂质提取物不经过色谱分离，直接注入高分辨质谱仪中。从微量的小鼠组织（亚微克级）开始，每份样品的质谱分析仅需10分钟，即可覆盖小鼠肺组织中14个脂质类别多达400种脂质。本文所述方法非常适用于研究疾病机制，以及在小鼠组织中识别和定量指示早期毒性或有益效应的生物标志物。

此处作为代表性结果，我们展示了 Shotgun 脂质组学用于研究香烟烟雾（CS）对小鼠肺部影响的数据。该 Shotgun 脂质分析方案已成功应用于一项体内研究，用于比较两组样本：从9只雌性Apoe−/−小鼠中分离的肺组织，这些小鼠分别暴露于香烟烟雾（3R4F 组；阳性对照）和在洁净空气条件下饲养的小鼠（假暴露组，sham 组）作为阴性对照，样本采集时间点分别为暴露3个月、4个月和6个月。动物饲养环境为过滤并调节的洁净空气，温度为22 °C ± 2 °C，相对湿度为55% ± 15%，并饲喂γ射线辐照的颗粒饲料。光照周期维持在每日12小时。每笼最多饲养8只小鼠。用于暴露处理的3R4F参比香烟购自肯塔基大学，用于生成3R4F香烟烟雾气溶胶（气溶胶中总颗粒物浓度为600 µg TPM/L），目标暴露浓度相当于28 µg尼古丁/L。3R4F香烟产生的香烟烟雾使用30口旋转式吸烟机按照Phillips等人的方法27生成。根据加拿大卫生部强化吸烟方案，对3R4F香烟施加每次55 mL的抽吸体积、每30秒抽吸一次、通风孔完全堵塞的条件，以实现充分暴露。有关研究设计的所有其他细节此前已有报道27,28。
总体而言，共鉴定并定量了14个最丰富的脂质类别中的约400种分子脂质（图3）。PE、PEO、PC、PCO、PI和PG类脂质的每类总归一化脂质浓度略有升高，而SM、LPE和PA类脂质则表现出一定程度的下调（图3A），TAG和PS类脂质则无明显差异。有趣的是，在炎症细胞中已有报道显示，CS组中PCO和PEO缩醛磷脂水平升高29。缩醛磷脂的一种细胞内功能是发挥抗氧化活性。研究表明，在活性氧（ROS）和活性氮（RNS）作用下，与二酰基磷脂相比，缩醛磷脂会发生选择性氧化30。缩醛磷脂化学结构中的乙烯基醚键在氧化应激条件下易受自由基攻击31。自由基攻击的主要产物包括羟基化二十碳四烯酸、2-单酰基甘油磷脂、十五醇、甲酸、不同链长的α-羟基醛、1-甲酰基-2-花生四烯酰基甘油磷脂以及溶血磷脂。
这些结果表明，在基于总分子式的分子特征中，有100-120种化合物受到香烟烟雾（CS）暴露的显著影响（图3D）。通过对MS2碎片信息进行详细解析，并对碎片信号强度进行归一化处理，可近似确定每类脂质中各共轭脂肪酸（FA）的总量（图3E），并可在暴露组与对照组之间比较这些数据。结果显示，完全饱和脂肪酸以及仅含少量不饱和键的脂肪酸均明显减少，这一现象主要出现在溶血磷脂（lyso-lipids）中。相反，在PC、PE和PG磷脂类别中，多不饱和脂肪酸（PUFA）在香烟烟雾（CS）组的所有时间点均有所升高。其中最显著的情况是，与二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）共轭的PC和PG仅在3R4F香烟烟雾暴露组中被检测到（图3E，红色）。
<img alt="用于含有标准品、空白和样品分析的检测的微孔板设置；数据分析背景。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：Bradford 法测定中样品分布的微孔板布局。 空白样和标准品样在第 1–3 列中每孔设置三个复孔；未知样品在第 4–11 列中每孔设置两个复孔。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示样品位置、质控对照以及TB/ISB检测的微孔板布局，用于分析检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：用于鸟枪法质谱分析的96孔微孔板布局。 空白对照、标准品、未知样品及质控样品在正离子化模式下的分布位于板的左侧（第1-6列）；所有负离子化模式的样品均置于右侧（第7-12列）。缩写：pos = 正离子模式；QC = 质量控制；neg = 负离子模式；TB = 总空白对照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂质组学分析结果，倍数变化的柱状图和散点图，相关性热图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：暴露于香烟烟雾的小鼠肺组织的 shotgun 脂质组学分析。 Apoe−/− 小鼠暴露于 3R4F 参比香烟的烟雾（CS）或新鲜空气（假暴露，sham）。(A) 各脂质类别浓度及其包含的脂质种类数量。每种类别括号内为已定量的脂质种类数。各脂质类别的均值及 95% 置信区间，按暴露类型分别显示（三个时间点数据合并）。(B) 火山图显示在三个时间点上，3R4F 香烟烟雾与假暴露组比较中已定量脂质种类的效应大小（log2 倍数变化）和显著性（-log10 FDR 校正 p 值）。显著升高的脂质以黄色标记；显著降低的脂质以青色标记（FDR 校正 p 值 &lt; 0.05）。(C) 25 种绝对平均倍数变化最大的脂质种类的差异丰度。3R4F 香烟烟雾与假暴露组比较的 log2 倍数变化采用颜色编码，并标明统计显著性：*：FDR 校正 p 值 &lt; 0.01；X：FDR 校正 p 值 &lt; 0.05。(D) 比较图。倍数变化比较的相关系数采用颜色编码，并标示共享的差异丰度脂质数量（边缘标注总数）。饼图显示具有相同变化方向（FC 符号一致）的共享差异丰度脂质所占百分比。星号表示差异丰度脂质的重叠具有显著性。(E) 各脂质类别中结合型脂肪酸（FA）的差异丰度。热图同 C 面板，显示在三个时间点上 3R4F 与假暴露组之间具有显著丰度差异的结合型脂肪酸（FDR 校正 p 值 &lt; 0.05）。各脂质类别中每种脂肪酸的含量基于脂肪酸碎片的 MS2 信号强度估算。缩写：CS = 香烟烟雾；FDR = 错误发现率；FC = 倍数变化；FA = 脂肪酸；PC = 磷脂酰胆碱；PS = 磷脂酰丝氨酸；TAG = 三酰甘油；SM = 鞘磷脂；PEO = 缩醛磷脂酰乙醇胺；PE = 磷脂酰乙醇胺；PG = 磷脂酰甘油；PI = 磷脂酰肌醇；DAG = 二酰甘油；SE = 固醇/胆固醇酯；PCO = 缩醛磷脂酰胆碱；LPC = 溶血磷脂酰胆碱；LPE = 溶血磷脂酰乙醇胺；PA = 磷脂酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA 终浓度（mg/mL）</td>
			<td>2 mg/mL BSA 溶液（µL）</td>
			<td>碳酸氢铵缓冲液（µL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0625</td>
			<td>50 的 0.125 mg/mL 溶液</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Bradford 法测定中用于标准曲线的 BSA 内标稀释方案。 缩写：BSA = 牛血清白蛋白。
补充信息：使用 LipidXplorer 进行脂质鉴定的 MFQL 文件。该 .zip 压缩包包含进行脂质鉴定所需的各个独立 MFQL 文件，每个文件的命名遵循以下模式：&lt;脂质类别缩写&gt;_&lt;电离模式&gt;_MS2.mfql（例如，PE_neg_MS2.mfql）。用于标记内标鉴定的文件名在&lt;脂质缩写&gt;中包含 D7(D9) 标签（例如，PED7_neg_MS2.mfql）。这些 MFQL 文件用于验证内标中氘代的含量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

基于 shotgun 质谱的脂质组学能够从多种啮齿类动物组织中，在单次检测中同时对广泛种类的脂质进行高灵敏度的定量分析。

脂质作为所有原核细胞和真核细胞的基本组成成分，发挥着至关重要的作用。质谱技术的持续进步已……

本方案可用于定量动物组织中多种类型的脂质，是研究脂质代谢机制以及识别动物模型中早期毒性生物标志物的便捷工具。该方法可在多种样本基质中，对14个不同脂质类别中的400多种分子脂质进行定量分析，每份样本的梯度运行时间仅为10分钟。首先，用碳酸氢铵缓冲液将离心后上清液1稀释至原浓度的两倍。制备牛血清白蛋白标准曲线后，涡旋震荡标准管，并在室温下以18,200 g离心15秒。从先前制备的标准管中，分别取6 µL的空白样、标准品和样品，加入至96孔平底板中。接下来，使用多通道移液器向每个孔中加入 250 微升考马斯亮蓝试剂，并混匀。在避光孵育 5 分钟后，使用酶标仪在 595 纳米波长处测定吸光度。准备 2 毫升离心管，每管加入 100 微升碳酸氢铵溶液，分别用于总空白和内标空白，所有样品均需置于冰上保存。准备质控样本，每10个样本之间放置一个质控样本。向2毫升离心管中加入10微升混合人血浆，然后向所有内标空白样本、质控样本和研究样本中加入10微升内标溶液。向每个样本中加入300微升-20摄氏度的正丁醇-甲醇混合液，在恒温混匀仪上室温条件下以450 ×g振荡10分钟。接下来，加入 300 微升正庚烷-乙酸乙酯混合液，在恒温混匀仪上于室温以 450 ×g 振荡 10 分钟，然后加入 300 微升 1% 乙酸混合液，在恒温混匀仪上于室温以 450 ×g 振荡 5 分钟。在室温下以 2,800 ×g 离心 5 分钟，将上层相中的 360 微升转移至新标记为 2 的 2 毫升自锁管中。向标记为 1 的水相管中加入 320 微升正庚烷-乙酸乙酯混合液，在恒温混匀仪上于室温以 450 ×g 振荡 5 分钟，然后如前所述在室温下以 2,800 ×g 离心 5 分钟。转移320微升上相液体，并将其与前一步骤所得组分在2号管中合并。同样，向1号管中的水相加入250微升正庚烷-乙酸乙酯混合液，在恒温混匀仪上于室温下以450 g振荡5分钟。再次于室温下以2,800 g离心5分钟，然后转移200微升上相液体，并将其与前几步所得组分在2号管中合并。在真空浓缩仪中于35摄氏度下蒸发至干燥，然后重新溶解于300微升MS混合溶液中。每管涡旋振荡5秒，确保完全溶解，随后在4摄氏度下以18,200 g离心5分钟。取50微升等分试样转移至微孔板中，用于正离子化模式分析，并加入50微升MS混合溶液稀释。再次用80 µL MS混合液稀释，并取20 µL等分试样转移至MTP板中，用于负离子化模式分析。用铝箔包裹该板，在分析前于4 °C保存。在分析前5天或更短时间内，按照制造商说明书对质谱仪分别进行正离子和负离子模式的校准。安装直接进样纳米离子源，确保其与质谱仪的传输毛细管正确对齐，并将4.1微米喷嘴芯片插入芯片架中，随后检查正负离子模式下对应的参数：气压1.25 psi、离子源电压1.1 kV、进样体积5 µL、输出触点闭合Rel1持续2.5秒、输送时间5分钟、样品台冷却温度为4 °C，然后设置温度控制器并创建新的样品板。在正离子模式下，检查并调整软件，确保质谱方法中毛细管温度设为250 °C，S透镜射频（RF）水平设为65.0。在Xcalibur软件中，打开正离子方法，确认全扫描质谱采集参数设置为0至1分钟，m/z范围550至1,000，分辨率140,000，自动增益控制（AGC）目标值为1×10⁶，最大离子注入时间为50毫秒。应用锁质量680.48022。确认在1至5分钟的时间范围内，已设置数据非依赖型MS/MS采集方法，分辨率为17,500，一级质谱固定质量为250 m/z。确认MS2的自动增益控制设置为100,000，最大注入时间为64毫秒，碰撞能量为20 NCE，隔离窗口为1 m/z，并使用从398到1,100 m/z的包含质量列表，质量步长为1道尔顿。在负离子模式采集时，需在调谐软件中确认质谱方法已设置为：毛细管温度 250 摄氏度，S-透镜射频水平（S-lens RF level）为 65.0，且使用相应的 MS 调谐文件。接下来，在 Xcalibur 软件中，检查全扫描采集模式是否已设置为运行 0 至 1 分钟，分辨率为 140,000，覆盖 m/z 400 至 940 范围，自动增益控制（AGC）为 1 百万，最大注入时间为 200 毫秒，并使用 526.46262 作为锁定质量。同时确认 DIA 模式下的 MS2 采集是否已设置为在运行 1 至 5 分钟期间进行，分辨率为 17,500，第一固定质量为 150 m/z，自动增益控制为 100,000，最大注入时间为 64 毫秒，碰撞能量为 35 NCE，并使用包含 m/z 400 至 940 范围、质量步长为 1 道尔顿的包含质量列表。在 Xcalibur 软件中以正离子模式创建分析序列队列并启动，随后在 ChipSoft 软件中创建序列并开始分析，同时等待每个样品由直接进样机器人发出的触点闭合信号触发样品采集。正离子模式分析完成后，在 Xcalibur 软件中以负离子模式创建分析序列队列并启动，随后在 ChipSoft 软件中创建序列并开始分析，同时等待每个样品由直接进样机器人发出的触点闭合信号触发样品采集。总归一化脂质浓度基于最丰富的 14 种脂质类别进行鉴定和定量，其中 PE、PEO、PC、PCO、PI 和 PG 脂质类别的浓度略有升高，而 SM、LPE 和 PA 脂质类别则观察到一定程度的下调。尽管在TAG和PS上未观察到差异，但这些结果表明，在基于总分子式的分子特征中，有100至120种化合物受到香烟烟雾暴露的显著影响。通过对MS2碎片谱进行解卷积并标准化碎片信号强度，可近似确定每种脂质玻璃中各共轭脂肪酸的总量，并比较暴露组与对照组之间的数据。观察到完全饱和及少数不饱和脂肪酸含量减少，而在所有时间点，香烟烟雾暴露组中PC、PE和PG磷脂类别组成中的多不饱和脂肪酸含量均升高。与二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸结合的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PG）的极端情况仅在3R4F香烟烟雾暴露组中被特异性检出。样品及质控样品的移液操作必须使用低吸附枪头，并确保准确性，即每次移取不同样品之间必须检查枪头状态。内标溶液的移液操作尤为关键，必须保证精确。 1 比 1 的二氯甲烷-甲醇溶液需小心操作，必须使用不含增塑剂的枪头，以避免样品中混入塑料聚合物。每处理一个样品之间必须更换枪头。

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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小鼠心血管重塑的多模态研究：四维超声与质谱成像

本文介绍了一种改良的Northern印迹法，用于检测RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。该方法可在不同实验设计条件下，检测多种RNA及其对照样本中的修饰情况。...

一种用于检测细胞和组织中RNA N6-甲基腺苷修饰的方法

了解啮齿动物组织的霰弹枪脂质组学方法，通过质谱技术定量分析400多种分子脂质和14个脂质类别。该方案可快速识别早期毒性生物标志物，为脂质机制研究提供高效工具。

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

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