Name: 线粒体内膜对Na+ 的敏感性揭示了部分分割的功能性辅酶Q库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 探索钠离子作为第二信使在辅酶Q库分化中的作用，了解线粒体电子传递机制。本实验提供了一种简化的检测方法，无需特定细胞模型即可研究部分分割的功能性辅酶Q库。

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感谢 R. Martínez-de-Mena 博士、M. M. Muñoz-Hernandez、A.、C. Jimenez 博士和 E. R. Martínez-Jimenez 提供的技术支持。本研究由 MICIN：RTI2018-099357-B-I00 和 HFSP（RGP0016/2018）资助。西班牙国家心血管研究中心（CNIC）由卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）、科学、创新与大学部（MCNU）以及 Pro CNIC 基金会资助，并被授予塞韦罗·奥乔亚卓越中心（SEV-2015-0505）。图2使用 BioRender.com 制作。

所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并根据2010年9月22日欧洲联盟指令（2010/63/UE）以及2013年2月1日西班牙皇家法令（53/2013）的规定，经西班牙卡洛斯三世国家心血管研究中心（Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, CNIC）机构伦理委员会批准。所有努力均旨在尽量减少使用动物的数量及其所受痛苦。
注意：本比较测定法用于研究线粒体辅酶Q池的区室化，具体描述如下：
1. 蛋白质定量
<ol>
	<li>在实验前，将从小鼠肝脏中分离的野生型线粒体反复冻融三次（即线粒体膜），以使细胞器对反应底物具有通透性26。</li>
	<li>采用Bradford法或二辛可宁酸（BCA）法测定分离线粒体样品的蛋白含量。若使用Bradford法，将2 µL样品加入1 mL 1x Bradford试剂中。</li>
	<li>将样品均分为四个各含20 µg蛋白的亚样品（分别标记为A、B、C、D；图2A）。</li>
</ol>
2. 测定复合物I+III（CI+CIII）活性
注意：本实验步骤使用样品 A 和 B 来测定 CI+CIII 活性（图 2B）。
<ol>
	<li>将样品 A 和 B 各分为两个 10 µg 的子样品（即 A1、A2、B1 和 B2）。将每个子样品与 30 µL 细胞色素 c（10 mg/mL）、10 µL 100 mM 丙二酸盐在 1 mL 比色皿中混合，并加入预热至 37 °C 的 C1/C2 缓冲液（表 1），定容至 980 µL（A2 和 B2 比色皿定容至 979 µL）。 
	警告：此步骤涉及使用有毒试剂丙二酸盐和氰化钾。 
	注意：细胞色素 c（10 mg/mL）需现配，方法为将 10 mg 细胞色素 c 溶于 1 mL 10 mM K2HPO4 溶液中，调节 pH 至 7.2，并在实验全程置于冰上保存。</li>
	<li>在比色皿 A1 和 A2 中加入 10 µL 1 M KCl，在比色皿 B1 和 B2 中加入 10 µL 1 M NaCl。</li>
	<li>向含有子样品 A2 和 B2 的比色皿中加入 1 µL 1 mM 鱼藤酮。 
	警告：此步骤涉及使用有毒试剂鱼藤酮。</li>
	<li>在测量前立即向所有比色皿中加入 10 µL NADH（10 mM）。 
	注意：建议将 10 µL 加入比色皿的侧壁，混合后反应随即开始。</li>
	<li>通过轻轻翻转比色皿三次进行混匀，然后将其放入吸光度比色皿读取仪（UV/VISJASCO 分光光度计）中。</li>
	<li>点击 测量 &#62; 参数 &#62; 常规 ，设置测量参数：波长 550 nm，读取时间 4 分钟；点击 确定 和 开始 按钮以启动实验。</li>
	<li>测量结束后，点击 文件 和 另存为 保存吸光度线性上升阶段的斜率。斜率也可手动记录。</li>
</ol>
3.&#160;测定CII+CIII活性
注意：本实验步骤使用样品 C 和 D 来测定 CII+CIII 活性（图 2C）。
<ol>
	<li>将样品 C 和 D 各分为两个 10 µg 的子样品（即 C1、C2、D1 和 D2）。将每个子样品与 30 µL 细胞色素 c（10 mg/mL）、1 µL 的 1 mM 鱼藤酮混合，并加入预热至 37 °C 的 C1/C2 缓冲液至总体积为 980 µL（C2 和 D2 比色皿中为 970 µL）。 
	警告：此步骤涉及使用有毒试剂氰化钾和鱼藤酮。 
	注意：细胞色素 c（10 mg/mL）需现配，方法为将 10 mg 细胞色素 c 溶于 1 mL 的 10 mM K2HPO4 溶液中，调节 pH 至 7.2，并在整个实验过程中保持冰浴状态。</li>
	<li>在比色皿 C1 和 C2 中加入 10 µL 的 1 M KCl，在比色皿 D1 和 D2 中加入 10 µL 的 1 M NaCl。</li>
	<li>向含有子样品 C2 和 D2 的比色皿中加入 1 µL 的 1 mM 抗霉素 A。 
	警告：此步骤涉及使用有毒试剂抗霉素 A。</li>
	<li>在测量前立即向所有比色皿中加入 10 µL 的琥珀酸（1 M）。 
	注意：建议将 10 µL 试剂加至比色皿的台阶处，以便混合时反应立即开始。</li>
	<li>轻轻混合比色皿，翻转三次。将其放入吸光度比色皿读数仪（紫外/可见光分光光度计）中。</li>
	<li>点击 测量 &#62; 参数 &#62; 常规，设置测量参数：波长 550 nm，读取时间 4 分钟；按下 确定 和 开始 按钮以启动实验。</li>
	<li>测量结束后，通过点击 文件 和 另存为 保存吸光度线性上升阶段的斜率。斜率也可手动记录。</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
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<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
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<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
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<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
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<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
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<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
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<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管该方案是一种识别部分区室化的辅酶Q池是否存在的非常直接的方法，但仍有一些关键步骤需要注意。底物（如NADH或琥珀酸）最好最后加入，因为这些化合物可能发生自氧化。翻转比色皿时必须小心，以避免产生气泡，以免干扰读数。
此外，本技术存在一些局限性，值得指出。测量并非在完整的线粒体中进行，因此缓冲液的人工成分和比例可能与线粒体的天然环境存在差异。 
试剂以过量方式添加，可能无法真实反映完整组织中底物的实际可利用性。
目前的方法需要构建和使用非常特定的遗传模型及设备，而这些在许多实验室中并不容易获得1。本实验方案提供了一种可靠且易于操作的方法，利用广泛可得的试剂和工具来检测部分分化辅酶Q（CoQ）池的存在。因此，该方法有望在今后用于比较线粒体疾病遗传模型的研究中。
流动电子载体在mETC中的移动性仍是一个备受争议的话题25,<sup class="xr...

线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）是驱动三磷酸腺苷（ATP）合成、活性氧（ROS）生成以及线粒体消耗还原当量（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或琥珀酸）的主要通路。OXPHOS系统由五个蛋白质复合物组成：复合物I（CI）氧化NADH，并将辅酶Q（CoQ）还原为泛醇（CoQH2）；复合物II（CII）将琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将CoQ还原为CoQH2；复合物III（CIII）将CoQH2重新氧化为CoQ，并还原细胞色素c（cyt c）；最后，复合物IV（CIV）氧化cyt c，并将氧气还原为水。这一氧化还原链，即所谓的线粒体电子传递链（mETC），与质子（H+）跨内膜（IMM）的泵送相偶联，从而形成电化学梯度，复合物V（CV）利用该梯度将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP。
线粒体电子传递链复合物（mETC）可单独存在于内膜（IMM）中，也可组装成称为超复合物的四级结构。复合物IV（CIV）可与复合物III（CIII）组装，形成III2+IV或Q型呼吸体（因其在CoQH2存在下能够进行呼吸作用）1,2,3，或形成同源二聚体或同源寡聚体4。CIII可与复合物I（CI）相互作用，形成超复合物I+III25。最后，CI也能与Q型呼吸体结合，形成I+III2+IV或N型呼吸体（因其可通过消耗NADH进行呼吸作用）1,6,7,8,9,10。
CoQ 和 cyt c 是可移动的电子载体，分别负责将电子从 CI/CII 传递至 CIII，以及从 CIII 传递至 CIV。在过去二十年中，超级复合物是否对这些电子载体施加功能上的局部限制，一直是激烈争论的议题2,7,11,12,13,14,15,16,17。然而，多个独立研究团队已证明，CoQ 和 cyt c 在线粒体内膜（IMM）中可功能上划分为不同的池。就 CoQ 而言，其可被功能划分为专用于 CI 的特定 CoQ 池（CoQNAD）和另一专用于依赖 FAD 的酶的 CoQ 池（CoQFAD）1,7,12,18,19。然而，为了区分部分分隔的功能性 CoQ 池的存在，需要过表达替代性氧化酶（AOX）并构建特定的线粒体 DNA（mtDNA）突变体，后者可在缺乏 CIII 的情况下组装 CI1,19,20。
在缺氧条件下活性氧（ROS）的产生机制直到最近仍不明确。在急性缺氧过程中，复合物I（CI）会发生活性/非活性（A/D）转换，这一过程伴随着其H+泵送型NADH-CoQ氧化还原酶活性的降低。该H+泵送活性的下降导致线粒体基质酸化，并部分溶解线粒体基质中的磷酸钙沉淀，从而释放可溶性Ca2+。可溶性Ca2+浓度的升高激活了Na+/Ca2+交换体（NCLX），促使Ca2+外排并同时摄入Na+。线粒体内Na+浓度的增加会与线粒体内膜（IMM）内侧的磷脂相互作用，降低膜的流动性以及CII与CIII之间的辅酶Q（CoQ）转移效率，最终生成超氧阴离子这一氧化还原信号分子21。有趣的是，CoQ的转移仅在CII与CIII之间受到抑制，而在CI与CIII之间则未受影响，这表明：1）Na+仅能调节线粒体中已存在的某一特定CoQ池；2）线粒体内膜中存在功能上相互区分的CoQ池。因此，一种广泛用于研究线粒体酶活性的实验方案可用于评估上述CoQ池的存在。
本方案基于在琥珀酸（即复合体II底物）或NADH（即复合体I底物）存在条件下，通过吸光度测定氧化型细胞色素c（CIII的底物）的还原程度。将同一样品分为两份，其中一份用KCl处理，另一份用相同浓度的NaCl处理。由于Na+会降低线粒体内膜（IMM）的流动性，如果辅酶Q（CoQ）在线粒体内膜中仅形成一个统一的功能池，则在Na+存在时，复合体I+CIII和复合体II+CIII的活性均会下降。然而，如果CoQ在线粒体内膜中以部分区隔化的功能池形式存在，则Na+的影响主要（或仅）体现在复合体II+CIII的活性上，而不会影响复合体I+CIII的活性。正如近期研究报道21，Na+仅影响复合体II与复合体III之间的CoQ传递（图1C、D），而对复合体I与复合体III之间的CoQ传递无影响（图1A、B）。
该方案结合多种技术，已用于证实线粒体内膜（IMM）中存在部分区隔化的功能型辅酶Q（CoQ）池，其中一个专用于复合物I（即CoQNAD），另一个专用于FAD连接的酶（即CoQFAD）1,3,7；尽管该现象仍存在争议22，但已被多个研究团队独立验证7,19。因此，复合物I组装成超复合物的结构会影响CoQ在局部的流动性，促进其在超复合物内被复合物III（CIII）利用1,7,13,14,23,24,25。

<table><tbody><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 蛋白测定试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>马心细胞色素 c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>丙二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Manager 软件</td><td>JASCO</td><td>version 2</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

线粒体内膜对 na+ 的敏感性揭示了功能型辅酶q池的部分区室化

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）库部分地被分隔，分别供给复合物I或FAD依赖性酶。这种区室化可通过使用冻融线粒体中以NADH或琥珀酸作为电子供体的比较性测定法轻松评估，其中检测细胞色素c（cyt c）的还原程度。该测定依赖于Na+对线粒体内膜的作用，即降低其流动性。本文介绍了一种在NaCl或KCl存在下测定NADH-细胞色素c氧化还原酶活性和琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性的实验方案。反应通过在比色皿中逐步加入试剂混合物进行，并在Na+或K+存在下于4分钟内通过分光光度法测定。同时平行进行另一组实验，在反应体系中加入特异性酶抑制剂，以扣除非特异性吸光度变化。NADH-细胞色素c氧化还原酶活性在这些阳离子存在下不降低，而琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性在NaCl存在下则显著下降。这一简单实验说明了以下三点：1）Na+可降低线粒体内膜流动性及泛醌（CoQ）的传递；2）超复合物I+III2能够保护泛醌（CoQ）传递不受线粒体内膜流动性降低的影响；3）复合物I与复合物III之间的泛醌传递在功能上不同于复合物II与复合物III之间的泛醌传递。这些结果支持线粒体内膜中存在功能上分离的泛醌库，并表明这些泛醌库可受线粒体所处Na+环境变化的调控。

本方案的典型结果如下所示（图3）。由于还原型细胞色素c在550 nm处有吸收峰，所有未抑制的样品均应显示550 nm处吸光度的增加。理想情况下，抑制样品的吸光度变化应呈平直线或略微上升的斜率（图3）。应从未抑制样品的斜率中减去抑制样品的斜率。
样品A和B均经过相应的抑制校正，代表NADH:细胞色素c氧化还原酶活性，二者斜率相似（图3A）。然而，经过相应抑制校正的亚样品C和D代表琥珀酸:细胞色素c氧化还原酶活性，二者存在差异，其中亚样品C的活性高于亚样品D（图3B）。请注意，不同样品之间的基础吸光度可能略有差异（图3A）。
这些结果（即已通过抑制剂校正的斜率；表2）可通过将所用蛋白质的量（0.01 m...

本方案描述了一种比较性检测方法，通过检测在有或无 Na+ 存在条件下线粒体复合物 CI+CIII 和 CII+CIII 的活性，以研究部分区隔化的功能性辅酶Q池是否存在。

线粒体内膜对 Na+ 的敏感性揭示了功能型辅酶Q池的部分区室化

线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）池部分区隔化，分别分布于复合物I或FAD依赖性酶附近。这种区隔化……

本方案强调了钠离子作为第二信使的作用，同时揭示了部分分化泛酚池的存在。该技术为泛酚池的研究提供了一种极为简便的方法，而以往此类研究通常需要非常特定的细胞模型。该方法也可用于研究其他膜中的电子传递过程，特别是脂滴内酶的电子传递。将样品分为四份，每份20微克，并标记为A至D。将样品A和B各自再分为两份，每份10微克，并标记为A1、A2、B1和B2。按照文本方案中所述配制C1/C2缓冲液，并预热至37摄氏度。在1毫升比色皿中，向每份亚样品加入30微升细胞色素c和10微升丙二酸。加入C1/C2缓冲液，使A1和B1比色皿中的总体积达到980微升，A2和B2比色皿中达到979微升。在A1和A2比色皿中各加入10微升1摩尔氯化钾，在B1和B2比色皿中各加入10微升1摩尔氯化钠。向A2和B2比色皿中各加入1微升1毫摩尔鱼藤酮。在测量前立即向所有比色皿中加入10微升10毫摩尔NADH。将比色皿翻转三次后放入分光光度计中。在连接的软件中，点击“测量”，然后选择“参数”，进入“常规”设置，将测量参数设定为波长550纳米，读数时间4分钟。点击“确定”并点击“开始”以启动实验。测量结束后，点击“文件”并选择“另存为”，保存吸光度线性增加阶段的斜率。将样品 C 和 D 各自分为两个 10 微克的子样品，并标记为 C1、C2、D1 和 D2。将每个子样品与 30 微升细胞色素 c 和 1 微升鱼藤酮在 1 毫升比色皿中混合。向 C1 和 D1 比色皿中加入预热至 37 摄氏度的 C1/C2 缓冲液，使体积达到 980 微升；向 C2 和 D2 比色皿中加入相同缓冲液，使体积达到 970 微升。在 C1 和 C2 比色皿中各加入 10 微升 1 摩尔氯化钾，在 D1 和 D2 比色皿中各加入 10 微升 1 摩尔氯化钠。在测量前立即向 C2 和 D2 比色皿中各加入 1 微升 1 毫摩尔抗霉素 A，并向所有比色皿中加入 10 微升 1 摩尔琥珀酸。将比色皿翻转三次，然后放入分光光度计中。进行测量，并保存测量结束时吸光度线性增加的斜率。本方案用于研究钠离子对线粒体膜在添加NADH或琥珀酸后还原细胞色素c的影响。样品A和B在550纳米处获得的吸光度曲线已根据相应的抑制情况进行校正。这些曲线显示出相似的斜率，表明NADH-细胞色素c还原酶活性相似。然而，样品C和D的曲线有所不同，显示样品C的琥珀酸-细胞色素c还原酶活性高于样品D。为了标准化该技术所测得的变化量，可进一步采用其他方法，如分离的复合物I活性、复合物II或复合物III活性测定。利用该技术，我们正在探索钠可能作为第二信使参与的生理环境。

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

线粒体内膜对Na+ 的敏感性揭示了部分分割的功能性辅酶Q库

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利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

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