采用真空稳定成像系统对实验性急性肺损伤中肺微循环进行活体宽场荧光显微观察

本方案详细描述了用于在活体中成像肺部白细胞黏附和毛细血管灌注的真空稳定系统的手术准备及使用方法。该技术的主要优势在于，能够在对完整、具有镜像结构的肺组织造成最小物理损伤的情况下，实现稳定的高分辨率活体成像。开始时，通过在外环顶部涂抹一层薄薄的真空润滑脂来制备成像窗口，注意避免污染真空通道。

将一块干净的8毫米玻璃盖玻片置于窗口上，轻轻按压以形成密封。将成像窗口连接至配备数字压力计且能提供50至60毫米汞柱恒定负压的真空泵。将一段光纤电缆穿过20号气管插管导管，并将其末端浸入盐酸利多卡因中。

麻醉后，插入改良的耳镜，使上切牙嵌入窥镜的缝隙中。调整耳镜和舌头的位置，直至会厌和声带清晰可见。将光纤导管经窥镜缝隙插入，通过轻微的环形动作使导管穿过声带之间，然后以光纤导管为引导，轻柔地将套管滑入气管，完成小鼠的气管插管。

以1.5%异氟烷开始通气后，通过测试足底反射确认麻醉深度。使用医用胶带将套管固定在鼻部。用标签胶带将右前肢固定在加热垫上，位置为九点钟方向，将左后肢向尾侧伸展并固定在六点钟位置。

使用布质胶带将小鼠的左前爪轻轻拉至12点钟位置，并将胶带另一端固定在活体显微镜平台顶部，随后插入直肠温度探头并佩戴足垫脉搏血氧仪，以全程监测实验期间的生命体征。为准备手术，用70%酒精擦拭小鼠胸腹部进行消毒，并在小鼠左侧体表毛发上涂抹一层薄薄的矿物油以压平毛发。在肋笼底部附近做一个小切口，暴露其下方的肌肉层，然后延长初始切口，采用钝性分离法暴露肋笼。

使用止血钳夹住已解剖的上皮和脂肪组织，并将其移出手术区域。为了荧光标记白细胞和血流，通过尾静脉注射每千克体重2.5毫升的罗丹明6G和FITC-白蛋白团注液。使用有齿镊子夹住吸气末肺底位置下方的肋骨。

轻轻回拉镊子，将肋骨从肺部拉开，然后剪断肋骨以诱发气胸。向两侧横向延长切口，注意不要触碰肺部。用钝头镊子夹住上方相邻的肋骨，轻轻回拉，使肺组织远离胸壁。

如果肺未分离，可轻轻将胸壁压向肺部，使肺与下方的胸膜粘连，从而更容易脱落。继续沿原切口方向一直切至胸骨，并向头侧延伸至肺尖完全暴露。使用棉签和纱布处理任何出现的出血。

抬起肋骨以暴露胸腔背侧的肋间血管，注意不要损伤肺组织，靠近脊柱处电凝最下方的肋间血管，然后切断相邻的肋骨。从尾端向头端方向，反复采用电凝和切割的方式，切除约1厘米×2厘米大小的肋骨部分。为成像做准备，将活体显微成像平台转移至显微镜载物台上，并将成像窗口正对暴露的肺组织上方。

使用显微操作仪小心地降低成像窗口，直至其贴附并稳定在肺表面。为了观察肺微循环，采用配备20倍物镜以及标准FITC和Rhodamine滤光片的宽场荧光显微镜。使用黑白CCD相机以最佳对比度记录视频。

使用 FITC 滤光片组，根据血流汇聚的模式识别肺部血管，并对焦点清晰的血管记录 30 秒视频，然后在同一视野下切换至罗丹明（Rhodamine）滤光片组进行录制，以观察白细胞。为定位肺动脉，使用 FITC 滤光片组识别具有血流发散模式的血管，并记录 30 秒视频。随后在同一视野下使用罗丹明（Rhodamine）滤光片组重复录制，以观察白细胞。

为了定位感兴趣的毛细血管区域，使用 FITC 滤光片组识别一个未被较大血管穿过的肺泡和毛细血管区域，并录制一段 30 秒的视频。在同一视野下，使用罗丹明（Rhodamine）滤光片组重复录制视频，以观察白细胞。本视频显示了由绿色箭头指示的肺部血管中血液流动的 FITC 成像。

罗丹明成像可实现白细胞的可视化，图中红色箭头指示了两个黏附的白细胞。这些方法还被用于观察相同现象以及肺动脉和毛细血管感兴趣区域。为了展示微循环参数的量化分析，小鼠通过鼻内给予脂多糖（LPS）以诱导肺部炎症。

此处展示了肺部血管中白细胞的迁移情况，其中轮廓区域代表在未经处理和经LPS处理的小鼠中分析的内皮区域。在经LPS处理的小鼠中，白细胞的黏附和滚动增加。此处还展示了肺动脉中白细胞的迁移情况，其中轮廓区域代表在未经处理和经LPS处理的小鼠中分析的内皮区域。

经LPS处理的小鼠中白细胞黏附增加。该图显示了在未经处理小鼠和LPS处理小鼠肺毛细血管内的白细胞黏附情况。结果显示，与未经处理小鼠相比，LPS处理小鼠的白细胞黏附显著升高。

该图展示了未经处理和经LPS处理小鼠的肺毛细血管灌注情况。与未经处理小鼠相比，经LPS处理小鼠的功能性毛细血管密度较低。该实验方案存在诸多技术难点。

优化小鼠在平台上的体位是一个简单的步骤，却可显著提高手术和成像步骤的可重复性。该方法可适用于多种研究参数和显微成像技术，因此有望推动对健康与疾病状态下肺微循环的进一步研究。