Name: 龟科害虫的大规模饲养与分子研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 了解龟科害虫的大规模饲养方法，包括人工饲料饲养、性别鉴定和核酸提取技术。该方案适用于高通量测序研究，有助于深入探索害虫生物学特性并改进害虫管理策略。

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作者希望感谢日本促进科学振兴会（JSPS）青年科学家研究奖学金项目的支持［资助编号 19J13123 和 21J00895］。

1. 昆虫采集与大规模饲养
<ol>
	<li>按照已发表的参考文献8,12从田间采集卷蛾科昆虫。 
	注意：&#160;H. magnanima 和 A. honmai 幼虫从受损的茶叶上采集（图1A）；成虫则使用4 W便携式紫外灯（波长365 nm，参见材料表，图1B）诱集。</li>
	<li>将采集的幼虫（图1C、D）单独饲养于1/2盎司的杯子中，每杯放置一块人工饲料，饲养2-3周直至羽化为成虫（图1E、F）。通过形态特征确认蛹和成虫的性别（图1G、I）。</li>
	<li>将雌雄成虫放入一个塑料盒（30 cm × 20 cm × 5 cm）中交配，并在石蜡纸上产下卵块（图1J-L）。在一个120 mL塑料杯中放入一只雌虫和两只雄虫，并放置一张石蜡纸以建立母系谱系。 
	注意：在石蜡纸上制造褶皱非常重要。对于H. magnanima，石蜡纸应置于容器底部；而对于A. honmai，则应将纸张置于容器顶部以收集卵（图1L），因为H. magnanima在茶叶上表面产卵，而A. honmai在叶片下表面产卵8。该方法也已在其他卷蛾科物种中验证，若目标物种的生态习性和行为尚不明确，建议在容器两侧均放置纸张。</li>
	<li>用剪刀将石蜡纸上的卵块剪下（每个卵块约含100-200粒卵12，图1M），将卵块放入1/2盎司的杯子中，并加入碎纸，保持5-7天。 
	注意：成熟胚胎表现出黑色头壳（图1N）。不同卷蛾科物种的胚胎发育期有所差异，但在25 °C、相对湿度60%、16小时光照/8小时黑暗条件下，H. magnanima一般为产卵后5天（dpo），A. honmai为产卵后4天（dpo）7。</li>
	<li>将显示黑色头壳的卵块在4-8 °C下保存7天。</li>
	<li>使用擦丝器将约60 g人工饲料擦成丝状，用于大规模饲养。将含有成熟胚胎的卵块放置于塑料容器（23 cm × 16 cm × 8 cm）内的切碎饲料上，并在卵块上方覆盖带有切碎饲料的石蜡纸（图10）。 
	注意：相对湿度低于30%视为过于干燥，高于70%则湿度过高。在塑料容器盖上打孔有助于改善通风，孔中填充棉花可防止初孵幼虫逃逸。</li>
	<li>为消除卵表面污染物，分别将卵块浸入3%甲醛溶液和0.2%苯扎氯铵溶液中各5分钟12。为清除肠道或细胞内细菌，可使用添加了0.05%（w/w）盐酸四环素或0.06%（w/w）利福平的人工饲料替代普通人工饲料（参见材料表）。 
	注意：此步骤为可选。务必均匀揉捏Silk Mate 2S与0.05%（w/w）盐酸四环素或0.06%（w/w）利福平，以确保混合均匀。</li>
	<li>从塑料容器中收集蛹，并根据形态学12特征区分性别（图1G-I）。 
	注意：通常卷蛾科昆虫在化蛹前经历5-6个龄期12。H. magnanima和A. honmai幼虫自孵化至化蛹分别需要3周和2周时间。</li>
	<li>将15只雄虫和10只雌虫放入一个塑料盒（30 cm × 20 cm × 5 cm，图1K）中，在25 °C、16小时光照/8小时黑暗条件下进行交配。每5-7天收集一次卵，并对每一代重复步骤1.4-1.9。 
	&#8203;注意：若需收集新产的卵块用于后续分析，应设定暗期的起止时间，例如从上午9点至下午5点。在此条件下，H. magnanima和A. honami通常在暗期开始5小时后（即下午2点）产卵。</li>
</ol>
2. 从卵块中分离卵和围蛹幼虫用于固定、通透和染色
<ol>
	<li>将卵块浸入1,000 µL的1.2%次氯酸钠水溶液中10分钟，或浸入1,000 µL的5 M氢氧化钾水溶液中30分钟，以分离卵子。</li>
	<li>用1,000 µL的PBSt（137 mM NaCl，8.1 mM Na2HPO4，2.68 mM KCl，1.47 mM KH2PO4，0.05%聚氧乙烯（20）单月桂酸山梨醇酯[Tween-20]，pH 7.4，参见材料表）清洗分离后的卵子，操作依据先前发表的报告7。</li>
	<li>将卵子浸入500 µL的100%庚烷和500 µL的4%多聚甲醛-PBSt溶液（w/v）的混合液中。使用涡旋振荡器在1,500 rpm下混合10分钟。</li>
	<li>将卵子浸入500 µL的100%庚烷和500 µL的100%甲醇的混合液中。在1,500 rpm下混合10分钟。</li>
	<li>用1,000 µL的100%甲醇洗涤卵子两次，并在100%甲醇中于4 °C保存，直至进行后续实验（图2A）。 
	注：卵子可在4 °C下保存至少1年。</li>
	<li>按照先前发表的报告7，依次将卵子浸入99%、70%、50%乙醇和PBSt中，每种溶液各5分钟，以实现亲水化处理。</li>
	<li>用PBSt洗涤卵子，将卵子浸入1 µg/mL的DAPI溶液中5分钟，然后用1x PBS洗涤两次。将卵子浸入20 µL的1.25%（w/w）乳酸-乙酸地衣红溶液中（参见材料表）11，以观察异染色质，直至细胞核呈现明亮的红色（时间范围为5-60分钟）（图2B、C）。 
	注：乳酸-乙酸地衣红染色时间取决于温度和湿度。建议使用4x-10x放大倍数的显微镜检查染色效果是否合适。</li>
	<li>使用移液器将染色后的卵子转移至载玻片上。用抗荧光淬灭试剂（参见材料表）和盖玻片封片7。</li>
	<li>使用镊子从卵块中取出孵化前的H. magnanima和A. honmai幼虫（产卵后4-5天）（图2D）。在载玻片上将幼虫纵向剖开（图2E）。</li>
	<li>用体积比为1:3（v/v）的99.7%乙酸与100%甲醇混合液固定组织（例如：下咽神经节、胸部神经节、马氏管等）5分钟。用1.25%（w/w）乳酸-乙酸地衣红溶液11染色，直至细胞核着色（根据温度和湿度，可能需要5-60分钟）。</li>
	<li>在显微镜下观察异染色质的存在（雌性）或缺失（雄性）以确定每个样本的性别（W染色体，图2F、G）。 
	&#8203;注：性别通过观察性染色质来确定。每个细胞中，雌性个体的性染色质表现为一个点状结构11,12，而剩余的孵化前幼虫组织（未固定的）应立即浸入细胞裂解缓冲液12（10 mM Tris-HCl，100 mM EDTA，1% SDS，pH 8.0）或含酚的RNA提取试剂中，用于DNA或RNA提取。在解剖前，应预先将20 μL试剂分装至0.2 mL PCR管中（图3A）。将样本浸入后储存于-80 °C，直至进一步提取。样本可保存至少3个月，但建议尽快进行下游实验，以防止核酸降解。</li>
</ol>
3. 从性别确定的围蛹幼虫中提取 DNA 和 RNA
<ol>
	<li>取12只性别已确定的雄性或雌性围蛹期幼虫（5日龄胚胎），放入一个1.5 mL离心管中，并加入细胞裂解缓冲液或RNA提取试剂（参见步骤2.11及材料表）。 
	注意：请按照步骤3.2–3.7进行DNA提取，按照步骤3.8–3.11进行RNA提取。</li>
	<li>在600 μL细胞裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、100 mM EDTA、1% SDS，pH 8.0）中匀浆组织，于4 °C以10,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>用移液器收集上清液（500 μL），加入1.5 µL蛋白酶K（20 mg/mL，参见材料表），在50 °C恒温金属浴中孵育5小时。</li>
	<li>在37 °C下，向样品中加入1.0 μL浓度为10 mg/mL的RNase溶液（参见材料表），处理30分钟。</li>
	<li>向离心管中加入200 μL蛋白沉淀溶液（参见材料表）7，随后在4 °C以17,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>将上清液（500 μL）与500 μL 100%异丙醇混合，然后在4 °C以20,400 × g离心10分钟。</li>
	<li>用1,000 μL 70%乙醇洗涤沉淀DNA两次，之后在室温下空气干燥（5–10分钟），将DNA溶解于30 μL 10 mM Tris-Cl缓冲液（pH 8.5）中。</li>
	<li>在600 μL RNA提取试剂中匀浆组织，向离心管中加入240 μL超纯去离子水，在4 °C以12,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>将上清液（600 μL）与600 μL 100%异丙醇混合，将混合液转移至硅胶膜离心柱（参见材料表），在4 °C以17,900 × g离心1分钟。</li>
	<li>用750 μL 70%乙醇洗涤离心柱，在4 °C以17,900 × g离心两次，每次1分钟。</li>
	<li>向离心柱中加入15 μL超纯去离子水，在4 °C以17,900 × g离心1分钟，以洗脱RNA。</li>
	<li>使用基于紫外吸收的分光光度计测定DNA和RNA的浓度与质量，通过A260/A280（核酸/蛋白质）和A260/A230（核酸/盐类及其他污染物）比值评估核酸纯度13。 
	注意：RNA提取参照先前发表的方法12，但存在苯酚污染问题（见表1）。单个胚胎或围蛹期幼虫提取的DNA和RNA量少且质量较低。通常，从12只围蛹期幼虫提取的DNA产量为100–600 ng，而采用本方法提取的RNA产量为900–1,500 ng，如表1所示。 
	注意：步骤3.13–3.15为可选步骤，适用于后续高通量测序分析。</li>
	<li>使用基于荧光的分光光度计测定DNA和RNA的含量。 
	注意：通过计算RNA浓度比值（基于紫外吸收的浓度（ng/μL）/基于荧光的浓度（ng/μL））来评估其质量，以决定是否适用于后续实验。例如，当基于紫外和荧光的浓度分别为80 ng/μL和60 ng/μL时，比值为1.5（80/60）。通常，比值低于1.5表明核酸纯度足够，可用于高通量测序等下游应用13。</li>
	<li>采用微流控芯片电泳法分析RNA质量14。</li>
	<li>使用合格的RNA，借助RNA文库构建试剂盒（参见材料表）制备RNA文库，并选用适合该文库的测序平台进行测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

卷蛾科包含多种农业和林业害虫；本研究介绍了长期饲养卷蛾、观察其胚胎发育及昆虫性别，并利用成熟胚胎进行分子分析的方法。
害虫昆虫研究的障碍之一是建立人工饲养方法。特别是近交有时会对物种的适合度产生负面影响。这种由近交导致的适合度下降，称为近交衰退，在包括昆虫在内的多种动植物中均有广泛报道15,16,17,18。如前所述，H. magnanima 和 A. honmai 均已在实验室连续维持超过100代（超过10年），且未表现出明显的适合度代价。尽管这尚不足以全面评估其他卷蛾科昆虫是否也普遍具有较高的近交耐受性，但这两个物种可能已通过适应单调的环境条件（即茶园）以及应对多种内共生微生物（例如 Wolbachia11,</s...

鳞翅目昆虫占所有已描述现存物种的10%以上1，其中某些类群的物种对植物造成严重危害，并导致重大的农业损失2,3。尽管已利用家蚕 Bombyx mori 等模式昆虫开展了分子与遗传学研究4,5，但害虫类昆虫的研究仍相对不足，部分原因在于其饲养与操作存在困难6,7。因此，开展基础性研究并建立相应技术手段，对于理解这些非模式害虫的生物学特性至关重要。
卷蛾科（Tortricidae）（鳞翅目），通常被称为卷叶蛾或叶卷蛾，包含许多农业和林业害虫8。在昆虫分类中，东方茶卷蛾Homona magnanima Diakonoff 和夏季果树卷蛾Adoxophyes honmai Yasuda 是东亚地区危害茶树的严重多食性害虫7。这两种昆虫产下扁平、椭圆形、鳞片状的卵块（或称卵团），卵块由薄而柔软且易碎的卵组成，并被母体分泌物覆盖。尽管胚胎发育阶段对昆虫的生长发育和性别决定至关重要9，但卵的结构阻碍了对这些昆虫生物学特性的进一步研究。克服这些困难对于深入研究产此类复杂卵块的害虫具有重要意义。
为了理解卷蛾科昆虫的生物学特性，本研究以 A. honmai 和 H. magnanima 为材料，建立了大规模饲养、观察及分子研究的方法。首先，通过近交方式，已将这两种卷蛾连续饲养超过100代。利用先前在果蝇中开发的碱性和有机溶剂技术，将卵从紧密连接的鳞片状卵块中分离，从而便于对卷蛾胚胎发生过程进行观察10。此外，本研究还建立了使用乳酸-醋酸地衣红染色法对鳞翅目昆虫雌性性染色质进行染色的技术，实现了对小型胚胎的性别鉴定11。结合这些方法，成功从已知性别的胚胎中提取出高质量和高产量的核酸，而这一目标此前难以实现6。所提取的RNA被用于下一代测序。总体而言，本文所介绍的方法可适用于其他鳞翅目昆虫及其他昆虫类群。

<table><tbody><tr><td>1/2盎司杯</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>昆虫饲养；https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr><tr><td>1/2盎司杯盖</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>昆虫饲养；https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>99.7%乙酸</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>36289</td><td>固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>未显示</td><td>核酸定量；https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>核酸定量；https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG&lt;br/&gt; .pdf</td></tr><tr><td>苯扎氯铵溶液</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>消毒；https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>棉</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>昆虫饲养；https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&amp;amp;sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>DAPI溶液</td><td>Dojindo, Tokyo, Japan</td><td>340-07971</td><td>染色；https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS定量试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II柱</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>RNA提取；http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸四钠盐四水合物（4NA）</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>细胞裂解缓冲液（EDTA）；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>玻璃纸</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>昆虫饲养；https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp;amp;&lt;br/&gt; utm_medium=cpc&amp;amp;utm_source=&lt;br/&gt; Adw</td></tr><tr><td>热块WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokyo, Japan</td><td>4002620</td><td>孵育；https://www.attoeng.site/</td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>未显示</td><td>人工饲料；https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>RNA提取；https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>核酸提取；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>染色；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500涡旋振荡器</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>涡旋混合器；https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano Photometer NP 80</td><td>Implen</td><td>未显示</td><td>核酸定量；https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr><tr><td>Natural pack wide</td><td>Inomata chemical</td><td>1859</td><td>昆虫饲养；https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%&lt;br/&gt; 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%&lt;br/&gt; E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%&lt;br/&gt; AF%E3%82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒（用于Illumina）</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>文库制备；https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>地衣红</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>染色；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>便携式紫外黑光灯（4W，365nm波长）</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan</td><td>未显示</td><td>昆虫采集；http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen, MA, USA</td><td>P36965</td><td>抗荧光淬灭；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>DNA提取；https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>蛋白质沉淀溶液</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>DNA提取；https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_&lt;br/&gt; BIOCOMPARE_ProductListing_&lt;br/&gt; 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td></tr><tr><td>利福平</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>消毒；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html</td></tr><tr><td>RNA HS定量试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td></tr><tr><td>RNase溶液</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>RNA提取；https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>未显示</td><td>人工饲料；https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>细胞裂解缓冲液（SDS）；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html</td></tr><tr><td>次氯酸钠水溶液</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>卵分离；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>消毒；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>细胞裂解缓冲液；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>RNA提取；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

卷蛾科害虫的规模化饲养与分子研究

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

卷蛾科（鳞翅目），通常被称为卷叶蛾或潜叶蛾，包含许多对农业和林业造成严重经济损失的害虫。为了深入了解这些害虫的生物学特性，迫切需要建立基础研究技术。本文以两种茶树卷叶蛾——茶卷蛾（Homona magnanima）和茶小卷蛾（Adoxophyes honmai）（鳞翅目：卷蛾科）为研究对象，建立了大规模饲养、形态观察及分子生物学研究的方法体系。通过切片人工饲料进行大规模饲养，并根据其生物学特性连续近交繁殖超过100代。卷蛾类昆虫具有多种性二型特征，因此在发育阶段难以准确鉴定性别，这限制了后续实验的开展。本研究指出，可通过直接观察睾丸或采用乳酸-醋酸地衣红染色法显示雌性特异的W染色体，从而确定卷蛾幼虫的性别。此外，利用该性别鉴定方法，本研究成功实现了从性别明确的胚胎中提取核酸，并应用于高通量测序。这些技术要点同样适用于其他害虫昆虫，将有助于推动更深入的形态学与遗传学研究。

寄主品系的建立与维持 
野外采集的幼虫存活率受采集地点、季节和饲养条件的影响而有所不同（例如，根据Arai等人的研究12，中国台湾桃园地区的存活率可达90%）。通常情况下，约有30%至50%的个体配对后可成功繁殖下一代。对于H. magnanima和A. honmai，已通过近交方式维持母系品系超过100代。
形态学观察与性别鉴定 
使用氢氧化钾（3 或 5 M KOH）或次氯酸钠（1.2% Cl2 或 NaClO）处理可将卵从其连结的卵块中分离（图2A）。较低浓度的试剂无法实现分离。所有固定、通透和染色步骤均能使细胞核被DAPI溶液清晰显示。仅用KOH或NaClO处理（已分离）但未进行固定和通透步骤的卵无法被这些染料染色7。未经处理的H. magnanima卵块未被染色。乳...

本实验方案描述了在实验室中饲养卷蛾科害虫的方法。利用两种卷蛾科害虫，建立了区分昆虫性别的步骤以及用于高通量测序的核酸提取方法。

卷蛾科（Tortricidae，鳞翅目），通常被称为卷叶蛾或叶卷蛾，包含许多对农业和林业有害的害虫，可造成严重的农业……

我们提供了用于大规模饲养、观察以及分子研究的重要害虫——卷蛾类昆虫的基本材料，以研究其生物学特性。迄今为止，昆虫卵的结构一直阻碍了进一步的分析。值得注意的是，我们实现了对那些被母体分泌物覆盖的、薄而柔软且易碎的卵进行研究。有一些简单的方法可望适用于进一步对卷蛾类的研究，并可尝试用于其他昆虫和其他分类群。首先，将一只雌性和两只雄性放入一个120毫升的塑料杯中，并加入一张石蜡纸以建立Matra品系。使用擦丝器切取约60克人工饲料用于大规模饲养。将充满成熟胚胎的卵块放置在塑料容器中切好的人工饲料上。在卵块和切好的饲料上覆盖石蜡纸。将15只雄性和10只雌性放入塑料盒中，在25摄氏度条件下进行交配。每五到七天收集一次卵，并为每一代重复进行大规模饲养步骤。将卵块浸泡在 1000 µL 的 1.2% 次氯酸钠水溶液中 10 分钟，或浸泡在 1000 µL 的 5 摩尔氢氧化钾水溶液中 30 分钟，以分离卵。用 1000 µL 的 PBSt 清洗分离后的卵。将卵浸泡在体积比为500微升100%正庚烷和500微升4%多聚甲醛PBSt溶液的混合液中。使用涡旋振荡器以每分钟1500转的速度混合10分钟。将卵浸入500微升100%正庚烷和500微升100%甲醇的混合液中。在1500转/分钟的条件下混合10分钟。用1000微升100%甲醇将卵清洗两次，并在100%甲醇中于4摄氏度保存。依次将卵浸泡于99%、70%和50%乙醇以及PBSt中，每种溶液各5分钟，以进行亲水化处理。用 PBSt 清洗卵。将卵浸入浓度为每毫升一微克的 DAPI 溶液中五分钟，然后用 PBS 清洗卵两次。将卵浸泡在 20 微升 1.25% 乳酸、乙酸或 CN 溶液中，以观察异染色质，直至细胞核呈现明亮的红色。用移液管将染色后的卵转移至载玻片上，然后加入抗荧光淬灭剂并加盖盖玻片。用镊子从卵块中取出高铁酸盐、Amonamagnetama 和茶小卷叶蛾（Adoxophyes honmai）幼虫。在载玻片上解剖幼虫。用一份99.7%冰醋酸与三份100%甲醇的混合液固定组织，持续五分钟。用1.25%（质量分数）乳酸、冰醋酸或CN溶液染色，直至细胞核着色。在显微镜下观察，根据异染色质的存在（雌性）或缺失（雄性）来确定每个样本的性别。为了从已确定性别的铁幼虫中提取DNA和RNA，将12只已确定性别的雄性或雌性铁幼虫混合，加入细胞裂解缓冲液或RNA提取试剂至一个1.5毫升离心管中。固定、通透和染色步骤可使DAPI溶液对细胞核进行可视化观察。利用解剖后的铁幼虫进行乳酸、醋酸或CN染色显示，雌性个体表现出呈点状的异染色质，而雄性个体则缺乏异染色质。采用离心柱的改良方案提高了RNA的质量，可产生900至1500纳克的产物，其260与200的比值为1.9至2.1，260与280的比值为1.9至2.3。改良方案所得RNA的浓度比值低于1.2，符合下一代测序的质量要求。通过微芯片电泳确认了使用改良方案从性别鉴定的铁螯合物幼虫中提取的RNA的完整性。制备的文库经确认可产生高Q30分值的测序读长。本研究为昆虫基础研究及害虫防治工具的开发提供了贡献。此外，我们的实验方案有望用于评估化学杀虫剂或细胞间微生物在胚胎发育过程中的有效性。

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