Name: 建立胰腺癌斑马鱼患者来源的异种移植物进行化学敏感性测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 了解如何利用斑马鱼患者来源异种移植模型进行胰腺癌化疗敏感性测试。该方法保留肿瘤微环境，可在一周内预测患者对化疗的反应，为个性化医疗提供快速评估工具。

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本工作由比萨基金会（项目编号114/16）资助。作者谨此感谢比萨医院组织病理学部门的Raffaele Gaeta在患者样本筛选和病理学支持方面提供的帮助。我们还感谢Alessia Galante在实验中提供的技术支持。&#160;本文基于COST行动TRANSPAN（CA21116）的工作，该行动由COST（欧洲科学与技术合作组织）提供支持。

所有所述动物实验均已获得意大利公共卫生部批准，符合欧盟关于动物使用与护理的 2010/63/EU 指令。本研究已获当地伦理委员会批准，注册编号为 70213。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。在开始实验前，应准备好所有溶液和设备（第 1 节），并完成鱼类的杂交（第 2 节）。
1. 溶液与设备的准备
注意：需配制的溶液和培养基详见表1。
<ol>
	<li>琼脂糖凝胶支撑
	<ol>
		<li>称取琼脂糖粉末置于可微波加热的烧瓶中，加入一定体积的E3斑马鱼培养基&#160;配制成1%的凝胶。用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。 
		注意：切勿过度煮沸溶液。</li>
		<li>将熔化的琼脂糖倒入培养皿中，静置至凝胶完全凝固。</li>
		<li>使用剪去尖端的塑料巴斯德吸管制备小型琼脂糖圆柱体（高度约5 mm）。制备完成后，将其存放于培养皿中，用铝箔包裹后置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃微针
	<ol>
		<li>使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成细针（设置参数：HEAT 990，PULL 550）。 
		&#8203;注意：一根毛细管可拉制出两根尖端直径为10 µm的细针。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 鱼类杂交与卵收集
<ol>
	<li>按照 Avdesh 等人所述方法，在组织植入前 3 天将成年鱼转移至繁殖缸中17。</li>
	<li>&#8203;注意：建议雄鱼与雌鱼的比例为 1:1 或 2:3。鱼的密度应不超过每升水体五尾鱼。夜间使用隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。</li>
	<li>次日，移除隔板，让鱼进行交配。</li>
	<li>将鱼从繁殖缸中取出，并放回其饲养缸中。</li>
	<li>将繁殖缸中的水倒入细网筛中。用 E3 斑马鱼培养基将受精卵转移至培养皿中。</li>
	<li>使用体视显微镜检查培养皿，弃去浑浊的卵。将受精卵置于新鲜的 E3 斑马鱼培养基中，在 28 °C 下培养。</li>
</ol>
3. 标本采集
注意：高压灭菌镊子和手术刀手柄。
<ol>
	<li>立即处理
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，将肿瘤手术标本收集于 10 mL 肿瘤培养基中（肿瘤标本直径范围为 5 mm 至 10 mm）。将样本在 4 °C 条件下从取材地点转移至处理场所，立即进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜保存（可选）
	<ol>
		<li>将肿瘤手术标本收集于 10 mL 肿瘤培养基中，并在 4 °C 条件下过夜保存样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 -80 °C 保存（可选，最不推荐）
	<ol>
		<li>将样本置于含有添加了 5% 二甲基亚砜（DMSO）的肿瘤培养基的冻存管中，在 -80 °C 条件下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样品处理
注意：所有步骤均需在无菌组织培养超净工作台内进行。
<ol>
	<li>用5 mL新鲜肿瘤培养基清洗整个肿瘤组织，使用塑料巴斯德吸管上下吹打10次。吸除并弃去洗涤液。重复此步骤3次。 
	注意：避免吸入肿瘤组织，因其可能附着在塑料巴斯德吸管上。</li>
	<li>将样本转移至培养皿中，并浸入1–2 mL新鲜肿瘤培养基。使用手术刀片将肿瘤样本切成小块（1–2 mm3），并将其放入含有肿瘤培养基的无菌5 mL塑料离心管中。</li>
	<li>将McIlwain组织切片机设置为100 µm厚度。将组织碎片置于切片机的圆形塑料载物台上进行切割，然后将载物台旋转90°，再次进行切割。</li>
	<li>以300 × g 离心3分钟。随后小心吸除上清液并弃去。</li>
	<li>将组织碎片与荧光细胞示踪染料CM-DiI（终浓度为10 µg/mL的杜氏磷酸盐缓冲液[DPBS]）、Deep Red（终浓度为1 µL/mL的DPBS）或CellTrace（终浓度为5 µM的DPBS）在37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>每隔10分钟轻轻吹打混悬组织碎片。 
	注意：&#160;若使用CellTrace，根据制造商说明，在孵育结束时加入含有至少1%蛋白的培养基。</li>
	<li>以300 × g 离心3分钟，弃去上清液。用1 mL DPBS重复此步骤3次，以去除未结合的染料。</li>
	<li>将组织碎片悬浮于60 mm培养皿中的5 mL DPBS中。 
	注意：确保组织不会干燥。</li>
</ol>
5. 建立斑马鱼PDX模型
注意：所有步骤均需在无菌组织培养超净工作台内进行。
<ol>
	<li>用含有0.16 mg/mL三卡因的E3斑马鱼培养基对受精后2天（dpf）的胚胎进行麻醉。</li>
	<li>在培养皿中放置三个琼脂糖圆柱体（步骤1.1.3），将一个斑马鱼胚胎置于其中一个圆柱体上，使其一侧暴露。吸除多余液体，使胚胎仅保留一层薄薄的溶液覆盖。</li>
	<li>用无菌镊子将染色组织从培养皿中转移至含有胚胎的1%琼脂糖支撑体上。夹取该组织，放置于胚胎卵黄上方，然后用热拉制的玻璃微针（步骤1.2.1）将其推入卵周隙内。</li>
	<li>轻轻向胚胎滴加数滴含1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）的E3培养基，使其重新浸入液体环境中。</li>
	<li>对所有胚胎重复步骤5.2–5.4，最后从培养皿中移除琼脂糖支撑体，并将胚胎在35 °C条件下孵育。</li>
	<li>植入后2小时，使用荧光体视显微镜检查胚胎中异种移植情况（阳性染色）。弃去肿瘤片段未完全位于卵周隙内的胚胎以及死亡胚胎。根据实验设计（如对照组和FOLFOXIRI组），将存活胚胎随机分配至六个多孔板中（每孔最多n = 20个胚胎），每组数量均等。</li>
</ol>
6. 治疗
<ol>
	<li>将药物（例如5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康）稀释于含1%青霉素-链霉素的E3培养液中，通过反复吹打混匀数次。根据Usai等人的建议12，药物在鱼水中的稀释倍数应为等效血浆浓度（EPC）的五倍。</li>
	<li>混合药物以配制药物鸡尾酒（例如FOLFOXIRI）。</li>
	<li>在移植后2小时，移除各孔中的培养基，并加入药物鸡尾酒。</li>
	<li>对胚胎处理3天，每天更换一次药物鸡尾酒。</li>
</ol>
7. 整体免疫荧光染色
注意：实验开始前，将丙酮置于 -20 °C 预冷，并配制表 1 中所列溶液。
<ol>
	<li>第1天：
	<ol>
		<li>在4 °C下，用1 mL 4%多聚甲醛将幼虫固定于玻璃小瓶中过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：
	<ol>
		<li>用1 mL PBS清洗幼虫，每次5分钟，共清洗3次，同时在实验室平台摇床（400 rpm）上轻轻振荡。</li>
		<li>在 -20 °C 条件下，用 1 mL 100% 甲醇保存过夜（或用于长期保存）。</li>
		<li>用1 mL PTw（PBS中含0.1% Tween）重新水化，置于实验室平台摇床上轻轻振荡，每次10分钟，重复3次（400 rpm）。</li>
		<li>用1 mL pH 8.8的150 mM Tris-HCl在室温下透化5分钟，随后在70 °C加热15分钟。</li>
		<li>用 1 mL PTw 洗涤 2 次，每次 10 分钟，在实验室平台摇床上轻轻振荡（400 转/分钟）。</li>
		<li>用1 mL去离子水洗涤2次，每次5分钟2O，于实验室平台摇床中轻轻振荡（400 rpm）。</li>
		<li>在 -20 °C 下用 1 mL 冰冷丙酮孵育 20 分钟以进行透化处理。</li>
		<li>用1 mL去离子水洗涤2次，每次5分钟2在实验室平台摇床中轻轻振荡（400 rpm）。</li>
		<li>用1 mL PTw洗涤2次，每次5分钟，在实验室平台摇床上轻轻振荡（400 rpm）。</li>
		<li>在4 °C下，将幼虫置于1 mL封闭缓冲液中孵育3小时，同时在实验室摇床上轻轻振荡（400 rpm）。</li>
		<li>将幼虫按组分别放入孔板中：每孔50 µL体积中放置10只幼虫，使用96孔板；或每孔100 µL体积中放置20只幼虫，使用48孔板。</li>
		<li>弃去封闭缓冲液，将幼虫置于含有稀释的一抗溶液（如兔抗人cleaved caspase-3，1:250）的孵育缓冲液中，4 °C避光孵育过夜，并在摇床（400 rpm）上轻轻振荡。推荐体积见步骤7.2.11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：
	<ol>
		<li>将幼虫依次用 1 mL PBS-TS（含 10% 正常山羊血清和 1% Triton X-100 的 PBS）洗涤 3 次，每次 1 小时；随后用 1 mL PBS-T（含 1% Triton X-100 的 PBS）洗涤 2 次，每次 10 分钟。&#160;并用1 mL PBS-TS缓冲液洗涤2次，每次1小时。每次洗涤时，将含有幼虫的培养板置于摇床上轻轻振荡（400 rpm）。</li>
		<li>将幼虫与荧光染料标记的二抗（例如，山羊抗兔 IgG [H+L]）孵育&#160;交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记，1:500 稀释，以及 100 µg/mL Hoechst 33258，加入孵育缓冲液中，4 °C 避光过夜孵育，摇床轻柔振荡（400 rpm）。推荐的二抗溶液用量见步骤 7.2.11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天：
	<ol>
		<li>用1 mL PBS-TS在摇床（400 rpm）上轻柔振荡洗涤3次，每次1小时，再用1 mL PTw在摇床（400 rpm）上轻柔振荡洗涤2次，每次1小时。</li>
		<li>在载玻片上制备一层圆形牙釉质（厚度约0.5–1 mm）。让牙釉质干燥后，将幼虫置于圆形层中央，使异种移植片的一侧暴露。</li>
		<li>吸干多余溶液，使用水溶性、非荧光封片剂将盖玻片封固。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 成像
<ol>
	<li>使用40倍物镜在共聚焦显微镜下采集图像。采用以下采集参数：分辨率为1024 × 512像素，Z轴间距为5 µm。</li>
</ol>
9. 使用 ImageJ 分析细胞凋亡
<ol>
	<li>加载 (Fiji Is Just) ImageJ 软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads），打开 Z-stack 文件图像（点击 文件 | 打开）。在弹出窗口中，选择 Stack viewing/Hyperstack，然后点击 确定。</li>
	<li>通过选择 图像 | 颜色 | 创建复合图像 来叠加不同通道。</li>
	<li>拖动图像底部的 Z 轴滑块浏览 Z-stack 图像，并在斑马鱼卵黄周隙中识别异种移植区域（荧光细胞示踪剂阳性的细胞，见步骤 4.5）。</li>
	<li>选择 点选工具，计数凋亡的人源细胞数量（荧光细胞示踪剂和裂解型半胱天冬酶-3 双阳性），如 补充视频 S1 所示。</li>
	<li>双击 点选工具 图标，更改计数器，然后计数所有人源细胞核的总数（CM-DiI 阳性细胞的细胞核）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

体内肿瘤研究模型为理解肿瘤生物学和预测癌症治疗反应提供了宝贵的工具。目前已有多种体内模型可供选择，例如基因修饰动物（转基因小鼠和基因敲除小鼠）或来源于人类原代细胞的患者来源异种移植模型。尽管这些模型具有诸多优势，但各自仍存在一定的局限性。特别是上述模型缺乏可靠的方法来模拟患者肿瘤组织的微环境。
有研究表明，肿瘤微环境可能在药物反应中发挥多种重要作用18。因此，为了寻找一种能够维持肿瘤组织微环境的合适动物模型，研究人员开发了一种替代性的PDX模型，该模型将肿瘤组织碎片异种移植到2 dpf的斑马鱼胚胎中。本实验方案描述了如何在大量胚胎中进行异种移植，从而实现对单一药物或联合用药的高通量药物筛选。
这一创新方法的关键在于，与常用的单细胞悬液zPDX模型相比，它能够同时保留细胞间的相互作用以及肿瘤微环境。来自手术标本的胰腺导管腺癌（PDAC）组织会立即置于新鲜且低温的肿瘤培养基中，并被切割成小片段。生成zPDX模型的整体流程基于将患者肿瘤组织片段直接植...

临床癌症研究的问题之一在于，癌症并非单一疾病，而是一类可随时间演变的多种不同疾病，其治疗需根据肿瘤本身及患者的具体特征制定相应的个体化方案1。因此，当前的挑战在于推动以患者为中心的癌症研究，以识别可用于早期预测癌症治疗效果的新型个体化策略2。这一点对于胰腺导管腺癌（PDAC）尤为关键，因为该类癌症治疗难度大，5年生存率仅为11%3。
胰腺导管腺癌（PDAC）的晚期诊断、快速进展以及缺乏有效疗法仍是目前最紧迫的临床问题。因此，主要挑战在于建立患者疾病模型，并鉴定可用于临床的生物标志物，以根据个体化医疗原则选择最有效的治疗方案4,5,6。随着时间推移，已提出多种用于建模癌症疾病的新方法：源自人类肿瘤组织的患者来源类器官（PDOs）和小鼠患者来源异种移植瘤（mPDXs）。这些模型已被用于重现疾病，以研究治疗反应、耐药性以及疾病复发情况7,8,9。
同样，基于斑马鱼的患者来源异种移植（zPDX）模型因其独特且具有前景的特性而受到越来越多的关注10，成为癌症研究中一种快速且低成本的工具11,12。zPDX模型仅需少量肿瘤样本，使得化疗药物的高通量筛选成为可能13。目前zPDX模型最常用的技术基于对样本的完全消化，并将原代细胞群体进行移植，这种方法可部分重现肿瘤特征，但存在缺乏肿瘤微环境以及恶性细胞与健康细胞之间相互作用的缺点14。
本研究展示了如何将zPDXs用作临床前模型，以确定胰腺癌患者的化疗敏感性特征。该策略显著简化了异种移植过程，因为无需进行细胞扩增，从而加快了化疗药物的筛选速度。该模型的优势在于，肿瘤微环境中的所有组分均得以在患者癌组织原有状态下保留，众所周知，肿瘤的行为依赖于这些组分之间的相互作用15,16。相较于文献中其他替代方法，该模型具有显著优势，能够维持肿瘤异质性，并有助于提高对个体化治疗效果及复发情况的预测能力，从而使zPDX模型可用于共临床试验。本文详细描述了构建zPDX模型的各个步骤，从获取患者肿瘤切除组织样本开始，经过处理后用于分析其对化疗药物的反应。

<table><tbody><tr><td>5-氟尿嘧啶</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 孔多孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 孔多孔板</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖粉末&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>抗核抗体，克隆 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&amp;nbsp;</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>水族网 QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3（Asp175）（5A1E）兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661S</td><td>1:250 稀释</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸 -&amp;nbsp; Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管，3.5&quot;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>外径 = 1.14 mm，内径 = 0.53 mm。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃小瓶&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔&amp;nbsp;IgG&amp;nbsp;（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>伊立替康</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温冷冻管</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板混匀仪</td><td>SCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>奥沙利铂</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount 封片剂</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>10 号无菌不锈钢手术刀片</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>3 号手术刀柄</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Merck</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>垂直微量移液器拉制仪</td><td>Shutter instrument</td><td>P-30&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

建立胰腺癌斑马鱼患者来源异种移植模型用于化疗敏感性测试

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

癌症是全球主要的死亡原因之一，且多种癌症的发病率持续上升。尽管在癌症筛查、预防和治疗方面已取得显著进展，但目前仍缺乏能够预测癌症患者化疗敏感性特征的临床前模型。为填补这一空白，一种 体内 建立并验证了基于斑马鱼的患者来源异种移植模型。 (Danio rerio) 受精后2天的胚胎，用作移植患者手术标本中肿瘤组织异种移植物片段的受体。 
值得注意的是，为了维持对分析肿瘤行为及治疗反应至关重要的肿瘤微环境，活检样本未经过消化或分散处理。本方案详细描述了一种从原发性实体瘤手术切除组织建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。经解剖病理学家筛选后，使用手术刀片对样本进行解剖，去除坏死组织、血管或脂肪组织，随后将其切割为 0.3 mm × 0.3 mm × 0.3 mm 的小块。
将组织块进行荧光标记后，异种移植到斑马鱼胚胎的卵黄周隙。该方法可低成本处理大量胚胎，实现高通量分析。 体内 对zPDXs进行多种抗癌药物的化疗敏感性分析。常规采集共聚焦图像，以检测和量化化疗处理组与对照组相比所诱导的细胞凋亡水平。该异种移植操作具有显著的时间优势，可在一天内完成，为开展共临床试验的治疗筛选提供了合理的时间窗口。

本方案描述了从原发性人胰腺导管腺癌建立斑马鱼患者来源的肿瘤移植模型（zPDX）的实验方法。按照方案第4节所述，采集肿瘤样本，将其切碎并用荧光染料染色。随后按照方案第5节所述，将肿瘤组织片段植入2天龄斑马鱼胚胎的卵黄周隙，成功建立了zPDX模型。如方案第6节所述，进一步对zPDX模型进行筛选，以鉴定患者来源癌细胞的化疗敏感性谱。例如，测试了FOLFOXIRI化疗方案（5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、奥沙利铂和伊立替康），因其被用作晚期胰腺导管腺癌以及转移性结直肠癌的一线化疗方案。采用共聚焦显微镜对zPDX样本进行整体成像，获取Z轴层扫图像，并按照方案第8和第9节所述分析细胞凋亡的诱导情况。如图1A、B所示，与对照组相比，联合治疗组细胞凋亡增加。在本案例研究中，与对照组相比，接受FOLFOXIRI治疗的移植异种移植物中凋亡细胞比例显著升高，差异具有统计学意义（图1C）。
<img alt="比较对照组与FOLFOXIRI组的免疫荧光实验图像，...

临床前模型旨在增进对癌症生物学的认识并预测治疗效果。本文描述了利用肿瘤组织碎片建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。对zPDXs进行化疗处理，并通过检测移植组织中细胞的凋亡情况来评估其治疗效果。

癌症是全球主要的死亡原因之一，且多种癌症的发病率持续上升。在癌症……方面已取得诸多进展

斑马鱼患者来源的异种移植是一种强大的临床前模型，可用于在体内预测癌症患者的化疗敏感性特征。本方案描述了从患者手术标本开始构建该模型的方法。通过将小块组织碎片而非分离的细胞移植到斑马鱼胚胎中，可维持肿瘤微环境，这是肿瘤进展及对化疗反应的关键步骤。该模型的主要优势在于其能够在仅一周的临床相关时间范围内预测患者的预后，从而作为个体化医疗的工具。开始样本处理时，用5毫升新鲜肿瘤培养基清洗从患者体内采集的完整肿瘤组织。使用塑料巴斯德吸管上下吹打10次。小心吸除并弃去洗涤液，然后重复洗涤三次。将样品浸入一到二毫升新鲜肿瘤培养基中。使用手术刀片将肿瘤样品切成一到二毫米见方的小块，然后放入含有肿瘤培养基的无菌五毫升塑料管中。将McIlwain组织切片机设置为100微米厚度后，将肿瘤组织块置于切片机的圆形塑料台面上进行切割。将台面旋转90度，重复切割操作。收集切碎的肿瘤组织碎片至含有肿瘤培养基的15毫升塑料离心管中。将切碎的肿瘤组织片段在300 G条件下离心3分钟，随后吸除并弃去上清液。将组织片段与细胞示踪溶液或替代的荧光细胞标记物（如CM-DiI或Deep Red）在37摄氏度水浴中孵育30分钟。孵育期间，每隔10分钟轻轻重悬组织片段一次。染色结束后，加入含有至少1%蛋白的肿瘤培养基，以去除未结合的染料，培养基体积为染色体积的五倍。以300 G离心3分钟，弃去上清液。加入一毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，DPBS），并重复此洗涤步骤三次。完成后，将组织碎片悬浮于5毫升DPBS中，置于60毫米的培养皿内。为建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zebrafish-based patient-derived xenografts，zPDX），需对受精后两天的胚胎进行麻醉处理。在含有三个琼脂糖圆柱的培养皿中，将一条斑马鱼胚胎放置于其中一个圆柱上，使其一侧暴露。吸除多余溶液，使胚胎保持在一层薄液膜中。使用无菌镊子，将染色的肿瘤组织碎片从60毫米培养皿转移至含有1%琼脂糖支撑的培养皿中，置于斑马鱼胚胎所在位置。然后用加热拉制的玻璃微针夹取组织，将其放置在胚胎卵黄上，并推入卵周隙中。向胚胎中加入数滴含1%青霉素-链霉素的E3培养基，使其重新浸入液体环境中。在所有胚胎中重复完成肿瘤组织移植后，从培养皿中移除琼脂糖支撑物，并将胚胎置于35摄氏度条件下孵育。移植后两小时，使用荧光体视显微镜检查胚胎，确认异种移植部位正确且染色呈阳性。弃去死亡胚胎以及肿瘤片段未完全位于卵黄周隙内的胚胎。操作完成后，根据实验方案将胚胎随机均等地分配至六个多孔板中。通过将药物与含1%青霉素-链霉素的E3培养基混合，稀释药物以配制FOLFOXIRI药物混合液。植入后两小时，吸出每孔中的培养基，加入药物混合液。将胚胎置于35摄氏度培养箱中孵育三天，每天更换

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