Name: 使用三维类器官培养物离 体 维持人胶质母细胞瘤细胞多样性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 了解利用三维类器官培养技术体外维持人胶质母细胞瘤细胞多样性的方法。该技术通过模拟肿瘤微环境，为研究肿瘤生物学、药物疗效及耐药机制提供了重要的实验模型。

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我们谨向Justin Lathia博士表示感谢&#160;宝贵的建议和持续的支持。我们还要感谢 Katrina Fife、Lisa Wallace 和 Maya Camhi 提供出色的技术支持。

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作者声明无利益冲突。

GBM类器官是一种对传统球体培养方法的补充，具有更高的细胞和微环境异质性4,22,30。尽管类器官培养需要更多的时间和资源，但它能够为肿瘤内部行为及药物耐药机制提供有价值的见解。
胶质母细胞瘤（GBM）由一群肿瘤干细胞（CSCs）驱动5,31，这些方法的建立旨在支持该CSC群体的持续生长和自我更新。表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）已知可增强干细胞的维持与增殖，并提供活跃的受体酪氨酸激酶（RTK）信号传导。GBM肿瘤内异质性细胞群体的形成以及独特的肿瘤微环境依赖于对CSC行为的支持。选用低重构基底膜基质（lrECM）可模拟富含层粘连蛋白的脑内环境，支持类器官培养中的细胞通过侵袭实现自我组织和迁移。尽管已有部分研究团队建立了无需使用lrECM或EGF/FGF富集培养基的类器官培养方法24,28，这可能使该培养方法更节省时间，并加强对驱动生长的致癌信号通路的选择性，但本研究选择这些条件是为了优化利于干细胞的环境，以最大程度地建立类器官的细胞异质性。在既往文献中，已有使用lrECM构建脑类器官和GBM类器官的报道21,32,33。尽管我们已掌握有关类器官内肿瘤细胞群体及其空间分布的数据，但对于类器官中非肿瘤细胞群体的情况，以及它们自原始患者样本中存活的时间，目前仍了解较少。某些免疫组化染色（如CD45）可能提供此类信息，未来结合类器官模型开展相关研究将是一个值得关注的方向。
了解类器官培养的预期用途对于选择适当的方法至关重要。从原代样本建立类器官与为特定实验培养均一类器官的流程略有不同。理解类器官如何成熟以及在lrECM支架中逐渐填充的形态变化，有助于合理分配类器官培养所需的时间和资源。类器官中细胞稀疏的区域会缓慢扩展并生长，以填满lrECM，这一过程通常需要2至8周，具体时间取决于样本的生长特性。这种生长速率在一定程度上是各样本固有的，且在不同批次的类器官中保持一致，并与类球体生长的相对速率较为相符。类器官可维持培养超过1年，并在移植至小鼠体内后仍保留成瘤能力；然而，建议根据明确的研究目的进行培养，以避免浪费实验室资源（包括材料和时间）4。已针对多种孔板规格和培养格式测试了类器官的生长情况，结果表明，10 cm培养皿是维持细胞最佳存活率的理想选择，其次为6孔板，每孔接种3个类器官34。与二维培养相比，类器官消耗更多的培养基，使用更小孔径的培养格式无法实现有效的维持培养。例如，96孔板中的单个孔相对于类器官的尺寸而言，其空间和培养基体积均不足以支持类器官的持续生长。
随着类器官的建立，密切观察对于提高成功率至关重要。初期类器官对培养基的消耗较慢，但随着其密度增加并逐渐成熟，培养基的消耗速度会加快。在培养基中添加酚红可作为培养基消耗情况的指示剂。当培养基颜色变黄时，提示我们需要调整换液方案，例如增加换液量、提高培养板中的总培养基体积、将类器官分种到多个细胞培养板以适应其生长，甚至调整实验的时间安排。
在许多方面，类器官进行癌症研究的效率较低。与胶质母细胞瘤（GBM）球体培养相比，类器官培养耗时较长，且成本高昂、资源消耗大。然而，与用于重建细胞和微环境多样性的另一种替代方法——患者来源的异种移植模型（PDX）相比，类器官则更为简便、成本更低且更易于控制。对癌症研究人员而言，选择最适宜使用类器官的时机至关重要。类器官并非旨在取代传统的球体培养或贴壁培养，也不意在取代异种移植模型。当应用于恰当的科学问题时，类器官能够结合这两种系统的优点，使我们得以观察到原本可能被掩盖的肿瘤细胞生物学特性。科学界才刚刚开始理解类器官所提供的研究机遇，但显然，它们将在未来成为解析GBM复杂生物学机制的宝贵工具。

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性脑肿瘤，其预后极差，自确诊起中位生存期约为15个月1。在临床前研究中有效的治疗方法，往往在患者中疗效不佳2,3。临床疗效不佳归因于多种因素，包括GBM的微环境异质性以及复杂的瘤内相互作用。这些因素在实验室中使用传统的贴壁培养或球体培养方法难以重现4。GBM中存在一类具有自我更新能力的肿瘤干细胞（CSCs），也可能加剧了这种复杂性5,6。CSCs对肿瘤的增殖至关重要，可通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及对放疗等治疗手段的耐受来维持肿瘤生长7,8,9。CSCs在肿瘤内的分布并不均匀，而是在特定的微环境区域富集，例如血管周围微环境和坏死周围区域，这些区域各自为CSCs的细胞状态提供独特的分子调控10,11,12,13,14。CSCs并非被动接受微环境信号，而是具备重塑自身微环境的能力7,15,16。CSC的微环境可在营养缺乏、pH变化和缺氧等压力条件下促进干细胞状态的维持17,18,19,20，提示这些条件在模型系统中的重要性。因此，重现肿瘤内多样化的细胞微环境对于理解治疗耐药机制并发现新的治疗策略至关重要。
近年来，三维培养技术的使用日益广泛21,22。类器官已被应用于其他类型的癌症研究，将其细胞维持在类器官状态的主要目的是支持异质性细胞群体的生长（其中许多细胞在更为均一的球状培养中通常会被竞争淘汰）以及实现空间多样性，这种多样性表现为具有遗传特异性的区域性肿瘤微环境4,23,24,25,26。目前存在多种用于癌细胞三维培养的方法，每种方法均有其优缺点27,28,29。类器官培养并非旨在取代传统的贴壁培养或球状培养，而是在需要深入探究细胞微环境与肿瘤细胞反应之间相互作用的特定科学问题时，作为二维培养方法的有力补充技术使用。
本文介绍了一种从原代患者样本或患者来源的培养物中可靠且可重复地生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官的方法。我们针对三维类器官培养提出了&#160;两个不同的目标：（1）从原代患者组织建立类器官，优先考虑最大化的细胞植入潜力，而不要求类器官的均一性；或（2）培养均一的类器官，以用于更定量的实验研究。在将原代标本建立为类器官时，无需进行单细胞过滤或细胞计数，因为保留最大数量和种类的细胞以建立初始培养是首要任务。然而，在为比较性实验培养类器官时，则需要进行单细胞过滤和细胞计数，以确保重复类器官之间的可比性，从而保证实验的一致性。本方案详细说明了如何建立类器官培养体系并生成均一类器官，同时还包括类器官包埋与保存的优化方法，以及标准的细胞培养实验操作，如免疫组织化学、免疫荧光染色和对GBM类器官总细胞活力的评估。

<table><tbody><tr><td>3,3-二氨基联苯胺（DAB）片剂</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>3,3-二氨基联苯胺（DAB）片剂</td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96孔PCR板</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>抗生素-抗真菌剂</td></tr><tr><td>B-27添加剂（不含维生素A）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>B-27添加剂（不含维生素A）（50倍浓缩）</td></tr><tr><td>GelCode Blue 染色试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>染色显影试剂</td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;micro;m）</td><td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>细胞筛（70 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>化学发光细胞活力检测</td></tr><tr><td>Clarifier 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>细胞核苏木精澄清试剂</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>二甲苯替代物</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 苏木精</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>苏木精</td></tr><tr><td>0.85% NaCl中的谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>0.85% NaCl中的谷氨酰胺（200 mM）</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>富含层粘连蛋白的细胞外基质</td></tr><tr><td>微型PAP笔</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>疏水屏障笔</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>不含酚红的Neurobasal培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>不含酚红的Neurobasal培养基（500 mL）</td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>正常驴血清（NDS）</td></tr><tr><td>4%多聚甲醛PBS溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>4%多聚甲醛PBS溶液</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>酚红（0.5%）</td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>液体固化封片剂</td></tr><tr><td>重组人EGF蛋白</td><td>R&amp;D systems</td><td>236-EG-01M</td><td>重组人EGF蛋白（250 &amp;micro;g/mL）</td></tr><tr><td>重组人碱性FGF</td><td>R&amp;D systems</td><td>4144-TC-01</td><td>重组人碱性FGF（250 &amp;micro;g/mL）</td></tr><tr><td>SignalStain 抗体稀释液</td><td>Cell Signaling</td><td>8112</td><td>抗体稀释液</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC 检测试剂</td><td>Cell Signaling</td><td>8114</td><td>免疫组织化学检测试剂</td></tr><tr><td>SignalStain 枸橼酸抗原修复液</td><td>Cell Signaling</td><td>14746</td><td>枸橼酸抗原修复液</td></tr><tr><td>单边剃须刀片</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>单边剃须刀片</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>丙酮酸钠（100 mM）</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>一次性冷冻模具</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>最佳切割温度包埋剂</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>细胞非渗透性染色液（0.4%）</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>二甲苯</td></tr></tbody></table>

维持人胶质母细胞瘤的细胞多样性 离体 使用三维类器官培养

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑癌，预后极差。肿瘤内部的细胞和分子异质性，以及肿瘤微环境之间复杂的相互作用，使得寻找有效治疗方法充满挑战。传统的贴壁培养或球体培养方法可能掩盖这些复杂性，而三维类器官培养则能够重现区域性的微环境梯度。类器官是一种三维GBM培养方法，能更好地模拟患者肿瘤的结构，包含表型多样化的细胞群体，并可用于中等通量的实验。尽管与传统培养方法相比，三维类器官培养更为耗时且劳动密集，但它具有独特优势，能够在现有的体外（in vitro）和体内（in vivo）系统之间架起桥梁。类器官已成为癌症生物学家研究肿瘤行为和耐药机制不可或缺的工具，其应用范围仍在不断扩大。本文详细介绍了生成和维持GBM类器官的方法，同时描述了如何使用冷冻和石蜡包埋技术进行类器官样本的包埋与切片，以及在类器官切片上开展免疫组织化学和免疫荧光染色的实验步骤建议，还包括总体类器官细胞活力的测定方法。

图1 显示了通过10倍光学显微镜观察到的类器官早期生长情况。图1A 显示了单个细胞从中部视野穿过lrECM发生迁移和侵袭。细胞将持续扩展并“定植”于lrECM中，肉眼观察下会逐渐变得更为致密，最终呈不透明状。图1B 显示了多个成熟的类器官（培养7周后）在无放大情况下的大小，相对于一枚十分硬币的尺寸。
图2展示了胶质母细胞瘤类器官中磷酸化组蛋白H3的免疫组织化学染色结果，该蛋白是活跃增殖的标志物。与类器官核心区域相比，增殖最活跃的细胞主要位于类器官的周边区域。阳性染色呈现棕褐色/铜色外观。
图3 描述了使用一种针对3D培养物的荧光细胞活力检测法，对胶质母细胞瘤类器官进行均质化处理并测定总细胞数的流程。由于胶质母细胞瘤类器官中细胞数量较多，需首先将较大的类器官结构在荧光检测试剂中通过吹打重悬的方式进行均质化处理。随后，取部分总体裂解液分别加入各个孔中，并在孵育及使用合适的多孔板读板仪检测前，加入额外的荧光检测试剂进行稀释。
图4展示了类器官的DMSO（常用溶剂）对照数据。所绘制的数据表明类器官内部及类器官之间的结果具有一致性。在生成实验数据时，发光法检测的存活率数据通常会以每个样本的对照组为基准进行归一化处理。
<img alt="显微镜下真菌生长；硬币大小比较，示意图；真菌形态与大小研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：光学显微镜下视野（10倍）。（A）早期类器官生长，显示胶质母细胞瘤细胞在富含层粘连蛋白的细胞外基质中迁移/侵袭。（B）成熟类器官与一角硬币大小的比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学切片、染色组织、显微分析、细胞结构、放大插图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：胶质母细胞瘤类器官的免疫组织化学分析。 （A、B）胶质母细胞瘤类器官显示磷酸化组蛋白 H3 染色细胞，提示活跃增殖。A 和 B 的比例尺分别为 600 µm 和 300 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="类器官活力检测示意图：培养、吹打分散、试剂稀释、发光信号测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：类器官发光法细胞活力检测流程。（A）将单个类器官转移至小型离心管中，并吸除多余培养基。（B）向每管中加入500 µL 1:1 PBS与发光法细胞活力检测试剂的混合液，用力吹打以解离类器官。（C）向96孔板的每个孔中加入25 µL上述类器官混合液和75 µL相同的1:1 PBS与发光法细胞活力检测试剂混合液。（D）置于摇床上震荡2分钟，随后在室温下孵育20分钟，然后使用酶标仪读取发光信号。该图使用BioRender.com制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="类器官在0.1% DMSO中的细胞活力图；相对光单位数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：细胞活力。 四个患者样本中每个样本四个类器官的技术重复六次，在0.1%二甲基亚砜（DMSO）条件下的类器官细胞活力数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无酚红 Neurobasal 培养基</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>不含维生素 A 的 B-27 添加剂（50 倍浓度）</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂（100 倍浓度）</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠（100 mM）</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠溶液（0.85%）中的谷氨酰胺（200 mM）</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（250 µg/mL）</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人表皮生长因子蛋白（250 µg/mL）</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酚红</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：完全神经基础培养基（NBMc）配方
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% 乙醇</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% 乙醇</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% 乙醇</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% 乙醇</td>
			<td>4 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% 乙醇</td>
			<td>2 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% 乙醇</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% 乙醇</td>
			<td>4 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二甲苯替代物</td>
			<td>2 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二甲苯替代物</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二甲苯替代物</td>
			<td>4 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>石蜡</td>
			<td>15 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>石蜡</td>
			<td>15 分钟</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：小型类器官（直径小于3 mm）的处理时间表
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：大型类器官（直径大于3 mm）的处理时间表
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running diH2O</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear hematoxylin clarifying reagent</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running diH2O</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing Reagent</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running diH2O</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：苏木精复染

在此，我们描述了一种从原代患者样本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官并将其培养至成熟的方法。这些GBM类器官包含表型多样化的细胞群体，并可重建肿瘤微环境 离体.

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑癌，预后极差。瘤内细胞和分子异质性……

由于肿瘤中存在细胞多样性以及不同微环境之间的相互作用，寻找胶质母细胞瘤的治疗方法具有挑战性。类器官能够帮助重现部分这种空间异质性，我们可以利用这一点更深入地理解肿瘤的生物学特性。与传统的细胞培养方法通常产生均质的肿瘤细胞群体不同，类器官能更真实地模拟胶质母细胞瘤的分子和细胞多样性，并更准确地建模瘤内相互作用。类器官可用于研究药物疗效及耐药机制。对临床治疗的耐药性可能仅在类器官中出现，而不在传统的球体培养中出现，从而反映了该疾病的临床实际状况。类器官有助于展示化疗药物的区域性效应。它们可用于发现新的特定微环境疗法，未来还可作为个性化医疗的预测工具。用于构建类器官的一些材料对温度敏感，若未能将其保持在适当温度，可能导致类器官构建或维持困难。在培养罩内开始准备类器官模具：将石蜡纸从Parafilm膜上取下，并将其置于两个无菌的96孔聚合酶链式反应（PCR）板之间。确保石蜡膜内表面清洁。对顶板施加均匀压力，在石蜡膜上压出深度为两毫米的小凹陷，注意不要产生孔洞。随后将两板分开。带凹痕的封口膜将粘附在顶板上。然后将顶板置于干冰上30秒。使用无菌镊子迅速将封口膜从顶板上揭下。冷冻的封口膜更容易去除。将制备好的封口膜模具放入一个加盖的无菌10厘米细胞培养皿中。为从胶质母细胞瘤（GBM）贴壁培养物中制备单细胞悬液，需从培养板中移除用过的培养基。然后向培养板中加入2毫升室温的细胞解离溶液，在37摄氏度下孵育3分钟。在显微镜下确认细胞从培养板上脱离后，加入8毫升完全Neurobasal培养基（NBMc培养基）以中和细胞解离溶液。将悬液通过一个70微米的单个细胞滤筛进行过滤。在120 × g条件下离心细胞5分钟。然后弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升NBMc中。使用不能透过细胞的染料对单细胞悬液中的细胞进行计数。为了从单细胞悬液中制备类器官，将适量富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）加入置于冰桶或冷块中的小型离心管内。准备含有每种类器官20,000个细胞的细胞混合液。充分混匀lrECM与细胞悬液的混合物，以避免细胞沉降，否则会导致类器官形成不均一。接下来，小心地将 20 微升混合物用移液器滴加到帕拉膜模具上，形成珍珠状液滴。每处理两到三个类器官后，需及时冷却移液枪头，以防止 lrECM 发生聚合。当在 10 厘米培养皿中的帕拉膜模具上滴加完所需数量的类器官后，将类器官置于细胞培养箱中，在 37 摄氏度下孵育一至两小时。类器官凝固后，使用 P1000 枪头以 NBMc 培养基轻轻将类器官从 Parafilm 模具上冲洗下来，并收集至含有 20 毫升 NBMc 培养基的新的 10 厘米培养皿中。将培养皿放入培养箱中，静置培养 4 天。4 天后，更换培养皿中的培养基。为此，请在细胞培养板下方放置一张深色纸。倾斜培养板并等待20秒。当类器官完全沉降到培养皿底部后，用带有大开口的玻璃移液管缓慢吸出培养基。加入新的培养基后，将培养板置于摇床式培养箱中，以80 RPM的转速孵育，并在此之后每两到三天更换一次培养基。通过光学显微镜观察类器官的生长情况。在中心视野中，早期类器官生长显示出细胞迁移及单个细胞通过lrECM的侵袭现象。七周大的成熟类器官大小相当于一枚十分硬币。对胶质母细胞瘤（GBM）类器官进行磷酸化组蛋白H3的免疫组织化学染色，结果显示类器官边缘区域存在大量呈棕色或紫色的高增殖性细胞，而核心区域较少。在0.1% DMSO条件下，类器官的细胞活力数据表现出良好的类器官内和类器官间一致性。注意类器官的生物量及培养基酸化情况。如果类器官消耗培养基过快，请务必更频繁地更换培养基，或将类器官分种到额外的培养板中。成熟的类器官可用于药物治疗实验，或包埋切片后用于免疫组织化学或免疫荧光分析。解离后的类器官可用于流式细胞术分析。这些类器官最近被用于三维功能性筛选，以发现空间上不同癌症干细胞微环境中必需的靶点。我们还利用这些模型在体内测试前对不同药物和疗法进行优先排序。

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