Name: 人类神经肌肉接头光遗传学模型的工程和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习利用光遗传学刺激和视频处理技术构建功能性三维体外人类神经肌肉接头模型。该方法可用于定量评估神经肌肉连接功能，并检测神经毒素及重症肌无力患者血清对功能的影响。

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我们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）[资助编号 EB025765 和 EB027062]、美国国防部（DOD）[奖项编号 W81XWH-18-1-0095] 以及加州大学旧金山分校健康创新工程中心（HIVE 奖学金）提供的资金支持。我们衷心感谢哥伦比亚大学干细胞中心在细胞重编程方面提供的帮助与指导。

本研究中使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。
1. 生物反应器准备
<ol>
	<li>制作生物反应器模具
	<ol>
		<li>从补充CAD文件下载生物反应器的CAD文件，或自行设计定制方案。</li>
		<li>使用CAM软件根据3D模型生成数控（CNC）加工路径。</li>
		<li>使用数控铣床加工聚甲醛（acetal）模具。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物反应器的制备
	<ol>
		<li>按10:1的基础剂与固化剂比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS，每4个平台/模具使用77 g混合物）。</li>
		<li>将混合物放入真空腔室，关闭所有阀门，开启真空泵，至少脱气30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔室内继续脱气1小时。</li>
		<li>用模具的上半部分以正确方向盖合模具。在中心位置放置一根钢制六角棒，并在两侧夹紧。</li>
		<li>用PDMS重新填充顶部空隙。</li>
		<li>在65 °C烘箱中固化至少4小时。</li>
		<li>冷却至室温后，将平台从模具中取出。</li>
		<li>使用超声波清洗机依次以洗洁精、400 mL 100%异丙醇和蒸馏水各清洗1小时，对装置进行清洁。</li>
		<li>在65 °C下干燥过夜。</li>
		<li>将玻璃盖玻片浸泡在1%非离子型聚醇表面活性剂中30分钟，并确保盖玻片不重叠，以保证充分涂层。</li>
		<li>用蒸馏水充分冲洗，并在65 °C下干燥过夜。</li>
		<li>使用等离子清洗机，以6 L/min的氧气流量在高功率下处理1–2分钟，对玻璃盖玻片和PDMS平台进行表面活化。处理后，立即通过将PDMS压在盖玻片上至少30秒，实现两者的键合。</li>
		<li>在接种细胞前，对键合后的装置进行高压灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 构建光学刺激装置
<ol>
	<li>使用 30 mm 笼式立方体系统，将一块 573 nm 二向色镜安装在中心位置。将一个红色 627 nm LED 与一块 594 nm 长通激发滤光片耦合，并将其安装在立方体的顶部侧面，使 LED 朝向二向色镜。然后将一个蓝色 488 nm LED 与一块 546 nm 短通激发滤光片安装在立方体的相邻侧面，使 LED 朝向二向色镜，如 图 3A 示意图所示。</li>
	<li>在笼式立方体底部安装一个环控虹膜光阑，以控制照明区域的大小。</li>
	<li>通过 T-Cube LED 驱动器为每个 LED 供电，并使用 Arduino Uno Rev3 板进行控制。将 LED 驱动器的侧边输入端连接至电源插头，中间输出端连接至 Arduino，侧边输出端直接连接至 LED。</li>
	<li>通过 USB 线缆将 Arduino Uno 连接到计算机。</li>
	<li>从 GitHub 链接（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）下载文件。</li>
	<li>打开 GitHub 文件夹中的 &#34;Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino&#34; 文件。</li>
	<li>设置起始参数：步数 = 30；起始频率 = 0.5；终止频率 = 3；脉冲长度 = 100。</li>
	<li>确保引脚输出 4 分配给蓝色 LED 驱动器，引脚输出 2 分配给红色 LED 驱动器。检查 LED 驱动器的中间导线是否已连接至接地端和相应的引脚输出端。</li>
	<li>编译并加载 &#34;Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino&#34; 程序至 Arduino。</li>
	<li>将每个 LED 驱动器连接至对应的通道。</li>
</ol>
3. 细胞培养设置（第 -21 至 0 天）
<ol>
	<li>原代骨骼肌细胞
	<ol>
		<li>解冻并扩增原代骨骼肌成肌细胞（购自 Cook Myosite），使用肌强直生长培养基（含补充剂）最多传代六次。将细胞维持在 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
		<li>每两天更换一次培养基。</li>
		<li>当细胞融合度达到约 60% 时，使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1×，37 °C 下作用 5 分钟）进行传代。收集解离的细胞，并加入新鲜培养基以中和胰蛋白酶。</li>
		<li>在 300 x g 条件下离心细胞，吸除细胞沉淀上方的上清液。</li>
		<li>用 MGM 重悬细胞，按 1:3 比例接种，每三联瓶接种 60 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ChR2-hiPSC 
	注意：本研究所使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。在本方案中，表达 ChR2 的 hiPSCs 通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术生成，方法如先前文献所述18，但任何稳定的光遗传学细胞系（如慢病毒、piggyBac 等）均可采用相同方式使用。选用在 iPSCs 和运动神经元中均能组成型表达的启动子（CAG）。如先前发表的研究所指出18, 19，这些细胞具有正常的核型。
	<ol>
		<li>用 DMEM/F12 按 1:80 稀释的可溶性基底膜基质溶液包被 6 孔板，每孔 1 mL，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>在包被好的 6 孔板中接种 iPSCs，每孔加入 2 mL 无饲养层细胞培养基（iPSC 培养基），每隔一天更换 2 mL 新鲜培养基，每 5–7 天传代一次。将细胞维持在 37°C 和 5% CO2 的培养箱中。</li>
		<li>传代
		<ol>
			<li>将干细胞与 1 mL 无酶干细胞释放试剂孵育 4 分钟，并用宽口 P1000 移液器进行机械剪切以实现解离。</li>
			<li>在包被好的 6 孔板中，每孔加入 2 mL iPSC 培养基，按 1:24 或 1:48 的比例接种细胞，同时加入 2 μM 盐酸Y-27632。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 骨骼肌组织接种（第 -3 天）
<ol>
	<li>使用自动细胞计数器分离并计数 30 × 106 个成肌细胞。</li>
	<li>将成肌细胞重悬于 I 型胶原蛋白（3 mg/mL）与溶解的基底膜基质的 4:1 混合液中（800 μL 胶原混合液 + 200 μL 基底膜基质，终体积为 1 mL）。配制胶原成分时，加入配套的中和试剂（胶原与中和试剂按 9:1 混合），并用 1× PBS 稀释至终体积 800 μL。</li>
	<li>向生物反应器的每个肌肉腔室中加入 15 μL 细胞-胶原悬液，使用移液枪头确保悬液均匀覆盖两个支柱（图 2）。</li>
	<li>将细胞-凝胶混合物在 37 °C 下聚合 30 分钟，随后向每个生物反应器孔中加入 450 μL 成肌细胞生长培养基。</li>
	<li>3 天后（待凝胶收缩完成后），开始成肌管分化。</li>
</ol>
5. 肌管分化（第0-14天）
<ol>
	<li>通过将组织更换为 450 μL 融合诱导培养基（FS，表 1）开始肌管融合，持续 7 天，每隔一天更换一次培养基。 
	注意：建议在人诱导性多能干细胞向运动神经元分化的同一天开始肌管分化，以便在两种细胞类型的分化周期结束时进行运动神经元接种。</li>
	<li>第 7 天，将培养基更换为 450 μL 成熟培养基 Ia（MMIa，表 1）。</li>
	<li>第 9 天，更换为 450 μL 成熟培养基 Ib（MMIb，表 1）。</li>
	<li>第 11 天，将培养基更换为 450 μL NbActiv4。此后每 2 天更换一次培养基，直至接种运动神经元（步骤 7）。</li>
</ol>
6. 运动神经元分化（第 0-14 天）
注意：我们的运动神经元分化方案改编自 Maury 等人8。
<ol>
	<li>第0天，将4 × 106个ChR2- hiPSCs转移至含15 mL运动神经元悬浮培养基（MSCM，表1）的超低吸附培养皿中。在MSCM中添加3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和5 μM Y-27632二盐酸盐。</li>
	<li>第2天，使用37 μM可逆滤网分离神经球（NS），并将其重悬于含3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和0.1 μM视黄酸的15 mL MSCM中。自第2天起，在不使用显微镜的情况下即可在培养皿中观察到神经球。</li>
	<li>第4天，将细胞及培养基转移至50 mL离心管中，静置使神经球沉降至管底（5分钟）。吸除上清液，并将细胞重悬于15 mL MSCM中，该培养基需添加0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541和0.1 μM视黄酸。</li>
	<li>第7天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含0.5 μM SAG和0.1 μM视黄酸的MSCM中。</li>
	<li>第9天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含10 μM DAPT的MSCM中。</li>
	<li>第11天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的MSCM中。</li>
	<li>第14天，将运动神经元接种至实验平台中。</li>
</ol>
7. 在生物反应器中接种运动神经元聚集体（第14天）
<ol>
	<li>制备4:1的凝胶混合物，包含2 mg/mL I型胶原蛋白和Matrigel（800 μL胶原蛋白混合物 + 200 μL Matrigel，最终体积为1 mL）。对于胶原蛋白组分，加入配套的中和剂（胶原蛋白与中和剂按9:1比例混合），并用1× PBS稀释至最终体积为800 μL。</li>
	<li>使用400 nm细胞筛筛选较大的神经球，并将其重悬于凝胶混合物中。</li>
	<li>吸除储液池中的培养基，并小心吸除神经球孔道中的培养基（图2）。</li>
	<li>向神经球通道中加入15 μL凝胶混合物。</li>
	<li>用10 μL移液器吸取10 μL凝胶，然后挑取一个神经球。</li>
	<li>将神经球（NS）置入神经球通道中，并确保其位于腔室内。在释放剩余凝胶的同时缓慢提起移液器。若不确定神经球是否已正确放置，可通过显微镜检查其位置。</li>
	<li>在37 °C条件下静置30分钟，使凝胶完成聚合。</li>
	<li>向储液池中加入450 μL NbActiv4培养基，补充20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，以促进神经球向肌肉组织的轴突生长。</li>
</ol>
8. 神经肌肉接头功能的同步光刺激与视频记录（第24天及以上）
<ol>
	<li>成像时，使用配备科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的倒置荧光显微镜。</li>
	<li>将相机软件的像素合并设置为2x2，曝光时间为20 ms，卷帘快门开启，读出速率为540 MHz，动态范围：12位&amp;#38;增益1，传感器模式：重叠模式。</li>
	<li>使用显微镜上的2倍物镜对微组织进行成像。</li>
	<li>将活细胞培养室（37 °C，5% CO2）安装到显微镜载物台上。</li>
	<li>选择包含神经支配的骨骼组织的感兴趣区域（ROI），以减小文件大小和处理时间。</li>
	<li>在样品与成像物镜之间放置一个594 nm长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。</li>
	<li>将含有4个生物反应器（共24个组织）的矩形4孔板放入活细胞培养室中。</li>
	<li>点击 实时预览。调整图像位置并聚焦至目标感兴趣区域。</li>
	<li>从GitHub文件夹（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）上传自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino控制板和视频采集。</li>
	<li>设置输出视频文件名为：日期_组织组_组织名称_实验名称.nd2。</li>
	<li>运行宏代码，设定载物台上的目标X、Y坐标，并以每秒50帧的速度采集包含1700帧的快速时间序列图像。</li>
	<li>成像后更换培养基，并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔24小时，以避免组织疲劳。</li>
</ol>
9. 批量处理与分析（第24天及以后）
<ol>
	<li>视频处理
	<ol>
		<li>使用自定义的 MATLAB 代码对视频进行批量分析。文件可从 GitHub 文件夹下载（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）。函数列表及说明见&#160;表2。 
		注意：该代码兼容 .nd2 和 .czi 格式。需在 MATLAB 中启用并行处理，并安装 bioformats 软件包。</li>
		<li>运行 recursiveOSAnalysis 脚本，通过并行处理分析视频。将所有采集的视频文件放在同一文件夹中，并在运行代码时选择该文件夹。</li>
		<li>根据需要调整分析后参数。
		<ol>
			<li>如果在记录开始时检测到自发性收缩，应更改 baselineTime （选项 1）。这会导致初始读数远高于 0，需调整帧以进行补偿。</li>
			<li>如果收缩未被记录，应更改 peakThreshold （选项 2）。默认情况下，代码会检测高于最高峰值 25% 的收缩，因此可调整该值。</li>
			<li>更改 minMinProminence 和 minMinWidth 以调节检测每个峰起始点时的灵敏度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生成视频和图形输出。
		<ol>
			<li>运行 recursiveOSMovie 为每份组织生成对应的视频文件及其收缩力轨迹图。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 神经肌肉接头功能的扰动（第24天及以上）
<ol>
	<li>通过向补充有 20 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF 的 NbActiv4 基础培养基中添加外源效应物，制备处理用培养基。
	<ol>
		<li>对于重症肌无力（MG）血清实验，使用含 20% MG 患者血清的 NbActiv4 + BDNF + GDNF 培养基。</li>
		<li>对于 BTX 实验，使用含 5 μg/mL BTX 的 NbActiv4 + BDNF + GDNF 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用步骤 3.2 进行刺激/成像，记录基线数据。</li>
	<li>将组织中的培养基更换为处理用培养基（每组织 450 μL）。</li>
	<li>孵育所需时间（患者血清处理为 48 h，BTX 处理为 20 min）。</li>
	<li>再次使用步骤 3.2 进行刺激/成像，记录处理后的功能状态。</li>
	<li>移除处理用培养基，并让组织休息所需时间（血清移除后 48 h） 
	注意：刺激与成像之间应至少间隔 24 h，以避免组织疲劳</li>
</ol>

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<li>Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neuromuscular+junctions+and+their+potential+for+novel+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).</li>
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作者声明无利益冲突。

该系统是一种经过工程化设计的三维人体组织模型，结合了光遗传学与视频处理技术，可实现对神经肌肉接头（NMJ）功能的自动化且无偏倚的评估。通过采用标准化的实验方案，我们已证明该系统能够测量生理发育过程中NMJ功能的变化，并表征诸如神经毒素暴露以及重症肌无力患者血清等病理条件对NMJ造成的损害效应。
既往研究报道，可通过将重症肌无力（MG）患者血清与光遗传学人多能干细胞（hPSC）来源的运动神经元和骨骼肌肌管共培养，建立MG的体外模型22。然而，该系统为二维培养，且在随机位置记录肌肉收缩，从而限制了实验的可重复性，并降低了模型的定量分析能力。与二维系统相比，本系统最大的优势在于能够模拟三维环境，更真实地促进运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkMs）之间的细胞相互作用和形态发育。大量证据表明，三维系统在模拟组织表现出类似其天然生理状态所需的生物力学信号方面具有显著优势13,14,<sup class="...

神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkM）之间的化学突触，介导肌肉收缩。某些毒素（如神经毒素α-银环蛇毒素（BTX））或神经肌肉疾病（NMD）（如重症肌无力（MG））可导致NMJ退化，进而造成肌肉控制能力下降1。与动物模型相比，生物工程化的人体组织模型能更真实地模拟人类NMJ的功能和生理机制，并具有更高的转化应用潜力。
尽管动物模型推动了对神经肌肉接头（NMJ）形成与功能的理解，但人类与动物突触之间存在显著差异，这限制了研究结果向人类的转化，也使得在体（in vivo）条件下对NMJ的表征变得困难2,3,4。研究表明，小鼠与人类的NMJ在生理特性上存在明显差异。与人类NMJ相比，小鼠的NMJ更大，但活性区密度更低4。此外，在动物模型中开展的药物研究并不总能反映人类临床试验中观察到的效果。工程化的人体组织模型为研究NMJ的正常发育过程、神经肌肉疾病的病理机制以及开展药物筛选提供了可能。人诱导多能干细胞（hiPSCs）5可被分化为多种细胞类型，包括骨骼肌细胞6,7和运动神经元8,9。hiPSCs可便捷地由患者细胞制备，从而通过患者特异性的组织模型实现更优的疾病建模10和药物筛选11,12。
骨骼肌细胞（SkMs）与运动神经元（MNs）的二维（2D）单层共培养体系缺乏生理性神经肌肉接头（NMJs）的形态、表型、结构组织及功能行为。在二维培养中，神经肌肉接头随机形成，这阻碍了运动单位的分离分析，限制了精确的功能测量，并使其无法用于重复性、系统性的实验13。三维（3D）神经肌肉接头组织模型克服了上述诸多局限，能够重现生理性神经肌肉接头的形态学与功能特征7,14,15,16,17。利用该模型，两种组织类型可先分别培养，再通过引导轴突生长实现整合，从而形成比二维培养系统更为有序的神经肌肉接头。
我们之前的研究表明，将光遗传学与组织工程技术相结合，能够实现对神经肌肉接头（NMJ）功能的精确无创刺激和评估18,19。通过基因工程，可将光敏感蛋白整合到人诱导多能干细胞（hiPSCs）的基因组中。将响应蓝光而开启的离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）整合到神经元等可兴奋细胞的膜上，可实现对细胞激活的非接触式时空控制20,21,22。携带ChR2的hiPSCs可分化为对蓝光敏感的光遗传学运动神经元，从而无需使用传统侵入性电极来刺激神经元，并避免电极对肌细胞产生不必要的刺激23。该系统利用光遗传学运动神经元刺激非光遗传学的骨骼肌细胞产生收缩。结合视频采集与可控蓝光照射，可同时对共培养的组织进行刺激和记录，以评估神经肌肉接头功能。
重症肌无力（MG）由靶向烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体引起，导致神经肌肉接头（NMJ）功能下降和肌肉无力24根据临床症状、电生理诊断以及通过血清学血液检测发现的自身抗体进行诊断。然而，并非所有参与重症肌无力（MG）的自身抗体均已被识别，部分血清阴性患者虽被诊断为MG，但尚未发现明确的抗体。25,26我们的系统可在添加重症肌无力（MG）患者血清前后，对神经肌肉接头（NMJ）进行重复的功能评估，从而深入揭示MG抗体所引起的功能性与生物化学改变。18. 本方案阐述了如何制备3D 体外 可用于诊断和研究神经肌肉接头（NMJ）病理并测试潜在治疗手段的功能性人类NMJ模型。我们展示了该系统在两种平台上的多功能性：一种微流控装置和一种较大的开放式培养皿生物反应器平台。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基与添加剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>G-5 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素，重组人源</td><td>默克生命科学</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>基质胶</td><td>康宁</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>干细胞技术</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>MyoTonic 生长培养基试剂盒</td><td>Cook Myosite</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 mL</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A13710-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>干细胞技术</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm 笼式立方体系统</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 和 ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;micro;m 可逆过滤器，大型</td><td>干细胞技术</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>546 nm短通激发滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>573 nm 二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01&amp;ndash;25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nm 长通发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>594 nm 长通激发滤光片</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>蓝色（470 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 时 65 流明</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&amp;deg; 带集成支腿的霜面10毫米圆形光束光学件</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60 mm 超低吸附培养皿</td><td>康宁</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>散热器</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;光学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 400 &amp;micro;m，25 个装，无菌</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &amp;micro;m，25 个装，无菌</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>红光（627 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 下光通量为 65 流明</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>环形驱动虹膜光圈</td><td>ThorLabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>T-Cube LED 驱动器</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;霉菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带内螺纹六角间隔柱，&amp;nbsp; 3 1/2&quot; 10-32，半螺纹 1/2&quot;</td><td>麦克马斯特</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>低剖面&amp;nbsp;C型夹</td><td>麦克马斯特</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;生长因子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腺苷3&amp;prime;,5&amp;prime;-环一磷酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021，10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>人源CNTF，研究级，5 &amp;micro;g</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>人玻璃连接蛋白蛋白，CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>人玻璃连接蛋白蛋白，CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 重组人蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白，天然</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>重组人Agrin蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>重组人GDNF蛋白，CF 50μg</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组人神经营养因子3&amp;nbsp;100 μg</td><td>细胞科学</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>重组人神经营养素-4</td><td>细胞科学</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>重组人音猬因子/Shh（C24II）N端</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>重组人/小鼠/大鼠 BDNF 50 μg</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸，50 mg</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG 激活剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10 mg</td><td>干细胞技术</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源的玻璃粘连蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-肌动蛋白结合蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1）</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>胆碱乙酰转移酶 (ChAT) (山羊)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>结蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1）</td><td>Dako</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白重链（MHC）（小鼠 IgG2b）</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>自动载物台</td><td>应用科学仪器</td><td>MS-2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>扩展型等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001&amp;nbsp;(115V)</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 自动细胞计数仪</td><td>Marshal Scientific</td><td>I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>系列阶段顶部培养箱系统</td><td>Tokai Hit STX</td><td>TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS 相机</td><td>Andor Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino 软件（IDE）</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td>Mastercam</td><td>Solidworks 的 Mastercam</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab</td><td>R2021b</td><td></td></tr><tr><td>NIS元素</td><td>尼康</td><td>基础研究</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D CAD</td><td>Solidworks</td><td>Solidworks 标准版</td><td></td></tr></tbody></table>

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

许多神经肌肉疾病（如重症肌无力，MG）均与神经肌肉接头（NMJ）功能障碍相关，但由于动物与人类之间存在生理差异，该接头在动物模型中难以准确表征。组织工程技术为提供 体外 可用于诊断和研究神经肌肉接头（NMJ）病理并测试潜在治疗手段的功能性人源NMJ模型。通过将光遗传蛋白引入诱导性多能干细胞（iPSCs），我们构建了可被特定波长光刺激的神经元。若NMJ结构健康且功能正常，运动神经元发出的神经化学信号将引发肌肉收缩。结合光遗传学、微加工技术与组织工程学，我们建立了一种基于视频分析的无偏倚、自动化方法，用于表征NMJ功能。本研究制定了标准化操作流程，涵盖NMJ构建、同步进行光学刺激与视频记录，以及组织收缩性的视频分析。利用光刺激光遗传学运动神经元以诱导骨骼肌收缩，可模拟人类NMJ的生理过程，并实现对NMJ功能在不同时间点及不同干预条件下的重复性功能检测。我们展示了该平台能够呈现神经肌肉连接功能随时间改善的能力，并可表征重症肌无力患者抗体或神经毒素对NMJ功能造成的损害效应。

通过共培养光遗传学人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元与非光遗传学骨骼肌组织，生成了神经肌肉接头。将人原代骨骼肌成肌细胞（SkM）接种至培养平台中，并采用为期2周的方案分化为多核肌管。光遗传学运动神经元在肌管分化的同时单独进行分化，随后接种至平台中（图1）。在运动神经元接种后7–12天，组织开始在蓝光刺激下发生收缩，表明神经肌肉接头已成功形成并趋于成熟。神经肌肉接头在运动神经元接种后可培养、刺激和成像长达40天，但最佳观测时间点为第16天19。分化过程的形态学与生化验证以及光遗传学蛋白的表达情况见于补充图1，并在先前的研究中得到验证18,19。
为了证明该方案可轻松适配于不同的培养系统，本研究采用两种不同的区室化反应器进行了验证：一种微流控装置和一种开放式培养孔生物反应器。这两种系统具有相似的设计，其中一个腔室设有用...

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。

许多神经肌肉疾病，例如重症肌无力（MG），均与神经肌肉接头（NMJ）功能障碍相关，而神经肌肉接头功能障碍难以...

本方案描述了如何构建可用于研究神经肌肉疾病及测试潜在治疗方法的功能性三维体外人源神经肌肉接头。该技术结合了同步光遗传学刺激与视频处理方法，可量化神经肌肉接头功能在发育过程中以及受外界因素（如神经毒素和重症肌无力患者血清）影响时的变化。将肌细胞和运动神经元接种到生物反应器中的步骤起初可能具有挑战性。将胶原凝胶混合物保持在冰上，有助于延长凝胶固化前接种所有细胞的可用时间。首先，按10:1的比例将聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基础剂与固化剂混合，并将混合物放入真空腔中。关闭所有阀门，开启真空泵，对混合物抽真空至少30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔内继续抽真空1小时，然后以正确方向盖上模具的上半部分并闭合模具。在模具中心位置放置一根六角钢棒，并在两侧用夹具夹紧。接下来，用PDMS重新填满上层，并在65摄氏度的烘箱中固化模具至少4小时。待模具冷却至室温后，将平台从模具中取出。同时，将玻璃盖玻片浸入1%非离子型表面活性剂聚醇溶液中30分钟，确保盖玻片不重叠且均被充分包被，随后用蒸馏水充分冲洗，并在65摄氏度下干燥过夜。使用等离子清洗机，在氧气流量为每分钟6升的高功率条件下处理玻璃盖玻片和PDMS平台1至2分钟。处理完成后，将PDMS压在盖玻片上至少30秒，使两者紧密结合。配制体积比为4:1的混合液，其中包含浓度为3毫克/毫升的I型胶原蛋白和溶解的基底膜基质，然后将成肌细胞重悬于该新鲜配制的胶原混合液中。接下来，将15微升该细胞-胶原悬浮液加入生物反应器的每个肌肉室中，确保使用移液枪头将悬浮液均匀分布在两个支柱上。在37摄氏度下使细胞凝胶混合物聚合30分钟，然后向每个生物反应器孔中加入450微升肌管生长培养基。在运动神经元分化第11天，将细胞和培养基转移至50毫升离心管中，静置5分钟使神经球沉降至管底。吸去上清液，将细胞重悬于15毫升运动神经元悬浮培养基中，该培养基需添加20纳克/毫升脑源性神经营养因子和10纳克/毫升胶质细胞源性神经营养因子。在分化方案的第14天，将运动神经元接种至培养平台中。配制4:1比例的凝胶混合液，包含2毫克/毫升的胶原蛋白1和溶解的基底膜基质。使用400纳米细胞筛选择较大的神经球，并将其重悬于已准备好的凝胶混合物中。小心吸去储液池和神经球孔中的培养基，然后向神经球通道中加入15微升凝胶混合物。用10微升移液器吸取10微升凝胶，挑取一个神经球。将神经球植入神经球通道中，确保其位于腔室内，然后在释放剩余凝胶的同时缓慢提起移液器。在37摄氏度下使凝胶聚合30分钟，随后向储液池中加入450微升添加了20纳克/毫升脑源性神经营养因子和10纳克/毫升胶质细胞源性神经营养因子的NbActiv4培养基。成像时，使用配备科学级互补金属氧化物半导体相机软件的倒置荧光显微镜。将二分之一设为2×2，曝光设为20毫秒，开启滚动快门，读出速率设为540兆赫兹，动态范围设为12位，增益1，传感器模式设为重叠。在显微镜上使用2倍物镜对微组织进行成像，并将活细胞培养室连接至显微镜载物台。选择包含神经支配的骨骼组织的感兴趣区域，以减小文件大小和处理时间，然后在样品与成像物镜之间放置一个594纳米长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。接下来，将一个包含四个生物反应器的矩形4孔板放入活细胞培养室中，然后点击实时成像，对所需的目标区域（ROI）进行居中和聚焦。从GitHub文件夹下载自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino控制板和视频采集，并将输出视频文件命名为“day_组织组_组织名称_实验.ND2”。设置载物台上所需的X和Y坐标，运行宏代码，并以每秒50帧的速度采集共1700帧的快速延时图像。成像后，更换培养基并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔 24 小时，以避免组织疲劳。对于视频处理，从 GitHub 文件夹下载文件，并使用自定义的 MATLAB 代码对视频进行批量分析。打开递归OS分析脚本，将所有采集的视频放在同一文件夹中。调整预分析参数，然后运行recursiveOSAnalysis脚本，通过并行处理来分析视频。根据需要调整后续分析参数，如基线时间、峰值阈值、最小-最小显著性及最小-最小宽度。最后，通过运行 recursiveOSMovie 生成视频和图形输出，为每种组织生成相应的视频文件及其收缩性轨迹。本方案已使用两种不同规模的系统进行测试：一种是微流控装置，可生成长约 1 毫米、包含约 20,000 个成肌细胞的骨骼肌组织；另一种是开放式培养皿生物反应器系统，可生成长约 4 毫米、包含约 450 个成肌细胞的肌肉组织。搭建了光学系统，以实现用蓝光对运动神经元进行可控刺激，并结合定制的显微镜宏脚本与定制的 Arduino 代码来提升神经肌肉接头（NMJ）功能。该代码包含可调节的参数，并根据光脉冲与收缩峰起始之间的时间来判断是否触发收缩。该系统捕捉到神经肌肉接头（NMJ）功能的改善：在组织构建一周后，触发性反应增加，随后功能稳定维持一周。α-银环蛇毒素（alpha-bungarotoxin）完全阻断了所有触发性和自发性收缩，导致NMJ功能彻底中断，表明组织的光刺激依赖于功能完整的NMJ。用20%重症肌无力患者血清处理48小时后的组织分析显示，其功能较使用健康供体血清处理的对照组组织有所下降。去除并洗去血清48小时后，构建的神经肌肉接头显示出功能恢复。确保所有生物反应器在烘箱中放置时间相同，以避免不同批次之间出现刚度差异。此外，务必使用显微镜验证运动神经元的接种情况。在此步骤之后，可进行代谢组学、蛋白质组学和CRISPR筛选，以获取更多信息，并更深入地理解病变血清所引起的机制性变化。

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

人类神经肌肉接头光遗传学模型的工程和表征

该视频展示了利用微流控装置形成神经肌肉接头的过程。将神经前体细胞和肌源性前体细胞分别接种到装置内的不同小室中，并使其分别成熟为运动神经元和肌管。通过建立体积和化学梯度，诱导形成具有活性的神经肌肉接头。...

使用微流控装置生成神经肌肉接头

本视频展示了一种评估功能性神经肌肉接头的方法。通过使用包含肌肉组织和运动神经元的生物反应器，并结合荧光显微镜技术，对神经元中的光敏通道进行刺激，从而产生电信号，引发肌纤维收缩。...

通过同步光学刺激与视频记录评估功能性神经肌肉接头

来源：Marinello, M.，等. 通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头.J. Vis. Exp.

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头

神经肌肉接头（NMJ）的功能评估可提供有关肌肉与神经之间通信的关键信息。本文介绍了一种利用两种不同的肌肉-神经标本——即比目鱼肌-坐骨神经和膈肌-膈神经——全面评估NMJ及肌肉功能的实验方案。...

测量神经肌肉接头功能

本文提供了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）在体外生成神经肌肉接头（NMJs）的实验方案。该方法可在单个孔中于一个月内诱导形成具有成熟形态和功能的神经肌肉接头。所获得的神经肌肉接头有望用于相关疾病的建模、病理机制的研究，或用于药物化合物的治疗性筛选。...

由人诱导性多能干细胞体外诱导生成神经肌肉接头

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。...

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

本方案描述了一种通过共聚焦与STED显微镜联合进行神经肌肉接头形态计量分析的方法，用于量化脊髓性肌萎缩（SMA）和与ColQ相关的先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中的病理改变。...

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

本实验方案介绍了一种利用不同生物标志物（即神经丝蛋白200、囊泡乙酰胆碱转运体、α-银环蛇毒素和S100）进行荧光免疫组织化学染色，以检测大鼠腓肠肌内侧头中突触前末梢、突触后受体及突触周施万细胞之间空间相关性的方法。...

可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

本研究展示了一种改进的单纤维肌电图（SFEMG）方案，用于在啮齿类动物模型中实现神经肌肉接头（NMJ）传递功能的体内测量。文中详细描述了SFEMG技术的逐步操作流程，以实现对大鼠腓肠肌中神经肌肉接头传递变异性和传递失败的定量评估。...

刺激性单纤维肌电图（SFEMG）用于评估啮齿类动物模型中神经肌肉接头传递功能

在此，我们介绍一种结合了 体内...

颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

学习利用光遗传学刺激和视频处理技术构建功能性三维体外人类神经肌肉接头模型。该方法可用于定量评估神经肌肉连接功能，并检测神经毒素及重症肌无力患者血清对功能的影响。

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

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