一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

本方案旨在验证候选抗HBV化合物是否通过阻断NTCP结合来抑制病毒进入。该技术用于研究任何候选化合物是否可阻断HBV进入或感染的初始步骤。本次实验操作将由我实验室的PSP学生Piyanoot Thongsri进行演示。

开始测量钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）时，将成熟的肝细胞与8毫摩尔或更高浓度的乙二胺四乙酸（EDTA）孵育15分钟。收集细胞沉淀，并通过加入300微升含3.7%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）固定肝细胞15分钟。随后将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中，在300 × g、25摄氏度条件下离心10分钟。

用 700 微升含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS 重悬细胞，按照前述方法在离心机中离心 10 分钟，洗涤细胞两次。然后在室温下用 300 微升含 0.05% Triton X-100 的 PBS 对细胞进行透化处理，持续 20 分钟。离心后，使用 700 微升含 1% FBS 的 PBS 洗涤三次，每次洗涤 1 分钟。

将细胞与针对NTCP的一抗在1:100的比例下于4摄氏度孵育30分钟，随后用破膜洗涤缓冲液洗涤三次，并进行离心。再将细胞与偶联Alexa Fluor 488的二抗在4摄氏度下染色30分钟，并重复用破膜洗涤缓冲液洗涤三次，每次一分钟。在300 ×g离心后，用含有1% FBS的200微升PBS重悬细胞沉淀。

在软件中选择流式细胞术分析的测量参数，包括 FSC、SSC、FITC 或 PE。根据文稿中的说明设置自动补偿调节，并纳入补偿对照。接下来，以每分钟 60 微升的中等流速运行未染色样本。调节前向散射和侧向散射阈值，直至覆盖目标细胞群。

在此区域标记门控范围，并将其应用于所有补偿对照。使用未染色对照设置光电倍增管（PMT）荧光，并调节阴性象限中FITC或PE的PMT电压。运行阳性染色样本，并调节阳性象限中FITC或PE的刻度。

运行未染色、FITC染色或PE对照样本，计算补偿值，并将其应用于样品设置。接下来，运行肝细胞样本以检测NTCP水平。随后，在BD FACSuite窗口中依次选择对照管和数据源选项卡，开始分析染色的肝细胞。

等待原始数据出现。接下来，在右侧的工作表选项卡中，单击椭圆门控按钮，使用鼠标光标在SSC与FSC散点图上选择细胞群体。然后等待圆形P1出现。

单击区间门控按钮，并在异硫氰酸荧光素染色的直方图中标记区域，从最右侧的最高荧光强度值开始。屏幕上将出现标线 P2。

点击实验试管，观察工作表选项卡中的数据发生变化。点击统计按钮，然后点击空白区域和工作表。随后，观察牛磺胆酸钠共转运多肽群体的统计数值。

吸去100%汇合度的MHC孔板中的培养基，加入用William's E培养基稀释的4 µM环孢素A，作用2小时。接着，吸去候选的乙型肝炎病毒进入抑制剂，替换为含有4%聚乙二醇的1毫升William's E培养基。然后，在37°C条件下，将培养基与乙型肝炎病毒颗粒以每孔感染复数为100的比例共同孵育18小时。

然后，弃去上清液，加入2 mL冷的PBS，轻轻混匀以洗去未结合的乙型肝炎病毒及旧培养基。将细胞在2 mL完全William's E培养基中培养7天后，用PBS洗涤细胞，并用3.7%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定15分钟。随后，将感染的细胞在室温下用免疫荧光封闭液孵育60分钟，再加入以封闭液按1:200稀释的一抗，在4°C条件下过夜孵育。

然后使用洗涤液洗涤三次，每次一分钟，接着在室温下用稀释比例为1:500的二抗孵育细胞一小时。洗涤三次后，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。使用配备DAPI和PE滤光片的荧光显微镜，以20倍物镜观察荧光信号，以评估候选化合物的抗HBV进入活性。

进行细胞结合实验时，按先前所示方法制备细胞，并在4°C条件下与乙型肝炎病毒颗粒共同孵育2小时。弃去培养基后，用2毫升预冷的PBS轻轻振荡洗涤细胞。随后使用细胞刮收集感染的细胞，并用裂解缓冲液裂解细胞。

将细胞裂解液转移至收集管中，利用聚合酶链式反应（PCR）并根据文中所述的温度条件提取总DNA。按照先前展示的方法制备细胞后，在室温下用牛磺胆酸钠溶液孵育肝细胞15分钟，吸除溶液，并用冷HEPES缓冲液洗涤细胞三次。接着，在冰上加入300至500微升冷HEPES缓冲液，使用细胞刮刀收集细胞。

使用超声波在20千赫兹条件下处理细胞20秒以实现细胞匀浆，随后将样品置于冰上孵育5分钟。在10,000 G条件下离心后，收集上清液，并使用牛磺胆酸ELISA检测试剂盒测定细胞内牛磺胆酸浓度。为清洗等温滴定 calorimetry（ITC）仪器中的细胞和注射器，请启动ITC软件。

在“运行实验”高亮选项卡下，选择用于19次注射的微型量热法（micro cal method）ITCM，然后点击“打开”。当新窗口出现后，点击“清洁”选项卡，在清洁方法窗口中，为样品池清洁方法选择“洗涤”按钮，为注射器清洁方法选择“冲洗”按钮。点击“下一步”，并按照屏幕上的指示操作。

将样品加入等温滴定量热仪（ITC）后，点击“运行实验”选项卡下方的加载按钮。然后点击“下一步”，并按照视频说明操作，直至完成此加载步骤。使用注射器将参比池中加入缓冲液溶液，样品池中加入含有15 µM NTCP的缓冲液。

除去多余的溶液，然后用150 µM姜黄素配体溶液填充注射器，避免产生气泡。在“运行实验”标签下点击运行按钮开始运行样品。实验信息和设置将显示在左侧。

输入配体蛋白的浓度和温度信息。点击“开始”以执行加样过程。等待1.4小时，使蛋白与配体的相互作用完全进行。

注射完成后，选择高亮的分析按钮，使用分析软件对原始数据进行分析。然后，点击概览以显示原始数据，并选择拟合模型为一组结合位点。观察到肝细胞成熟特征，包括双核细胞和多边形形态，尤其是在MHC的分化阶段。

在分化后的HepaRG细胞和分化后的MHC细胞中，NTCP的表达量显著升高。与分化后的HepaRG细胞相比，分化后的MHC细胞中检测到更多的高度糖基化形式的NTCP。分化后的MHC细胞中的NTCP水平高于未分化细胞。

通过病毒免疫荧光染色在感染后第7天评估抗乙型肝炎病毒（HBV）进入活性，并通过实时聚合酶链式反应检测病毒与细胞表面受体结合水平。牛磺胆酸摄取分析表明，候选化合物的抑制活性通过NTCP途径降低了乙型肝炎病毒的结合。通过向样本细胞连续注射检测到显色变化。

基于一个结合位点与数据拟合良好的标准非线性最小二乘回归进行作图。实线表示对实验值的最佳拟合，用于SBB结合以及细胞与乙型肝炎病毒颗粒在4°C下孵育的情况。牛磺胆酸的摄取可通过放射性技术进行评估。

可以使用液体闪烁计数器来定量放射性牛磺胆酸的水平。该技术简单快捷，可用于筛选任何抗病毒治疗方案中的病毒进入情况，有助于预防感染或再感染。