标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 金黄色葡萄球菌 生物膜
2022年6月8日
本实验方案描述了中性粒细胞与生物膜相互作用的研究方法。 金黄色葡萄球菌 生物膜形成 体外 并与外周血来源的人中性粒细胞共孵育。通过显微镜检测中性粒细胞在生物膜内的定位，并定量其中性粒细胞的氧化爆发反应。
这些实验方案旨在深入了解人类中性粒细胞如何与细菌生物膜相互作用并将其杀灭。目标是更全面地理解这一过程，并尽量减少不同实验之间的变异性，同时认识到不同供体来源的人类中性粒细胞本身存在个体差异所带来的固有问题。此处列出的技术已经过优化，可使研究人员在开展实验时实现最小的变异性，尤其适用于松散附着的生物膜研究。
此外，这些方案也可经适当调整后用于研究其他能够形成生物膜的微生物。首先，采用划线接种法在营养丰富的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂）上培养金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），从冻存菌种中获得单菌落。随后，用无菌水稀释多聚赖氨酸（PLL），取100 µL加入96孔板的各个孔中，对单个孔进行包被，并在室温下孵育30分钟。
使用真空辅助的吸液装置无菌吸除PLL溶液。让孔板在室温下过夜干燥。通过将一株金黄色葡萄球菌（S.aureus）接种至添加了2%葡萄糖的MEM-alpha培养基中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养16至18小时，制备过夜培养物。
取50微升过夜培养物，转移至5毫升添加了2%葡萄糖的新鲜MEM-α培养基中进行稀释。随后在37摄氏度、200转/分钟条件下振荡培养，直至达到对数中期。使用MEM-α培养基将对数中期培养物的OD值调整至0.1。
将150微升标准化培养物转移至经PLL处理的96孔板的每个孔中。将该板置于37摄氏度的湿化培养箱中孵育18至20小时。吸除上清液以去除浮游细胞。
用 150 微升 HBSS 轻柔冲洗残留的生物膜，以去除未贴壁的细胞。重复至少两次，以彻底清除所有浮游细胞。向洗涤后的生物膜中逐滴加入 100 微升用 HBSS 稀释的 20% 正常人血清，并在 37°C 下孵育 30 分钟，以对生物膜进行调理（调理作用）。
吸除血清溶液，用150微升HBSS逐滴清洗生物膜。吸除HBSS，保留含有调理化生物膜的孔。向重悬于HBSS中的中性粒细胞加入鲁米诺，使其终浓度为5微摩尔。
该溶液可直接用于A组和C组。将中性粒细胞与鲁米诺混合后加入含有调理化生物膜的孔中。对于D组，在另一试管中用HBSS配制50微摩尔的鲁米诺溶液，不加任何中性粒细胞，并将其加入含有生物膜的孔中。取350微升中性粒细胞与鲁米诺的混合液，加入佛波酯（PMA），使其终浓度为500纳克/毫升。
对于B组，将此混合物中的中性粒细胞加入无生物膜的孔中，作为阳性对照。在4摄氏度下，以270 RCF离心板30秒。
确保酶标仪设置为 37 摄氏度，以 3 分钟为间隔，对发光信号进行持续 60 分钟的动力学检测。将培养板放入酶标仪中，连续测量中性粒细胞在 60 分钟内的活性氧（ROS）产生情况。使用表达 GFP 的荧光标记金黄色葡萄球菌菌株（如 USA300），以便于显微镜成像。
将中性粒细胞与100 µM BCD在37°C、5% CO₂条件下于摇床中孵育30分钟。确保样品在避光条件下孵育，并尽量减少光照暴露。为洗去多余的BCD，以270 ×g离心5分钟，弃去上清液。
用新鲜的HBSS重悬中性粒细胞。然后向BCD染色的中性粒细胞中加入终浓度为4 µM的碘化丙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1），以监测中性粒细胞和细菌的死亡情况。用HBSS洗涤生物膜，随后将150 µL中性粒细胞加入已在微载片中培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜中。
将微载玻片置于湿化孵育盒中孵育30分钟。细菌细胞的数量将依据18小时生物膜平板培养所获得的细胞计数结果确定。使用与荧光染料或蛋白质激发和发射波长相对应的荧光通道，对中性粒细胞与生物膜的相互作用进行成像。
细菌培养基使中性粒细胞在孵育30分钟后活力降至约60%。然而，哺乳动物细胞培养基对中性粒细胞的活力无影响，并且还能支持金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜的生长。以PMA处理的中性粒细胞作为对照，显示出活性氧（ROS）生成增加。
在无生物膜存在的情况下，经PMA处理的中性粒细胞表现出强烈的活性氧（ROS）产生。当存在金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜时，经PMA处理的中性粒细胞整体ROS产生减少；而在无PMA的情况下，中性粒细胞仅依赖其与生物膜的相互作用，进一步降低了ROS的产生。宽场荧光显微镜显示，许多中性粒细胞定位于生物膜表面，仅有少数位于金黄色葡萄球菌生物膜内部。
通过活/死染色检测发现，大多数与中性粒细胞相互作用的金黄色葡萄球菌细胞已死亡，仅有少数仍存活。利用碘化丙啶同源二聚体-1染色的生物膜显示，生物膜内存在部分死亡的金黄色葡萄球菌群体。在孵育30分钟后洗涤生物膜和中性粒细胞以去除未黏附的中性粒细胞，结果表明约33%的死亡中性粒细胞仍黏附在生物膜上。
此处列出的方案还可用于进一步研究中性粒细胞的其他功能，例如当其遇到生物膜时发生的吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网的形成。
概述
本方案研究人中性粒细胞与金黄色葡萄球菌生物膜之间的相互作用。通过显微镜观察中性粒细胞在生物膜内的定位，并定量分析其中性粒细胞的氧化爆发反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 免疫学
背景
- 中性粒细胞在抵御细菌感染的免疫反应中发挥着关键作用。
- 生物膜是细菌形成的复杂结构，能够逃避免疫反应。
- 了解中性粒细胞与生物膜之间的相互作用可为治疗策略提供依据。
- 中性粒细胞反应的变异性可能源于供体差异。
研究目的
- 阐明中性粒细胞如何与细菌生物膜相互作用并将其清除。
- 标准化实验方案以尽量减少变异性。
- 调整技术以研究其他可形成生物膜的微生物。
使用的方法
- 从96孔板中分离金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌落并形成生物膜。
- 利用人血清对生物膜进行调理作用，并评估中性粒细胞的相互作用。
- 使用鲁米诺（luminol）检测活性氧（ROS）的产生。
- 通过显微镜观察中性粒细胞的定位及细菌的存活状态。
主要结果
- 中性粒细胞在生物膜表面及内部表现出不同的定位分布。
- 与中性粒细胞相互作用的大多数金黄色葡萄球菌（S.aureus）细胞已死亡，表明中性粒细胞发挥了有效的杀伤作用。
- 活性氧（ROS）的产生受到生物膜存在及PMA处理的影响。
- 洗涤后，约33%的死亡中性粒细胞仍附着在生物膜上。
结论
- 该研究揭示了中性粒细胞对生物膜的反应机制。
- 标准化实验方案可提高未来研究的可重复性。
- 研究结果可能对开发针对生物膜相关感染的治疗方法具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
标准化的体外检测方法可用于定量分析人中性粒细胞与金黄色葡萄球菌生物膜的相互作用，填补了对生物膜形成病原体免疫逃逸机制认知的关键空白。这些实验方案能够可重复地测量中性粒细胞的反应，有助于提高在抗感染药物早期研发中对宿主-病原体相互作用机制进行预测的可信度，并降低相关风险。该方法通过提供针对临床相关生物膜模型的免疫细胞效能的可靠定量数据，从而增强研发项目组合的决策能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够探究中性粒细胞针对生物膜内细菌的杀伤机制。
- 通过量化免疫细胞在与疾病相关的生物膜系统中的功效，支持生物学风险评估。
- 有助于对抗生物膜治疗策略的功能性靶点验证。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化、可重复的检测方法，用于评估免疫系统与生物膜之间的相互作用。
- 提供定量的活性氧（ROS）和细胞活力读数，用于可靠的化合物或生物制剂筛选。
- 建立可最大限度减少供体差异和操作变异性的检测条件。
转化与临床前研究
- 通过使用人源性中性粒细胞和临床相关生物膜，将体外研究结果与体内感染模型相统一。
- 通过量化对生物膜挑战的免疫反应，支持转化生物标志物的开发。
- 实现针对生物膜相关感染的抗感染候选药物的风险调整式推进。
流程与工作流整合
这些检测方法位于从早期免疫-病原体相互作用研究到抗生物膜干预措施临床前验证的发现连续体中。
- 发现生物学：定量中性粒细胞功能反应，并阐明生物膜环境中的免疫逃逸机制。
- 筛选：提供可重复的定量结果，用于比较免疫调节化合物或生物制剂。
- 分析：可在不同实验条件下对活性氧（ROS）产生和细胞活力进行统计学比较。
- 转化研究：在进一步研究支持下，可将体外免疫反应数据与体内感染结果相联系。
- 企业级复用：该方案可适用于其他形成生物膜的病原体，支持广泛的研发生物学应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高针对免疫靶向抗感染策略的预测可信度。
- 操作价值：标准化免疫-生物膜检测方法，确保不同团队间实验的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供可靠且定量的免疫效能数据，支持决策阶段的推进或终止判断。
- 项目组合影响：支持对靶向生物膜相关感染的候选药物进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备中性粒细胞分离、生物膜培养和荧光显微镜技术方面的专业知识。
- 需要使用酶标仪进行活性氧定量分析，以及成像平台用于细胞定位研究。
- 要求跨团队标准化操作，以尽量减少供体差异和操作流程变异。
- 经适当优化后，可适用于其他微生物生物膜研究。
- 依赖于人中性粒细胞制备的质量和生物膜的一致性。
