Name: 标准化 体外 测定，以可视化和量化人中性粒细胞与 金黄色葡萄球菌 生物膜之间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解人中性粒细胞与金黄色葡萄球菌生物膜相互作用的标准化体外测定方法。该方案通过荧光显微镜和活性氧检测量化中性粒细胞的氧化爆发反应，为研究生物膜相关感染的治疗策略提供可重复的实验基础。

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本工作由国家过敏与传染病研究所（R01AI077628）资助DJW，以及美国心脏协会职业发展奖（19CDA34630005）资助ESG。我们感谢Paul Stoodley博士为我们提供了USA 300 LAC GFP菌株。此外，我们感谢俄亥俄州立大学校园显微镜与成像设施（CMIF）以及俄亥俄州立大学综合癌症中心（OSUCCC）显微镜共享资源（MSR）提供的资源支持。我们还感谢Stoodley实验室的Amelia Staats、Peter Burback和Lisa Coleman协助完成采血工作。

所有实验程序均经俄亥俄州立大学机构审查委员会（IRB）（2014H0154）批准。所有供血者均已签署知情同意书，同意采集外周血以分离原代人中性粒细胞。Staphylococcus aureus（USA300 LAC）31被用作实验的模式生物。由于可能接触血液传播病原体，实验过程中均佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. 准备 体外 生物膜
<ol>
	<li>使用划线接种法从冻存的 S. aureus 菌种中获得单个菌落31，接种于营养丰富的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂，见材料表）32,33。</li>
	<li>用 100 µL 浓度为 0.001% (v/v) 的聚-L-赖氨酸（PLL）溶于无菌 H2O 中包被 96 孔板的各个孔，室温孵育 30 分钟。在无菌条件下，使用真空辅助吸液装置吸除 PLL 溶液。室温下静置过夜使孔板干燥。 
	注意：除非另有说明，本实验方案中的所有吸液步骤均使用真空辅助吸液装置进行。</li>
	<li>将 S. aureus 单菌落接种至含 2% 葡萄糖的最低必需培养基 α（MEMα）中，制备过夜培养物，并于 37 °C、200 rpm 振荡培养 16–18 小时。</li>
	<li>取 50 µL 过夜培养物转移至 5 mL 新鲜的含 2% 葡萄糖的 MEMα 培养基中进行稀释，于 37 °C、200 rpm 振荡培养至对数中期，通常为光密度 600（OD600nm）在 0.5–0.8 之间。使用 MEMα 将对数中期培养物调整至 OD600nm 为 0.1。</li>
	<li>将 150 µL 调整后的菌液转移至经 PLL 处理的 96 孔板各孔中。在 37 °C 湿润环境中静置培养 18–20 小时。 
	注意：生物膜也可在其他装置中培养，例如 µ 通道载玻片（见材料表）。</li>
	<li>吸除上清液以去除浮游细胞。用 150 µL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）轻轻洗涤残留的生物量，以去除未附着的细胞。滴加 HBSS 时应逐滴加入，避免破坏生物膜。 
	注意：在吸除上清液和 HBSS 洗涤过程中，应保留足够液体（上清液或 HBSS）在含有生物膜的孔中，使生物膜仍处于浸没状态。这可防止在滴加 HBSS 洗涤时破坏生物膜结构。</li>
	<li>重复步骤 1.6 至少两次，以彻底去除所有浮游细胞。此时，生物膜已准备好用于后续立即进行的实验。 
	&#8203;注意：若生物膜不用于中性粒细胞实验，可用磷酸盐缓冲液（PBS）替代 HBSS。优先选择 HBSS 而非 PBS，因为 HBSS 含有葡萄糖等成分，可为中性粒细胞活化提供最佳条件34。</li>
</ol>
2. 生物膜生物量的定量分析
<ol>
	<li>通过将结晶紫（Crystal Violet, CV）溶解于20%（v/v）乙醇和80%（v/v）H2O中，配制0.1%（w/v）的CV储备液（参见材料表）。在加入H2O之前，确保CV已完全溶解于乙醇中。对溶液进行滤膜除菌。</li>
	<li>向洗涤后的生物膜中加入150 µL的0.1% CV溶液，在室温下孵育20分钟。至少使用三个空孔作为仅含培养基的对照。</li>
	<li>吸除生物膜中的0.1% CV溶液，并用200 µL的1× PBS洗涤染色后的生物膜。重复此步骤共三次，以彻底去除孔中残留的过量CV。</li>
	<li>加入150 µL用H2O稀释的33%（v/v）冰醋酸。在室温下，以50 rpm在摇床上孵育30分钟，使结合在生物量上的CV充分溶解。 
	警告：该步骤应在超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），因为冰醋酸具有腐蚀性。</li>
	<li>在此期间，设置酶标仪（参见材料表）以读取CV染色值。经冰醋酸处理后，在595 nm波长下读取酶标板。 
	&#8203;注意：用于测定CV吸光度的波长范围可在500–600 nm之间35。</li>
</ol>
3. 中性粒细胞分离
注意：中性粒细胞的分离采用先前发表的方法并稍作修改36。该分离方案首先进行密度梯度离心，随后进行3%右旋糖酐沉降。本节仅概述整体的中性粒细胞分离流程，重点介绍对已发表方案所做的修改。此外，下述方案仅为多种中性粒细胞分离方法之一，可根据需要替换使用。其他中性粒细胞分离方法包括使用细胞分离介质或磁珠抗体细胞分离技术37。
<ol>
	<li>从成年供体采血 通过 根据机构伦理审查委员会（IRB）规定的方案进行静脉穿刺。采血前，确保注射器中含有足量的无防腐剂肝素，使肝素的终浓度为20 U/mL。</li>
	<li>用无内毒素的0.9% NaCl将肝素抗凝血稀释至原体积的3/4（参见 材料表) 在 H2室温下</li>
	<li>每20 mL稀释后的血样，加入14 mL市售密度梯度介质（参见 材料表) 转移至新的50 mL锥形管中。将稀释后的血液样本小心地铺加在密度梯度介质上方。</li>
	<li>将分层的血液样本在400 x g 室温下离心40分钟。确保离心机设置为慢速刹车，以避免离心结束后扰动液体层。 
	注意：血液样本将分为五层，分别为含有生理盐水和血浆的混合层、单个核细胞层、密度梯度介质层、中性粒细胞层和红细胞层。</li>
	<li>使用血清学移液管吸除中性粒细胞和红细胞沉淀物上方的所有液层，随后用冷的无内毒素0.9% NaCl在H中轻轻重悬沉淀物2O. 对于每份20 mL血液样本所获得的沉淀物，将沉淀重悬至总体积20 mL，加入等体积的3%右旋糖酐（见 材料表将离心管直立放置于冰上孵育18-20分钟。 
	注意：确保使用无内毒素的0.9% NaCl配制3%葡聚糖溶液2O.</li>
	<li>将含有中性粒细胞和部分红细胞的上层液体20 mL转移至新的50 mL离心管中，于355 x g条件下离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。弃去上清液，留下红色沉淀。</li>
	<li>轻轻将沉淀重悬于10 mL冷的无菌H2O，持续30秒以裂解残留的红细胞。立即向混合物中加入10 mL冷的无内毒素0.9%生理盐水，以恢复等渗性。将溶液在233 x g 4 °C 下离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将含有95%-97%中性粒细胞的沉淀物重悬于每20 mL血液样本加入1 mL冷的HBSS中。</li>
	<li>将10 µL重悬的中性粒细胞与90 µL 0.4%台盼蓝排斥染料混合，使用血细胞计数板进行细胞计数（参见 材料表). 
	注意：由于台盼蓝排斥染料无法进入活细胞，非活细胞会被染成蓝色。本方案提供 &#62;99% 细胞活力37,38.</li>
	<li>加入额外的HBSS，使中性粒细胞的最终浓度为4 x 106 细胞/毫升 
	注意：对于以下情况 &#60;99% 细胞活力，终浓度为 4 x 106 细胞/mL 仍可实现；然而，含有 4 x 10 的溶液总体积6 细胞/mL 的获得量将减少。最终的中性粒细胞浓度可根据使用者的实验需求进行调整。中性粒细胞被重悬至 4 x 106 细胞/mL 作为以下所有实验的终浓度。为考虑供体间的差异性，强烈建议所有涉及中性粒细胞的实验至少使用三个不同供体的样本进行。</li>
</ol>
4. 中性粒细胞产生活性氧的检测
<ol>
	<li>向已洗涤的生物膜（步骤 1.6）中逐滴加入 100 µL 20% 正常人血清（用 HBSS 稀释），在 37 °C 静置条件下孵育 30 分钟，以对生物膜进行调理作用。</li>
	<li>吸除 20% 血清溶液，并用 150 µL HBSS 逐滴洗涤生物膜一次。吸除 HBSS，保留含有调理后生物膜的孔。 
	注意：为便于实验结果解读，建议至少设置四组：（A）中性粒细胞 + 生物膜，（B）中性粒细胞 + PMA（阳性对照，参见 材料表），（C）仅中性粒细胞，以及（D）仅生物膜。</li>
	<li>将鲁米诺（参见 材料表）加入重悬于 HBSS 中、浓度为 4 × 106 个细胞/mL 的中性粒细胞悬液中，使鲁米诺终浓度为 50 µM。该溶液可用于处理组（A）和（C）。将含鲁米诺的 4 × 105 个中性粒细胞加入含有调理后生物膜的孔中。</li>
	<li>另取一离心管，在 HBSS 中配制不含中性粒细胞的 50 µM 鲁米诺溶液，并将其加入含有生物膜的孔中（D 组）。</li>
	<li>取 350 µL 含鲁米诺的中性粒细胞悬液，加入佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA），使 PMA 终浓度为 500 ng/mL。对于 B 组，从此混合液中取 4 × 105 个中性粒细胞加入无生物膜的孔中。此组作为阳性对照。 
	注意：本步骤中 PMA 的浓度相对较高，以确保产生强烈的爆发反应，因为经 PMA 刺激的中性粒细胞作为阳性对照。根据实验需求，也可使用较低浓度的 PMA 激活中性粒细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 270 × g 离心 30 秒。</li>
	<li>确保酶标仪预热至 37 °C，并设置为发光检测模式，进行持续 60 分钟、每 3 分钟读数一次的动力学检测。将板放入酶标仪中，检测中性粒细胞在 60 分钟内的活性氧（ROS）产生情况。 
	&#8203;注意：本实验中，生物膜在用于发光检测的白色板中培养。PMA 是已知的氧化爆发反应激动剂39。在涉及 PMA 的实验操作中，应确保在最后一步加入 PMA，且含中性粒细胞的溶液保持低温，因为 PMA 会立即启动爆发反应。</li>
</ol>
5. 成像生物膜-中性粒细胞相互作用
<ol>
	<li>使用步骤 1.2–1.6 建立生物膜。为便于生物膜成像，建议采用表达绿色荧光蛋白（GFP）的荧光标记金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（如 USA300）40,41，以提高显微镜成像的便捷性。 
	注意：本实验中使用了6通道µ载玻片（见材料表），而非96孔板，以展示体外（in vitro）生物膜模型（步骤1）。</li>
	<li>将中性粒细胞以 4 × 106 个细胞/mL 的浓度与 100 µM 的蓝色 CMAC（7-氨基-4-氯甲基香豆素）染料（BCD，见材料表）在 37 °C、5% CO2 条件下于摇床上孵育 30 分钟。确保样品在避光条件下孵育，并在后续步骤中尽量减少光照暴露。</li>
	<li>为洗去多余的 BCD，将中性粒细胞在 270 × g 条件下离心 5 分钟，并吸除上清液。用新鲜的 HBSS 重悬中性粒细胞。此时，向 BCD 染色的中性粒细胞中加入终浓度为 4 µM 的碘化乙啶同型双聚体-1（ethidium homodimer-1，见材料表），以监测中性粒细胞和细菌的死亡情况。</li>
	<li>将 150 µL 中性粒细胞加入已生长于 µ载玻片中的 S. aureus 生物膜中，使中性粒细胞与细菌的比例为 1:30（中性粒细胞:细菌）。将 µ载玻片置于湿润培养盒中孵育 30 分钟。细菌细胞数量基于对 18 小时生物膜进行平板计数所得结果确定。</li>
	<li>使用与荧光染料/蛋白激发和发射波长相对应的荧光通道，对中性粒细胞与生物膜的相互作用进行成像。 
	注意：在本研究中，BCD 的激发/发射波长为 353/466 nm，碘化乙啶同型双聚体-1 为 528/617 nm，GFP 为 395/509 nm。应尽量减少样品对激光或光源的暴露，以防止样品发生光漂白。</li>
	<li>使用显微图像分析软件或程序（如 FIJI/ImageJ、COMSTAT2、BiofilmQ 和 BAIT 等）对图像进行分析42,43,44,45。 
	注意：使用染料时，需考虑所用染料的特异性。某些染料可同时标记原核和真核细胞，而另一些则仅对其中一类细胞有效。若中性粒细胞和生物膜分别使用可同时标记两类细胞的染料进行染色，则在合并中性粒细胞与生物膜前，必须彻底洗去残留染料，以避免交叉染色。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

人们已进行了大量尝试，以在体外培养出稳定且可重复的S. aureus生物膜，用于后续实验48,49,50。本文概述了一种标准化的实验方案，该方案利用了PLL的阳离子特性，并在培养基中添加葡萄糖，以促进体外稳定S. aureus生物膜的生长。PLL的加入有助于带负电荷的细菌细胞更好地附着于带正电荷的PLL包被表面。需要注意的是，当PLL浓度为10 µg/mL并孵育24小时时，对Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli和S. aureus具有抗菌活性51。尽管该浓度用于表面包被，但在包被后会吸除过量的PLL，因此在接种进行生物膜生长时，PLL的实际浓度低于10 µg/mL。
需要注意的是，PLL 仅在特定培养基（如含 2% 葡萄糖的 MEMα）中有效，在该条件下观察到 S. aureus 形成坚固且变异性最小的生物膜（图 2A）。若将 PLL 与其他类型的培养基联合使用，则需进一步优化其浓度，例如通过提高 PLL 浓度来包被孔板。此外，这些条件是针对单一种类 S. aureus 生物膜优化的。尽管慢性伤口中的生物膜通常为多菌种共存，但建立标准化的检测方法以研究单一种类生物膜及其与中性粒细胞及其他免疫细胞的相互作用，对于理解其在发病机制中的作用至关重要52。这些标准化方案可进一步优化，用于维持和研究多菌种生物膜及其与中性粒细胞的相互作用。
还观察到，富含营养的细菌培养基（如TSB）会导致中性粒细胞活力下降（图1）。因此，生长条件的 S. aureus 在用于哺乳动物细胞培养的MEMα培养基中对生物膜进行了优化。对于涉及中性粒细胞的研究，该培养基可维持中性粒细胞的存活率并促进其功能 S. aureus 增殖。尽管观察到培养基会影响中性粒细胞的活力，但同样重要的是，从人外周血中分离的中性粒细胞会经历凋亡 离体 20小时时约有70%的中性粒细胞发生凋亡53这需要进行适当处理，例如在实验准备过程中将中性粒细胞置于冰上保存，使用无内毒素试剂，并避免对含中性粒细胞的样本进行涡旋震荡以防止其活化。
中性粒细胞氧化爆发的评估通常用于确定中性粒细胞对病原体的杀伤作用14,54,55。这些研究通常使用浮游细菌进行，将中性粒细胞加入后，利用鲁米诺增强的化学发光法来定量检测中性粒细胞产生的超氧阴离子。本实验方案通过将浮游细菌替换为静态培养18小时的S. aureus生物膜进行了改进。因此，可直接将中性粒细胞加入生物膜中以评估其活化状态。另一方面，生物膜中的细菌会产生诸如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等酶类以清除活性氧（ROS）23,56。Staphylococcus epidermidis生物膜在应激条件下产生的过氧化氢酶高于其浮游状态57。PMA刺激的中性粒细胞在S. aureus生物膜环境中的总化学发光信号显著低于无生物膜条件下PMA刺激的中性粒细胞（图2）。这可能是由于这些解毒酶的活性所致。此外，S. aureus生物膜可产生多种称为杀白细胞素的孔道形成毒素，能够杀死中性粒细胞58。氧化爆发反应的减弱也可能与中性粒细胞在S. aureus生物膜存在下的存活率降低有关。尽管本研究使用鲁米诺检测细胞内外产生的总ROS，但如果研究目标是特异性分析细胞内或细胞外ROS的生成，则应考虑使用其他试剂，如CM-H2DCFDA（5-(和-6)-氯甲基-2'7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯）或异鲁米诺14,53,54。
可视化中性粒细胞与生物膜相互作用的能力 通过 显微镜技术可提供中性粒细胞与生物膜在共存条件下相互作用行为的信息。荧光染料和蛋白质的激发光谱与发射光谱反映了18 h时两者相互作用的瞬时状态 S. aureus 孵育30分钟后观察生物膜和中性粒细胞。为有效捕获染色细胞的信号，在制备显微镜样品时应尽量减少样品暴露于光源。成像过程中，通过在调整各通道的Z-stack高度和曝光时间等参数时降低光源强度，以避免样品发生快速光漂白。
这些简单的操作使得能够进行适当的显微镜成像，观察到仅有少数中性粒细胞定位于生物膜内（图 4A这可能是由于生物膜内部存在的空隙所致，因为18 h S. aureus 在含2%葡萄糖的MEMα培养基中生长的生物膜未均匀覆盖表面（图4B）。然而，其他研究使用富集培养基时显示出均匀的菌苔 S. aureus 生物膜生长及白细胞穿透&#160;生物膜30,58此外，还观察到中性粒细胞在与孵育30分钟后发生细胞死亡。 S. aureus 生物膜由于 S. aureus 生物膜产生的杀白细胞素可裂解中性粒细胞58 (图4A，D）。在将中性粒细胞与生物膜共孵育30分钟后，增加洗涤步骤以去除未黏附的中性粒细胞，与未洗涤组相比，可从系统中清除约15%的死亡中性粒细胞，未洗涤组在孵育30分钟后立即进行显微镜观察。图4D）。与中性粒细胞相互作用的 S. aureus 也观察到（图4C）。需要进一步的实验来评估是否 S. aureus 被中性粒细胞吞噬或附着在中性粒细胞的细胞表面54.&#160;成像中性粒细胞和生物膜是第一步&#160;评估中性粒细胞的多种下游功能，例如吞噬作用和中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETosis）54,59中性粒细胞对生物膜的影响还可通过图像分析工具（见步骤5.6所列）定量生物膜生物量、生物膜结构变化及生物膜活性等多种指标进行评估。最后，不同供体来源的中性粒细胞存在个体差异，因此建议涉及中性粒细胞的研究至少使用三个不同供体的样本。
总体而言，标准化的 体外 将多种检测方法结合以评估中性粒细胞与生物膜之间的相互作用。尽管这些检测方法利用 S. aureus所述方案可轻松调整以用于研究其他病原体。尽管存在多种 体内 用于研究宿主-病原体相互作用的模型可能成本高昂且耗费大量人力，尤其是在条件未优化的情况下。使用标准化的 体外 检测方法使研究者能够在转向下一步之前优化实验条件并验证观察结果 体内 最后，已采用多种动物感染模型来研究生物膜与中性粒细胞的相互作用 体内然而，必须考虑人类与动物模型之间的免疫学差异60,61,62,63这需要使用源自人类的中性粒细胞来研究这些复杂的宿主-病原体相互作用。

生物膜是由附着在表面的微生物群落或非附着性聚集体组成，其被包裹在胞外聚合物基质（EPS）中1,2。这些群落可保护内部微生物免受环境胁迫的影响，包括对抗菌剂和免疫系统的耐受性3。多种致病性微生物能够形成生物膜，且与慢性感染密切相关4。生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及微生物对表面的黏附、EPS的产生、细胞增殖、生物膜结构的构建以及细胞的脱离5。一旦细胞从生物膜中分散，它们可保持浮游状态，或迁移至新的基质表面并重新启动生物膜的形成过程6。
Staphylococcus aureus 是一种机会性病原体，其生物膜发育遵循一般模式，包括附着、增殖、成熟和扩散7。S. aureus 生物膜的附着过程主要由疏水相互作用、壁磷壁酸以及微生物表面黏附相关分子（MSCRAMMs）识别宿主基质分子所介导8,9。随着 S. aureus 开始增殖，会生成胞外多聚物（EPS），其主要成分为多糖、蛋白质、胞外DNA和磷壁酸5。在EPS组分合成的同时，还会产生多种胞外酶和小分子，这些物质有助于形成生物膜的三维结构，并促进生物膜的解离5。S. aureus 利用这种高度协调的生活方式，引发多种慢性感染，包括因留置医疗器械所导致的感染10。
耐甲氧西林 S. aureus 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是与留置医疗器械相关的感染的主要致病原因之一，此类器械包括中心静脉导管、导尿管、人工关节、起搏器、机械心脏瓣膜以及宫内节育器11在感染过程中，中性粒细胞是首先被募集到感染部位以对抗病原体的宿主免疫细胞 通过 多种策略12包括吞噬作用、脱颗粒、活性氧和活性氮物质（ROS/RNS）的产生，或释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）以清除病原体13.
中性粒细胞吞噬微生物后产生活性氧（ROS）是其关键的抗微生物反应之一14吞噬作用在微生物被血清中的调理素（特别是免疫球蛋白和补体成分）包被时会增强15经调理的微生物随后被中性粒细胞表面受体识别并吞噬，形成称为吞噬体的区室。15中性粒细胞在吞噬体中生成并释放活性氧（ROS） 通过 膜结合型NADPH氧化酶16该多组分酶复合物通过将电子传递给分子氧生成超氧阴离子16此外，中性粒细胞还可通过表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）生成活性氮物质（RNS）。17这些在吞噬体中产生的高浓度超氧阴离子和一氧化氮自由基具有广谱的抗菌活性。它们可与酶中的金属中心相互作用，并破坏病原体的核酸、蛋白质和细胞膜。18,19,20,21许多微生物采用生物膜生活方式，并利用多种策略逃避活性氧（ROS）的杀灭作用22,23因此，将生物膜与中性粒细胞结合以定量活性氧（ROS）的标准化检测方法有助于获得一致的结果。
虽然中性粒细胞活性氧（ROS）生成量的测定等实验能够提供相关信息&#160;关于中性粒细胞对生物膜反应的研究，能够可视化中性粒细胞在生物膜内的相互作用也是一种强有力的工具。用于显微镜观察的荧光染料通常需要优化条件，以获得可用于显微成像分析的高质量图像。然而，由于中性粒细胞在分离后容易发生细胞死亡，因此优化某些条件的灵活性受到限制。此外，在加入中性粒细胞之前，通常需要洗涤生物膜以去除浮游菌群。在洗涤过程中，若生物膜与表面结合不牢固，则可能导致部分生物量丢失，从而引起重复样本间生物膜的变异性。
目前，该领域内分析中性粒细胞与生物膜相互作用的主要方法包括显微镜检查、流式细胞术和菌落形成单位（CFU）计数24,25,26,27显微镜技术涉及使用染料，这些染料可直接染色中性粒细胞和生物膜，或靶向中性粒细胞对微生物的各种反应，如中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成、脱颗粒和细胞死亡。25,28. 这些反应中的一部分，例如中性粒细胞的细胞死亡和脱颗粒，也可进行分析 通过 流式细胞术，但要求中性粒细胞优先不与生物膜中大量微生物聚集体结合28,29流式细胞术还可定量一些生物膜参数，例如细胞活力27然而，这些过程需要破坏生物膜生物量，因此无法用于观察其他重要相互作用，例如中性粒细胞及其组分在生物膜内的空间分布27,29,30.
本方案重点在于改进传统方法，用于研究中性粒细胞与生物膜之间的相互作用，其中生物膜经过优化，以确保操作过程中变异程度最小。因此，本方案提供了标准化的生物膜培养与定量方法、从外周血中分离原代人中性粒细胞的方法、活性氧（ROS）产生量的测定方法，以及生物膜与中性粒细胞相互作用的可视化方法。 通过 显微镜技术。该方案可针对不同系统进行调整，以在考虑供体样本异质性的前提下研究生物膜与中性粒细胞之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，符合美国药典标准</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>无内毒素；用于中性粒细胞分离</td></tr><tr><td>150 mL 快流速过滤装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td>用于采血</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td>用于采血</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD</td><td></td><td>用于采血</td></tr><tr><td>创可贴</td><td></td><td></td><td>用于采血</td></tr><tr><td>BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD</td><td>DF0370-07-5</td><td>与 1.5% 琼脂混合制备胰蛋白胨大豆琼脂</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Bal Saupply</td><td>202C</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 蓝 CMCH</td><td>Invitrogen</td><td>C2111</td><td>蓝色 CMAC 染料（BCD）</td></tr><tr><td>透明平底 96 孔聚苯乙烯板</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>棉质纱布</td><td>Fisherbrand</td><td>13-761-52</td><td>用于采血</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Acros Organic</td><td>40583-0250</td><td></td></tr><tr><td>培养管</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-27</td><td>硼硅酸盐玻璃，13 x 100 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G-8270</td><td></td></tr><tr><td>来自 Leuconostoc spp. 的葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>31392-250G</td><td>用于中性粒细胞分离</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭同聚物-1</td><td>Invitrogen</td><td>L3224 B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>用于中性粒细胞分离（密度梯度介质）</td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液（HBSS）1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>不含钙、镁和酚红</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Bright Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Novaplus</td><td>NDC 63323-540-57</td><td>1000 USP 单位/mL，用于采血</td></tr><tr><td>IMARIS 9.8</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>显微镜图像分析软件</td></tr><tr><td>鲁米诺</td><td>Sigma</td><td>A8511-5G</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）Alpha 1x</td><td>Gibco</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>针头（23 G1）</td><td>BD</td><td>305145</td><td>用于采血</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>死亡中性粒细胞定量分析</td></tr><tr><td>正常人血清</td><td>Complement Technology</td><td>NHS</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 x 15 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-10</td><td>用于中性粒细胞分离</td></tr><tr><td>SoftMax Pro 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于数据采集的酶标仪软件</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>无菌冲洗用水，符合美国药典标准</td><td>Baxter</td><td>2F7114</td><td>无内毒素；用于中性粒细胞分离</td></tr><tr><td>Surflo 带翼输液套件</td><td>Terumo</td><td>SC*19BLK</td><td>19 G x 3/4&quot;，用于采血</td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>止血带</td><td></td><td></td><td>用于采血</td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>白色不透明 96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353296</td><td>经组织培养处理的平底板</td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>&amp;mu;-通道载玻片</td></tr></tbody></table>

标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 金黄色葡萄球菌 生物膜

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

中性粒细胞是免疫系统在微生物感染期间部署的第一道防线。 在体内的，中性粒细胞被募集至感染部位，通过吞噬作用、产生活性氧和活性氮物质（ROS、RNS）、NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网）以及脱颗粒等机制杀灭微生物并清除感染。中性粒细胞与浮游微生物之间的相互作用已被广泛研究。近年来，人们对生物膜所致感染的研究兴趣日益增加。生物膜具有与其浮游生长形式不同的特性，包括对中性粒细胞杀伤作用的耐受性。随着两者成功建立 体外 和 体内 生物膜模型，现在可以研究这些微生物群落与不同免疫细胞之间的相互作用。本文介绍的技术结合了传统的生物膜模型与成熟的中性粒细胞活性检测方法，专门用于研究中性粒细胞与生物膜之间的相互作用。采用宽场荧光显微镜观察中性粒细胞在生物膜中的定位。生物膜在静态条件下培养，随后加入来源于人外周血的中性粒细胞。样品在显微镜观察前使用适当的染料进行染色。此外，还定量检测中性粒细胞在存在生物膜时产生活性氧（ROS）的情况，ROS是中性粒细胞对抗病原体的多种反应之一。将免疫细胞引入该已建立的系统，有助于加深对宿主-病原体相互作用的理解，同时确保在标准化和优化的条件下准确测量这些过程。

用于培养细菌生物膜的培养基会影响中性粒细胞的存活。为减少培养基本身对中性粒细胞活力的影响，以便研究中性粒细胞与生物膜的相互作用，测试了不同培养基（图1）。例如，胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth）等细菌培养基会显著降低中性粒细胞的活力，使其在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟后仅有约60%的中性粒细胞存活。而MEMα等哺乳动物细胞培养基则不影响中性粒细胞的活力，并且能够支持S. aureus生物膜的生长。事实上，最低培养基还能促进其他细菌生物膜的旺盛生长46,47。
为了评估培养基对生物膜生长的影响以及在洗去浮游细胞后生物膜生物量定量中的变异性，进行18 h的实验 S. aureus 在96孔板中培养生物膜，部分孔经聚-L-赖氨酸处理，部分未处理。使用营养丰富的胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth, TSB）及最低必需培养基α（MEMα），并分别添加或不添加2%葡萄糖。经结晶紫（CV）染色检测生物膜生物量结果显示 S. aureus 在补充有2%葡萄糖的MEMα中培养的生物膜，在所有测试的培养基中形成了最坚固的生物膜（图2A此外，在经PLL预处理并含有MEMα + 2%葡萄糖的孔中培养的生物膜，其变异程度低于未经PLL处理、含有MEMα + 2%葡萄糖的孔中的生物膜。这些生物膜在定量分析中表现出更小的变异。 通过 CV测定法35 以及在精确处理生物膜以进行生物量定量后平板计数所得的CFU/mL。这些生物膜平均含有1 × 108 CFU/mL，通过在3个独立日期对生物膜进行平板培养证实（图 2B该数值可用于确定在生物膜中添加中性粒细胞进行中性粒细胞功能检测时所需的细胞数量。
为检测中性粒细胞在生物膜刺激下活性氧（ROS）的产生情况，将S. aureus生物膜在96孔板中静态培养18–20小时。随后对生物膜进行调理处理，并加入中性粒细胞。接着连续检测60分钟内的ROS产生水平（图3A）。通过计算动力学曲线下的面积，以量化中性粒细胞产生的总ROS量。以PMA等激动剂处理的中性粒细胞作为对照组，显示ROS产生增加。在无生物膜存在时，经PMA处理的中性粒细胞表现出强烈的ROS产生。而在存在S. aureus生物膜的情况下，经PMA处理的中性粒细胞整体ROS产生量下降。在无PMA的情况下，中性粒细胞仅依赖其与生物膜的相互作用，导致ROS产生量进一步减少（图3B）。
为了利用荧光显微镜观察中性粒细胞与生物膜的相互作用，实验采用了表达GFP的S. aureus菌株、Blue CMAC染料以及ethidium homodimer-1，后者分别用于标记活细胞的细胞质和死细胞的DNA。S. aureus生物膜在6 µ通道载玻片中培养18小时。将经Blue CMAC染料标记的中性粒细胞与ethidium homodimer-1一同加入已清洗的生物膜中，并在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，随后进行成像。宽场荧光显微镜结果显示，大量中性粒细胞定位于S. aureus生物膜表面，仅有少量位于生物膜内部（图4A）。中性粒细胞内S. aureus细胞之间的相互作用也清晰可见（图4C）。根据活/死染色结果，大多数与中性粒细胞相互作用的S. aureus细胞（青色）已死亡（品红色），仅有少数仍存活（黄色）（图4C）。作为对照，表达GFP的S. aureus生物膜仅用ethidium homodimer-1染色，结果显示生物膜内存在一定比例的死亡S. aureus细胞群体（图4B）。使用分析软件（见材料表）对与S. aureus生物膜孵育后呈ethidium homodimer-1阳性的非活性中性粒细胞进行定量。结果显示，约48%的中性粒细胞在与S. aureus生物膜孵育30分钟内即已死亡。在显微镜实验方案优化过程中，还评估了孵育30分钟后清洗生物膜和中性粒细胞以去除未黏附细胞的影响，结果表明仍有约33%的死亡中性粒细胞仍附着于生物膜上（图4D）。
<img alt="中性粒细胞存活率柱状图；比较 MEMα、TSB、SDS 处理；星号表示显著性差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：LIVE-DEAD 检测比较中性粒细胞在细菌和哺乳动物培养基中的存活情况。 分离中性粒细胞后，分别在 HBSS、MEMα、TSB 或 0.1% SDS 中孵育 30 分钟。使用 Calcein AM（活细胞）和乙啶同二聚体-1（死细胞）进行 LIVE-DEAD 染色。测定活中性粒细胞百分比，其中以 HBSS 孵育的中性粒细胞作为 100% 活细胞对照。结果为两次独立实验（每组设三个重复）的平均值，中性粒细胞来自两位不同供体。数据以均值 ± 标准差表示（*p &lt; 0.05，****p &lt; 0.0001；单因素方差分析）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="生物膜生物量OD595柱状图；CFU/ml生物学重复比较图；TSB与MEMα对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：不同条件下生物膜生物量的定量分析，以及在优化条件下培养的生物膜的细菌活力计数。（A）将金黄色葡萄球菌（S. aureus）接种于经或未经聚-L-赖氨酸（PLL）包被的96孔板中。生物膜在TSB、MEMα或添加2%葡萄糖的上述任一培养基中，于静置条件下培养18小时。采用结晶紫（CV）染色法对生物膜生物量进行染色，洗脱后的CV染料按1:10稀释后，使用酶标仪读取吸光度。结果为三次独立实验（每组设三个重复）的平均值，数据以均值±标准差（SD）表示。各组的标准差（SD）显示在底部，用以反映不同生物膜生长条件下的变异程度。（B）从优化培养基（MEMα + 2%葡萄糖）中生长的生物膜获取细菌CFU计数。18小时静置培养的生物膜经相同次数的洗涤后，进行10分钟超声处理以松解生物膜，并通过22G针头推注以破坏聚集体，随后进行涂布计数。结果为三个重复实验（每组设三个重复）的数据，以均值±SD表示（ns = 无显著差异；采用单因素方差分析）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="发光检测结果；发光强度随时间变化曲线图与柱状图；PMN 与 BF 的效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3中性粒细胞活性氧产生的定量分析 通过 化学发光检测 (A中性粒细胞（PMN）与经HBSS洗涤的 S. aureus 生物膜（BF）在有PMA（实心灰色三角形）或无PMA（空心灰色倒三角形）存在下，用于检测中性粒细胞活性氧（ROS）的产生。使用微孔板读数仪每3分钟检测一次鲁米诺信号，持续60分钟。无生物膜存在时，经PMA处理的中性粒细胞（实心黑色圆圈）作为阳性对照，仅中性粒细胞（空心黑色圆圈）和仅生物膜（空心灰色三角形）组作为阴性对照。数据来自两次独立实验的平均值，每项实验设三个重复，中性粒细胞来自两位不同供体。数据以均值±标准差表示。B) 从曲线下的面积（A) 用于量化中性粒细胞产生的总活性氧（ROS）。数据以均值 ± 标准差表示。（***p &lt; 0.0001。单因素方差分析（One-way ANOVA）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中的中性粒细胞分布及显示细胞死亡比较的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：可视化相互作用 S. aureus 使用宽场荧光显微镜观察生物膜与中性粒细胞。 蓝色CMAC染料标记的中性粒细胞（青色）在与18 h共孵育前，补充了碘化乙啶同二聚体-1（品红色；死亡细胞） S. aureus 生物膜（黄色）。使用宽场荧光显微镜对生物膜-中性粒细胞相互作用进行成像，并通过图像分析软件处理图像。实验使用三位不同供体的样本进行。代表性图像展示为（A3D 视图 S. aureus 含有活菌（青色）和死菌（洋红色；少数用白色箭头指示）的生物膜，（B三维视图 S. aureus 中性粒细胞缺失情况下，含有活菌的生物膜 S. aureus 表达GFP（黄色）或死亡 S. aureus 用碘化乙啶同型二聚体-1（品红色）染色，（C正交视图 S. aureus 以及中性粒细胞相互作用在xy、yz和xz平面上的展示，以及（D中性粒细胞在存在情况下的活力定量分析 S. aureus 孵育30分钟后，生物膜中的中性粒细胞立即（未洗涤）或经三轮HBSS洗涤以去除未黏附的中性粒细胞后（已洗涤）进行检测。中性粒细胞死亡率以均值±标准差表示（Student t检验）。比例尺表示 50 µm 在 (A）和（B）和 10 µm 在 (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本实验方案描述了中性粒细胞与生物膜相互作用的研究方法。 金黄色葡萄球菌 生物膜形成 体外 并与外周血来源的人中性粒细胞共孵育。通过显微镜检测中性粒细胞在生物膜内的定位，并定量其中性粒细胞的氧化爆发反应。

中性粒细胞是免疫系统在微生物感染期间部署的第一道防线。在体内，中性粒细胞被招募至感染部位……

这些实验方案旨在深入了解人类中性粒细胞如何与细菌生物膜相互作用并将其杀灭。目标是更全面地理解这一过程，并尽量减少不同实验之间的变异性，同时认识到不同供体来源的人类中性粒细胞本身存在个体差异所带来的固有问题。此处列出的技术已经过优化，可使研究人员在开展实验时实现最小的变异性，尤其适用于松散附着的生物膜研究。此外，这些方案也可经适当调整后用于研究其他能够形成生物膜的微生物。首先，采用划线接种法在营养丰富的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂）上培养金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），从冻存菌种中获得单菌落。随后，用无菌水稀释多聚赖氨酸（PLL），取100 µL加入96孔板的各个孔中，对单个孔进行包被，并在室温下孵育30分钟。使用真空辅助的吸液装置无菌吸除PLL溶液。让孔板在室温下过夜干燥。通过将一株金黄色葡萄球菌（S.aureus）接种至添加了2%葡萄糖的MEM-alpha培养基中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养16至18小时，制备过夜培养物。取50微升过夜培养物，转移至5毫升添加了2%葡萄糖的新鲜MEM-α培养基中进行稀释。随后在37摄氏度、200转/分钟条件下振荡培养，直至达到对数中期。使用MEM-α培养基将对数中期培养物的OD值调整至0.1。将150微升标准化培养物转移至经PLL处理的96孔板的每个孔中。将该板置于37摄氏度的湿化培养箱中孵育18至20小时。吸除上清液以去除浮游细胞。用 150 微升 HBSS 轻柔冲洗残留的生物膜，以去除未贴壁的细胞。重复至少两次，以彻底清除所有浮游细胞。向洗涤后的生物膜中逐滴加入 100 微升用 HBSS 稀释的 20% 正常人血清，并在 37°C 下孵育 30 分钟，以对生物膜进行调理（调理作用）。吸除血清溶液，用150微升HBSS逐滴清洗生物膜。吸除HBSS，保留含有调理化生物膜的孔。向重悬于HBSS中的中性粒细胞加入鲁米诺，使其终浓度为5微摩尔。该溶液可直接用于A组和C组。将中性粒细胞与鲁米诺混合后加入含有调理化生物膜的孔中。对于D组，在另一试管中用HBSS配制50微摩尔的鲁米诺溶液，不加任何中性粒细胞，并将其加入含有生物膜的孔中。取350微升中性粒细胞与鲁米诺的混合液，加入佛波酯（PMA），使其终浓度为500纳克/毫升。对于B组，将此混合物中的中性粒细胞加入无生物膜的孔中，作为阳性对照。在4摄氏度下，以270 RCF离心板30秒。确保酶标仪设置为 37 摄氏度，以 3 分钟为间隔，对发光信号进行持续 60 分钟的动力学检测。将培养板放入酶标仪中，连续测量中性粒细胞在 60 分钟内的活性氧（ROS）产生情况。使用表达 GFP 的荧光标记金黄色葡萄球菌菌株（如 USA300），以便于显微镜成像。将中性粒细胞与100 µM BCD在37°C、5% CO₂条件下于摇床中孵育30分钟。确保样品在避光条件下孵育，并尽量减少光照暴露。为洗去多余的BCD，以270 ×g离心5分钟，弃去上清液。用新鲜的HBSS重悬中性粒细胞。然后向BCD染色的中性粒细胞中加入终浓度为4 µM的碘化丙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1），以监测中性粒细胞和细菌的死亡情况。用HBSS洗涤生物膜，随后将150 µL中性粒细胞加入已在微载片中培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜中。将微载玻片置于湿化孵育盒中孵育30分钟。细菌细胞的数量将依据18小时生物膜平板培养所获得的细胞计数结果确定。使用与荧光染料或蛋白质激发和发射波长相对应的荧光通道，对中性粒细胞与生物膜的相互作用进行成像。细菌培养基使中性粒细胞在孵育30分钟后活力降至约60%。然而，哺乳动物细胞培养基对中性粒细胞的活力无影响，并且还能支持金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜的生长。以PMA处理的中性粒细胞作为对照，显示出活性氧（ROS）生成增加。在无生物膜存在的情况下，经PMA处理的中性粒细胞表现出强烈的活性氧（ROS）产生。当存在金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜时，经PMA处理的中性粒细胞整体ROS产生减少；而在无PMA的情况下，中性粒细胞仅依赖其与生物膜的相互作用，进一步降低了ROS的产生。宽场荧光显微镜显示，许多中性粒细胞定位于生物膜表面，仅有少数位于金黄色葡萄球菌生物膜内部。通过活/死染色检测发现，大多数与中性粒细胞相互作用的金黄色葡萄球菌细胞已死亡，仅有少数仍存活。利用碘化丙啶同源二聚体-1染色的生物膜显示，生物膜内存在部分死亡的金黄色葡萄球菌群体。在孵育30分钟后洗涤生物膜和中性粒细胞以去除未黏附的中性粒细胞，结果表明约33%的死亡中性粒细胞仍黏附在生物膜上。此处列出的方案还可用于进一步研究中性粒细胞的其他功能，例如当其遇到生物膜时发生的吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网的形成。

standardized-vitro-assays-to-visualize-quantify-interactions-between

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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