从人包皮中分离、培养和表征原代施旺细胞、角质形成细胞和成纤维细胞

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的 体外 相互作用。该协议描述了从人包皮中分离，培养和表征这些原代细胞。

皮肤含有多种细胞类型，包括角质形成细胞，成纤维细胞和神经施旺细胞。该协议允许分离这些细胞类型中的每一种用于体外实验。从单个供体中分离和建立单个原代细胞培养物可以进行稳健的比较和共培养实验，同时减轻遗传变异的影响。

通过该协议，对单个细胞及其相互作用的分析可以分析施旺细胞在皮肤稳态和病理生理学中的作用。这些不同的细胞群可用于研究施旺细胞，成纤维细胞或角质形成细胞，无论是在正常的皮肤生理学，伤口愈合还是皮肤病变状态下组合。Jagadeeshaprasad M G，我实验室的博士后学者将协助我演示该程序。

按照标准护理程序获得新生儿包皮后，将切除的包皮置于含有8至10毫升冰冷DMEM基础培养基培养基的微量离心管中，并立即将包皮运送到细胞培养实验室进行细胞分离。用20至25毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS冲洗包皮两次，含有抗生素和抗真菌剂。然后将洗过的皮肤浸泡在25至30毫升冰冷的DMEM基础培养基中，放入10厘米的组织培养皿中。

15分钟后，用手术刀将包皮切开，露出真皮和皮下脂肪组织。使用镊子，手术刀刀片和剪刀去除并丢弃皮下脂肪组织。然后将干净的包皮切成三到五个较小的块，并将皮块在无菌锥形管中的16至20毫升Dispace一个DMEM培养基中孵育。

在与Dispace孵育的前30分钟内，通过倒置间歇性地混合锥形管中的皮肤碎片。然后将锥形管置于4摄氏度下16至18小时。第二天取出表皮块，将它们放在干燥的无菌培养皿上，展开每块皮肤，使表皮外层接触到培养皿。

从组织边缘开始，使用两组镊子将表皮从真皮上剥离。将分离的表皮碎片加入10厘米培养皿中的5毫升HBS中，在室温下孵育10分钟。然后将HBS溶液收集在50毫升锥形管中，并在锥形管中加入5毫升胰蛋白酶中和缓冲液或T和B。

将管子放在一边。在培养皿中的表皮碎片中加入三毫升胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，用镊子轻轻搅拌表皮片段，直到胰蛋白酶角质形成细胞溶液变得浑浊。

接下来将胰蛋白酶角质形成细胞溶液加入HBS T和B管中。用胰蛋白酶EDTA溶液溶解未消化的表皮碎片后，向含有胰蛋白酶EDTA溶液的HBS T和B管中加入两毫升FBS，并在四摄氏度下将两者离心约870倍G五分钟。然后吸出上清液并将细胞沉淀重悬于三毫升角质形成细胞完全生长培养基中，然后用无菌的100微米过滤器过滤细胞悬浮液到无菌的50毫升锥形管中。

一旦细胞数量和细胞活力被量化，将培养板中的细胞接种到培养板中，以37摄氏度的5%二氧化碳置于培养箱中。两天后，吸出未粘附的细胞，并每隔一天刷新细胞培养基，直到角质形成细胞达到50%至80%汇合度，用于传代或下游实验。用聚-l-赖氨酸或PLL预涂覆T25烧瓶，使用五毫升DPBS，并将预涂好的烧瓶在37摄氏度下放置三小时。

随后用DPBS洗涤PLL涂层基体两次。用五毫升DMEM基底培养基洗涤分离的真皮碎片后，用剪刀将真皮切成小块。用五毫升胶原酶在37摄氏度下消化切碎的真皮，持续两个半小时，每30分钟使用移液器尖端轻轻滴定，直到真皮完全解离。

消化后，用70微米的细胞过滤器过滤细胞悬浮液，然后用五毫升完整的DMEM培养基稀释过滤的细胞悬浮液，以停止胶原酶的酶活性。接下来，在室温下以870倍G离心细胞悬浮液五分钟，并将细胞轮重悬于两毫升DMEM完全培养基中以分裂细胞。在如上所述重复浓缩过程后，吸出上清液以使用细胞沉淀分离施旺细胞或成纤维细胞。

为了分离Schwan细胞，将细胞沉淀重悬于五毫升新鲜DMEM完全培养基中，并量化细胞数量和活力，然后将五毫升重悬的细胞接种在预先编码的T25烧瓶中，密度为4.0倍10到每毫升三个细胞。将烧瓶在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。16小时后，通过显微镜以10倍放大倍率确认细胞粘附。

然后除去不粘附的细胞，并用五毫升DPBS洗涤烧瓶三次。接下来，将细胞与5毫升10微摩尔胞嘧啶阿拉伯糖苷在DMEM完全培养基中孵育。24小时后，吸出含有胞嘧啶阿拉伯糖苷的培养基，然后如前所述冲洗烧瓶。

用五毫升施万细胞重新填充培养瓶，完成培养基孵育48小时，同时每隔一天刷新培养基，直到施万细胞达到80%汇合度。为了分离成纤维细胞，将收集的沉淀重悬于五毫升成纤维细胞的完整培养基中。在非编码的T25培养瓶中培养细胞24小时，如施万细胞所示。

吸出不粘附的细胞并洗涤烧瓶后，将细胞与5毫升新鲜成纤维细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育48小时。将分离出的原代细胞置于各细胞培养基中，原代角质形成细胞在第7天达到85%汇合度，并表现出鹅卵石形状的特征性细胞形态。施旺细胞在第五天达到95%汇合，形状为双极或三极。

成纤维细胞培养物在第四天达到95%汇合，大多数细胞表现出纺锤形形态。免疫荧光染色证实了细胞培养物中细胞类型特异性蛋白的表达。角质形成细胞对K10和K14蛋白呈阳性。

角蛋白免疫荧光和DAPI核染色的合并图像表明细胞培养物的纯度为97.8%。同样，施旺细胞的S100和P75 NTR呈阳性，并且在培养物中的纯度为95.2%。成纤维细胞阳性表达vimentin，但不表达α平滑肌肌肌动蛋白，肌成纤维细胞标志物。

培养物的纯度约为97.2%，为了增强Shanse的证据，可以使用预涂的聚-l-赖氨酸皿。为了进一步减轻纤维污染，胞嘧啶阿拉伯糖苷和抗真菌剂在细胞加入短时间后加入。这是一种简单廉价的实验程序，用于从单个人体前皮建立三个原代细胞，如shwann细胞，角质形成细胞和成纤维细胞。

该协议非常适合涉及细胞细胞通讯或细胞类型之间串扰的体外实验。