用于解释霉菌异养植物组织中真菌定植和种子共生萌发的显微镜技术

该协议介绍了用于了解真菌异养植物中真菌定植的各种显微镜技术，从收集到详细制备样品，并包括基本步骤。这种技术可以应用于各种霉菌异养植物，甚至可以应用于除分枝异养以外的植物材料。该方法主要与结构植物学有关，也可为菌根相互作用、生理学、生殖生物学、进化和真菌异养植物生态学提供见解。

首先，通过探索植物基部周围的土壤来收集霉菌异养植物，注意不要损坏地下器官。此外，避免将植物从地面拉出，以防止将空中器官与地下器官断开。小心地，使用园艺抹子在空中结构周围挖掘，同时探索地下器官，如根、茎、根茎和储存器官，而不会损坏这些结构。

去除土壤颗粒以保护脆弱的结构，并在固定样品之前用自来水仔细清洗这些器官以冲洗掉剩余的土壤颗粒。与落叶相关的霉菌异养植物需要格外关注。因此，小心地收集通过菌丝连接到分解材料的脆弱器官，而不是将它们从连接的结构中拉出。

保护具有此类连接的结构并收集垃圾进行分析。对于透射电子显微镜分析，将一滴戊二醛二甲胂酸钠缓冲液中的 3 至 4 毫米厚的样品切成 1 至 2 毫米厚的小段。丢弃液滴外的切割边缘。

确保在收集植物后立即在收集地点进行固定过程。立即将切片转移到固定剂体积大于样品体积10倍的收集管中，因为它是添加剂固定剂。用于器官中浅表菌丝的表面分析，特别是在地下和与落叶接触的菌丝中。

在解剖显微镜下以7.5倍或以上的放大倍率观察新鲜或固定的材料。搜索由浅层菌丝和根状体引导的感兴趣区域。选择包含浅层根状体区域的样品，因为这些样品可以切片以可视化根和茎中皮质细胞内的柱状体和菌丝线圈。

如文本手稿中所述，在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中制备每毫升0.2毫克小麦胚芽凝集素荧光染料偶联物和1%钙荧光白色溶液。现在，用小麦胚芽凝集素荧光染料偶联物溶液适当覆盖玻璃载玻片上的切片30分钟，将其孵育。孵育后，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤切片，并将其作为封片剂在钙荧光溶液中孵育。

接下来，将盖玻片放在载玻片上，并使用指定的滤光片在共聚焦或荧光显微镜下观察。固定样品后，进行脱水并将其储存在70%乙醇中，使用锋利的新剃须刀片进行单向运动切割，暴露任何所需的表面以进行扫描电子显微镜分析。如有必要，使用体视显微镜选择样品，并在确定样品尺寸时考虑金属短截区域。

此外，使乙醇系列中的样品脱水。在每个浓度下保持小而精致的样品 30 分钟，将较大和更密集的样品保持 1 小时。接下来，使用薄纸折叠小信封以组织后续步骤的样品。

无需信封即可处理较大的样品。用铅笔标记信封并记录样品。小心地，用画笔将样品放入信封内。

现在，将这些样品保存在无水乙醇中。立即根据标准操作程序操作临界点干燥机进行临界点干燥。为此，将样品置于样品架中的无水乙醇中，并将其放置在临界点干燥器的压力室中。

中间流体在临界二氧化碳点溶解到过渡流体中，从而使样品干燥。由于大气湿度的重吸收会破坏样品，因此在临界点干燥后立即将其储存在干燥容器中。在将样品安装到金属短管上之前，请戴上手套以操纵短截杆。

将它们浸入丙酮中 5 分钟以消除任何脂肪并让它们干燥。在体视显微镜下，使用导电双面碳胶带将样品固定在短截上并定位它们。上面的位置是扫描电子显微镜图像的唯一可能视角。

要操作样品，请使用细尖镊子。被镊子接触的样品部分通常会损坏。因此，请小心并尝试触摸远离感兴趣区域的部件。

将样品保持在带有硅胶的密封培养皿中的存根。接下来，按照标准操作程序，在惰性气体的低压气氛中继续溅射涂层，在样品表面沉积一层金或铂。涂层厚度取决于样品的形貌，通常在 15 到 40 纳米之间。

最后，将包被的存根保持在密封的培养皿中，硅胶保持湿度。样品可以通过这种方式储存数周。使用扫描电子显微镜分析这些样品。

在扫描电子显微镜期间，电子束撞击真空样品，这种相互作用产生的信号发射被解释为图像。确保种子共生发芽中使用的溶液和材料是不无菌的。以避免污染。

首先在 20 摄氏度下高压灭菌 121 分钟。在层流气流罩中，通过将水果和种子浸入含有2%活性氯的次氯酸钠溶液中，对水果和种子进行表面消毒。纤细而脆弱的种子可以浸入1:1稀释的次氯酸钠溶液中。

消毒后，通过使用静电织物过滤种子来回收种子。在进行发芽测试之前，在高压灭菌的蒸馏水中清洗水果和种子三次以除去次氯酸盐溶液。如有必要，将它们储存在4摄氏度硅胶玻璃烧瓶内的滤纸信封中，并密封烧瓶并用保鲜膜密封，然后通过将最后一次洗涤中的一些水滴转移到马铃薯葡萄糖琼脂中来评估洗涤过程的有效性。

对于兰花种子的共生发芽，将种子孵育在1至2厘米的高压灭菌滤纸盘上，放置在含有燕麦琼脂培养基的培养皿中。现在，用含有来自所选分离真菌的菌丝体的培养基碎片接种培养皿的中心。用保鲜膜密封培养皿，并在黑暗中以约25摄氏度或室温孵育它们，具体取决于真菌的生长。

准备一些有种子且没有真菌接种的菜肴作为发芽测试的阴性对照。通过收集定量和定性数据并拍摄原球茎和幼苗，每周分析发芽结果。根状体通常很容易识别为深色的鞋带状结构。

徒手或其他获得厚度超过10微米的部分的方法可以更好地证明peloton，并提供更具代表性的真菌定植模式图像。手绘切片也适用于更高扩增率的菌丝分析。虽然，在更薄的部分中更好地实现细节。

木质部元件中的次生细胞壁可以通过甲苯胺获得的浅色轻松识别。同时，仅由初级细胞壁组成的韧皮部元素通过其更薄和更暗的细胞壁来识别。在甲基丙烯酸乙二醇酯树脂切片中可以看到自发荧光伪影。

这些伪影通常与荧光染料浓度有关，可以通过用缓冲液多次洗涤样品来避免。根的写意部分显示内部和外部菌丝。通过扫描电子显微镜可以看到相同的器官，其表面有大量的根状体和单个菌丝。

大多数兰花物种在被接种的真菌感染后的几周内或直到近一个多月才会发芽。扫描电子显微镜中的光可以应用于花、果实和种子，以研究生殖生物学或分枝异养植物。种子的共生发芽也可以在自养兰花中进行测试。