果蝇卵生过程中极化细胞内运输和基底膜蛋白分泌的共聚焦和超分辨率成像

该协议允许使用果蝇阵列作为模型系统来表征基底膜蛋白的细胞内运输和分泌。我们技术的主要优点是，它允许使用内源性标记蛋白和Airyscan超分辨率显微镜对基底膜蛋白的细胞内运输进行高分辨率成像。虽然该方案是为基底膜蛋白的细胞内运输成像而开发的，但它可以扩展到研究其他感兴趣的蛋白质和其他生物系统（包括细胞培养物和类器官）的运输。

首先，在解剖镜下解剖PBS中的果蝇卵巢后，加入一毫升固定液并将卵巢固定在坚果平台上15分钟。取出固定溶液并进行两次快速洗涤，每次用一毫升PBST。通过轻轻地反转微量离心管五到六次，然后在螺母平台摇臂上进行四次10分钟的长洗涤，每次使用一毫升PBST。

进行固定和洗涤后，除去PBST，然后加入一毫升封闭溶液，并将卵巢阻挡在螺母平台摇杆上至少一小时。接下来，取出封闭溶液并加入300微升一抗溶液，含有在封闭溶液中以适当浓度稀释的一抗。在4摄氏度的螺母平台摇杆上孵育过夜。

除去一抗溶液后，如前所述，进行两次快速洗涤和四次长洗涤，然后除去PBST并加入500微升含有荧光二抗的二抗溶液，这些二抗将检测所使用的一抗。在室温下将卵巢在螺母平台摇臂上的二抗溶液中孵育两小时，然后在PBST中进行两次快速洗涤和四次长洗涤，如先前在螺母平台摇杆上所示。最后一次洗涤后，使用P-1000移液管轻轻地在管中上下移液卵巢以分离卵室。

通过将卵管保持在直立位置5至10分钟，让卵室沉入底部。接下来，使用巴斯德移液器除去PBST，留下约50微升。之后，使用P-200移液器尽可能多地去除剩余的PBST，并加入两滴安装培养基，足以均匀地铺在盖玻片上。

为了便于将粘性安装介质从微量离心管转移到载玻片上，请切断 P-200 移液器吸头的末端。接下来，将安装介质中的所有卵室慢慢转移到载玻片上，确保不会产生气泡。在解剖显微镜下，使用新的P-200移液器尖端或镊子轻轻展开镶样介质和分离的卵室，以覆盖大约盖玻片大小的区域。

使用镊子，小心地将盖玻片以一定角度放在卵室上以避免产生气泡，并将载玻片在室温下存放在黑暗中的平坦表面上两天以进行聚合。一旦安装介质固化，载玻片就可以在4摄氏度的黑暗中储存几周以进行成像。为了可视化基底膜蛋白的细胞内定位，将物镜设置为63x并轻轻地在其晶状体上放置一滴浸润油，然后将载玻片放在物镜上，盖玻片朝向物镜以定位标本。

使用落射荧光显微镜的目镜定位感兴趣的区域，然后选择具有适当设置的配置，以便对荧光团进行成像，如手稿中所述。设置配置后，通过在采集模式下选择实时来对样品进行成像，并将变焦调整为2到4倍，以优化样品的扫描区域。对于每个单独的频道，请在频道下选择一个轨道，然后单击直播。

使用量程指示器工具调整主增益和激光功率，并遵循所有准则以避免稿件中所述的饱和像素，同时对每个通道重复相同的像素。在采集模式切换窗口中的图像尺寸下，单击 SR 以最大化探测器的功能并自动调整帧尺寸。在Airyscan模式下将平均值保持为"无"，因为通常没有必要，并且会减少扫描时间。

但是，在某些情况下，平均2倍可能会提高信噪比，然后单击Snap以获取图像。要获取 Z 轴堆栈，请单击"获取"选项卡下的"Z 堆栈"复选框。接下来，选择所需的通道来观察试样。

例如，DAPI通道并单击"实时"开始实时扫描，然后使用显微镜上的微调旋钮设置Z-stack的范围。然后，通过单击先设置和最后设置来设置 Z 堆栈的端点。为了获得最佳的3D重建，将Z堆栈的间隔设置为小于0.5微米以分配步长，然后单击"开始实验"以开始Z堆栈采集。

获得图像或 Z 堆栈后，单击"处理"，然后单击"方法"选项，然后选择"Airyscan 处理"。执行自动过滤器以启动，如果需要，通过更改超分辨率值来执行进一步的手动处理，以获得样品的最佳结果。确定最佳 SR 值后，单击"应用"以生成已处理的图像。

对于 Z 轴堆栈图像，通过单击"3D 处理"框，将处理为一个 Z 切片或整个 Z-堆栈。要在采集Z-stack后以3D形式可视化蛋白质运输，请通过单击预览窗口中的3D图标生成3D图像，该图标将显示在Airyscan处理图像的显示控制部分中。从不同的 3D 视图选项中，在查看囊泡结构时使用"表面"或"混合"视图。

要获得最高质量的图像，请选择"精确"设置，因为"最快"设置的精度会降低，并导致 3D 渲染效果不佳。生成图像后，通过缩放和旋转来操作 3D 图像，以聚焦在首选位置。获得视图后，在3D选项卡下，选择"显示的分辨率"，然后单击"创建图像"，这将以与查看图像相同的方向创建图像的快照，并且可以以各种文件格式保存和导出。

当采集参数优化时，共聚焦显微镜可用于可视化基底膜蛋白（如Viking-GFP）的细胞内定位和沉积。当正确执行采集和图像处理时，与共聚焦显微镜相比，超分辨率显微镜可提高图像分辨率。正如基底膜蛋白（如Viking）的细胞内运输中更清晰的图像所示。

正交投影允许使用共聚焦或超分辨率成像在单个图像中可视化包含基底膜蛋白的囊泡和隔室的整体分布。通过组装通过共聚焦或超分辨率成像拍摄的一堆光学Z切片进行3D重建，以评估细胞内基底膜蛋白的定位和分布。超分辨率成像可用于确定突变条件下基底膜蛋白的精确定位。

例如，在Crag敲低上皮细胞中，基底膜蛋白在顶端和基底积聚，表明它控制基底膜蛋白的极化分泌。共聚焦和超分辨率显微镜也可以用于共定位实验。例如，该图显示了维京-GFP和高尔基体标记GM-130的部分共定位，证实了维京人在分泌之前被分类到高尔基体。

为了使用超分辨率显微镜有效地对基底膜蛋白的运输进行成像，我们建议仔细安装卵巢，并在设置采集和卷积参数时特别注意。该方案经过优化，可可视化基底膜蛋白的细胞内运输和分泌。然而，可以很容易地对其进行修饰，以有效地对其他感兴趣的蛋白质的运输进行成像。