共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

本方案利用果蝇阵列作为模型系统，用于表征基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程。本技术的主要优势在于，可通过内源性标记蛋白结合Airyscan超分辨率显微镜，实现对基底膜蛋白细胞内运输的高分辨率成像。尽管本方案旨在对基底膜蛋白的细胞内运输进行成像，但其可拓展应用于其他目标蛋白以及其他生物系统（包括细胞培养和类器官）的运输研究。

首先，在解剖镜下用 PBS 解剖黑腹果蝇的卵巢，加入 1 毫升固定液，在摇床上固定 15 分钟。移除固定液，用 1 毫升 PBST 各进行两次快速洗涤。通过轻轻翻转微量离心管 5 至 6 次，然后在摇床上用 1 毫升 PBST 进行四次长时间洗涤，每次 10 分钟。

固定并洗涤后，移除 PBST，然后加入一毫升封闭液，在旋转摇床上于 4 摄氏度下封闭卵巢，时间不少于一小时。接着，移除封闭液，加入 300 微升含有一抗的溶液，该溶液使用封闭液将一抗稀释至适当浓度。在 4 摄氏度下于旋转摇床上过夜孵育。

除去一抗溶液后，如前所述进行两次快速洗涤和四次长时间洗涤，然后移除PBST，并加入500微升含有荧光标记二抗的二抗溶液，该二抗可识别所使用的一抗。将卵巢置于二抗溶液中，在室温下于旋转摇床（nutating platform rocker）上孵育两小时，随后如前所述在旋转摇床上用PBST进行两次快速洗涤和四次长时间洗涤。最后一次洗涤后，使用P-1000移液器在离心管中轻轻吹打卵巢上下液流，以分离卵室。

将离心管保持直立状态5到10分钟，使卵室沉降至管底。接着，用巴斯德移液管吸除PBST，保留约50微升。随后，用P-200移液器尽可能吸除剩余的PBST，并加入两滴封片剂，用量足以在盖玻片上均匀铺展。

为了便于将黏稠的封片剂从微量离心管转移至载玻片，可剪去P-200移液器吸头的尖端。接着，缓慢地将封片剂中的所有卵室转移至玻璃载玻片上，注意避免产生气泡。在解剖显微镜下，使用新的P-200移液器吸头或镊子轻轻铺开封片剂，并将卵室分散开，使其覆盖面积约为盖玻片大小。

用镊子小心地以一定角度将盖玻片盖在卵室上，避免产生气泡，并将载玻片置于室温、平坦、避光处保存两天，以使封片介质充分聚合。待封片介质完全固化后，可将载玻片在避光条件下于 4 摄氏度保存数周，用于后续成像。为观察基底膜蛋白的细胞内定位，将物镜调至 63 倍，在其镜头上轻轻滴加一滴浸油，然后将载玻片盖玻片朝向物镜放置于物镜上，以定位待观察样本。

使用落射荧光显微镜的目镜定位感兴趣区域，然后根据文献中所述，选择适合待成像荧光染料的配置。配置设定完成后，在采集模式下选择“实时”（Live），并将放大倍数调整为2至4倍，以优化样品的扫描区域。针对每个独立的通道，在“通道”（Channel）下选择一个轨道，然后点击“实时”（Live）。

使用范围指示器工具时，调整主增益和激光功率，并遵循手稿中所述的所有指南，避免出现饱和像素，同时对每个通道重复相同操作。在采集模式切换窗口中的图像尺寸下，单击SR以最大化探测器的性能，并自动调整帧尺寸。在Airyscan模式下，将平均值保持为“无”，因为通常不需要此设置，且可减少扫描时间。

然而，在某些情况下，进行 2 次平均化可改善信噪比，然后单击“Snap”以获取图像。要获取 Z 层叠图像，请在“Acquisition”选项卡下的“Z-Stack”复选框中打勾。接下来，选择所需的通道以观察样本。

例如，选择 DAPI 通道并点击“Live”以开始实时扫描，然后使用显微镜上的微调旋钮设置 Z 叠层的范围。随后，通过点击“Set First”和“Set Last”来设定 Z 叠层的起始点和终止点。为了获得最佳的三维重建效果，应将 Z 叠层的步进间隔设置为低于 0.5 微米，以确定步长，然后点击“Start Experiment”开始 Z 叠层图像采集。

获得图像或Z轴扫描图像后，单击“处理”（Processing），然后选择“方法”（Method）选项，并选择Airyscan处理。首先执行自动滤波，如有需要，可通过调整超分辨率值进行进一步的手动处理，以获得样本的最佳效果。确定最佳SR值后，单击“应用”（Apply）以生成处理后的图像。

对于Z轴层扫图像，可通过点击3D处理框，将其作为单个Z切片或整个Z轴层扫进行处理。在获取Z轴层扫图像后，若需以三维方式观察蛋白质转运情况，可点击预览窗口中Airyscan处理图像显示控制部分的3D图标，生成三维图像。在不同的3D视图选项中，观察囊泡结构时建议使用表面（Surface）或混合（Mixed）视图。

为了获得最高质量的图像，应选择“精确”设置，因为“快速”设置的准确性较低，会导致较差的3D渲染效果。图像生成后，可通过缩放和旋转操作来调整3D图像，以聚焦于理想区域。获得所需视角后，在“3D”选项卡下选择“显示分辨率”，然后点击“创建图像”，即可生成与当前视图方向一致的图像快照，并可将其以多种文件格式保存和导出。

共聚焦显微镜可用于观察基底膜蛋白（如Viking-GFP）的细胞内定位和沉积，前提是成像参数经过优化。当正确进行图像采集和处理时，超分辨率显微镜相比共聚焦显微镜可提高图像分辨率。这一点可通过基底膜蛋白（如Viking）在细胞内运输过程中获得的更清晰图像得以证明。

正交投影技术能够利用共聚焦或超分辨率成像，在单幅图像中可视化显示囊泡及含有基底膜蛋白的区室的整体分布情况。通过整合共聚焦或超分辨率成像所获取的光学Z轴连续切片，构建三维重建图像，用于评估细胞内基底膜蛋白的定位与分布。在突变条件下，可利用超分辨率成像确定基底膜蛋白的精确定位。

例如，在Crag基因敲低的上皮细胞中，基底膜蛋白在顶端和基底侧均有积累，表明Crag调控基底膜蛋白的极性分泌。共聚焦显微镜和超分辨率显微镜也可用于共定位实验。例如，本图显示了Viking-GFP与高尔基体标志物GM-130的部分共定位，证实Viking在分泌前被分选至高尔基体。

为了利用超分辨率显微镜高效成像基底膜蛋白的转运过程，我们建议仔细安装卵巢组织，并在设置图像采集和反卷积参数时格外注意。本方案已优化用于可视化基底膜蛋白的细胞内转运与分泌过程。然而，该方法也可轻松修改，以高效成像其他目标蛋白的转运过程。