Name: 果蝇卵生过程中极化细胞内运输和基底膜蛋白分泌的共聚焦和超分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习利用共聚焦和Airyscan超分辨率显微技术对果蝇卵巢上皮细胞进行基底膜蛋白的细胞内运输和分泌成像。该方法可精确观察蛋白质动态分布，适用于发育生物学和细胞生物学研究。

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作者感谢朱莉·默克尔对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R15GM137236（资助对象：O.D.）支持。共聚焦和超分辨率图像使用配备Airyscan 2的蔡司LSM 900显微镜获取，该设备由美国国家科学基金会（NSF）MRI项目资助（项目号：2018748）购置。

作者无任何利益冲突需要披露。

基底膜（BM）对胚胎发育、器官形态发生以及成体生理功能至关重要。此外，基底膜还作为信号传导平台，参与上皮细胞极性的建立与维持，并为组织提供结构支持2。然而，调控基底膜蛋白正确定位的机制仍不清楚。要更深入理解负责基底膜蛋白细胞内运输和极性分泌的生物学通路，就需要对这些通路的组分及其在基底膜加工过程中的作用进行细致分析。实现这一目标的一种方法是使用共聚焦显微镜和超分辨率成像技术。本文中，我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）卵巢的制备及染色或免疫染色方法，以便利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜高效地观察滤泡上皮（FE）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程。
利用蛋白质捕获技术及内源性标记的蛋白质在野生型和突变条件下观察基底膜蛋白质细胞内运输与分泌的优势 
本方案充分利用蛋白质捕获技术以及内源性标记的基底膜（BM）蛋白质（例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP），对野生型（对照）和突变条件下滋养层（FE）中 BM 蛋白质的定位与分布进行成像和评估。相较于使用针对 BM 蛋白质...

基底膜（BM）是一种薄层、分层的细胞黏附性细胞外基质（ECM），对上皮结构和形态发生至关重要1。它由约50种蛋白质组成，普遍存在于上皮细胞和内皮细胞下方，并包裹骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞以及脂肪细胞1,2,3。上皮细胞基底侧的基底膜三大主要成分是IV型胶原蛋白（Collagen IV）、Perlecan和层粘连蛋白（Laminins）。基底膜位于上皮细胞下方，在多种功能中发挥关键作用，包括组织分隔与屏障功能、生长支持以及细胞极性建立2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。作为信号传导平台，基底膜在发育过程中调控上皮细胞及组织的形态和分化3,13,14。此外，基底膜的异常调控和/或其完整性的破坏是多种病理状态的主要原因，包括肿瘤转移2,15,16。尽管基底膜在组织和器官形态发生过程中具有重要功能，但专门负责基底膜蛋白极性胞内运输和分泌的生物学通路组分仍知之甚少。
为了研究含有基底膜（BM）的囊泡在细胞内的运输过程以及上皮细胞对基底膜蛋白的分泌，Drosophila 卵巢的滤泡上皮（FE）是一个强大的模型系统（图1）。一个 Drosophila 卵巢包含16–20个细长的管状结构，称为卵管（图1A、B）17,18,19。每个卵管可被视为一条卵子装配线，其中卵室（每个卵室发育为一个卵子）按年龄从前向后依次排列，并逐渐向后移动，直至成熟卵子经输卵管排出。每个卵室均由滤泡上皮（FE）包裹，FE是由单层体细胞滤泡细胞（FCs）构成的上皮层，包围着中央的生殖系细胞（GCs）。FE具有高度极性，表现出明显的顶-基底极性，其顶面朝向生殖系，而基底膜蛋白则从基底侧分泌18,19。滤泡细胞（FCs）主动分泌基底膜的所有主要组分，包括IV型胶原（Collagen IV）、Perlecan 和层粘连蛋白（Laminins）20,21。在滤泡细胞等上皮细胞中，基底膜组分在细胞内合成，并需要一种特化的极性分泌途径，以实现其在细胞外的正确定位沉积。例如，尽管已有大量研究聚焦于基底膜中最丰富的组分——IV型胶原（Collagen IV，简称 Coll IV）的合成与沉积，但其细胞内极性运输和分泌的具体机制仍不明确。Coll IV 在内质网（ER）中翻译合成，同时在此处由三条多肽链（两条α1链和一条α2链）组装成三股螺旋结构22。Coll IV 的正确折叠和功能依赖于内质网中的分子伴侣和酶，包括赖氨酰羟化酶和脯氨酰羟化酶，如 Plod 和 PH4αEFB20,22,23,24,25,26。这些翻译后修饰酶调控 Coll IV 在内质网中的分选过程，任一酶的缺失均会导致 Coll IV 滞留在基底侧的内质网中20,23,24,25,26。随后，新合成的 Coll IV 通过 COPII 包被囊泡从内质网转运至高尔基体。货物受体 Tango1 有助于将胶原蛋白包装成足够大的、靶向高尔基体的囊泡，以容纳大型多聚体蛋白20,27。一旦 Coll IV 被包装进细胞内的胞吐囊泡，它便特异性地从上皮细胞的基底侧分泌出去。为了引导基底膜在基底侧的沉积，上皮细胞还需要另一组专门负责极性分泌基底膜蛋白的因子。利用 Drosophila 卵巢的滤泡上皮系统，研究人员已鉴定出这一新型细胞过程中的若干关键组分，包括核苷酸交换因子（GEFs）Crag 和 Stratum、GTP 酶 Rab8 和 Rab10、磷脂酰肌醇 PI(4,5)P2 的水平，以及驱动蛋白 Kinesin 1 和 Kinesin 320,28,29,30,31。这些组分对于确保基底膜蛋白的极性分布至关重要。
为了监测基底膜蛋白在卵泡上皮（FE）中的细胞内定位，可以使用内源性标记的基底膜蛋白（蛋白捕获系），例如Viking-GFP（Vkg-GFP或α2 Coll IV-GFP）和Perlecan-GFP（Pcan-GFP）32,33。这些蛋白捕获品系已被证明能够准确反映基底膜蛋白的内源性分布，并可更灵敏地检测囊泡运输过程28,30。最初正是利用Vkg-GFP和Pcan-GFP的蛋白捕获品系，鉴定出参与卵泡上皮中基底膜极性沉积的相关组分20,28,29,30。蛋白捕获品系可用于不同的遗传背景中，包括突变体和Gal4品系34。此外，蛋白捕获品系还可与荧光染料和/或荧光免疫染色联合使用，从而在比较野生型与突变体条件时，精确表征基底膜蛋白的定位情况35。
为了准确且高效地评估含BM蛋白囊泡的分布与定位，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和超分辨率成像技术相较于其他成像方法具有显著优势。这些方法兼具高分辨率成像与操作相对简便的特点。CLSM是一种显微技术，通过使用振镜以光栅扫描方式用激光照射样品，从而提高光学分辨率。针孔光阑是共聚焦显微镜的核心组件。通过阻挡来自焦平面上方或下方的离焦信号，针孔光阑可在z轴方向实现极佳的分辨率36。这也使得获取一系列沿z轴方向的图像（称为z层叠，z-stack）成为可能，每幅图像对应一个光学切片。借助成像软件进行三维重建，z层叠可进一步生成样品的三维图像。via 相比之下，传统的落射荧光（宽场）显微镜允许离焦光线参与成像，从而降低图像的分辨率和对比度36,37。因此，在研究蛋白质定位或共定位时，落射荧光显微镜的适用性较低。
尽管共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）适用于多种应用，包括成像和表征基底膜蛋白的细胞内转运过程，但在对低于光的阿贝衍射极限（200–250 nm）的样本进行成像时仍存在局限性。在对这类样本成像时，共聚焦显微镜特别是使用油镜时可实现较高的分辨率。然而，超分辨率技术能够突破共聚焦显微镜的分辨率极限。目前有多种实现超分辨率显微成像的方法，每种方法具有特定的分辨率极限，并适用于不同的分析需求。这些方法包括光激活定位显微镜（PALM）或随机光学重建显微镜（STORM）、受激发射损耗显微镜（STED）、结构照明显微镜（SIM）以及艾里斑（Airyscan，超分辨率）显微镜38,39,40,41,42,43,44,45,46。尽管Airyscan的分辨率低于PALM/STORM、STED和SIM，但仍可达到约120 nm的分辨率（约为CLSM分辨率的两倍）。此外，研究表明，在对较厚样本或信噪比较低的样本进行成像时，这种超分辨率显微技术相较于SIM及其他超分辨率技术具有优势47,48。
Airyscan 是一种相对较新的超分辨率共聚焦显微技术46与传统的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）不同，后者利用针孔和单点探测器来消除离焦光线，这种超分辨率成像方法采用了一个32通道的砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管面阵探测器，可在每个扫描位置收集全部光线。45每个32个探测器均作为一个小型针孔，将针孔尺寸从传统的1.0艾里单位（A.U.）减小至增强的0.2 A.U.，从而在保持1.25 A.U.直径效率的同时，实现更高的分辨率和信噪比45此外，Airyscan 所采用的线性去卷积可使分辨率提高多达2倍45因此，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），尤其是超分辨率显微镜，是&#160;非常适合研究基底膜蛋白以及调控基底膜蛋白沉积的蛋白质，因其能够提供高分辨率图像，用于定位和共定位分析，从而揭示调控这些过程的空间、时间和分子事件的新见解。
一种可用于定位实验的共聚焦显微镜替代方法是图像去卷积。由于宽场显微镜允许离焦光线到达探测器，因此可应用数学和计算去卷积算法，去除或重新分配宽场显微镜所获图像中的离焦光线，从而提高图像的分辨率和对比度49。去卷积算法也可应用于共聚焦图像，以进一步提升分辨率和对比度，所得最终图像几乎可与超分辨率显微镜相媲美50。Airyscan 技术结合了基于维纳滤波器的去卷积与 Sheppard 的像素重分配方法，显著提高了空间分辨率和信噪比。与共聚焦显微镜相比，采用该超分辨率显微技术可在三个空间维度上实现约 2 倍的分辨率提升（x 和 y 方向为 120 nm，z 方向为 350 nm）45,51。
本文提供了详细的优化方案，用于通过FE对细胞内BM蛋白的运输和沉积进行染色、采集和可视化 黑腹果蝇 以卵巢为模型系统，结合共聚焦显微镜和超分辨率显微镜技术。 果蝇 表达内源性标记基底膜蛋白的品系，例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP，是可视化基底膜蛋白转运与分泌的高效且精确的工具。此外，这些品系可轻松应用于不同的遗传背景，包括突变体和 Gal4/UAS 线条34尽管建议使用内源性标记的基底膜蛋白，但针对特定基底膜蛋白的抗体也可与所述方案兼容。这些方案对于希望利用共聚焦和超分辨率成像技术在完整上皮组织中研究基底膜蛋白的细胞内运输和分泌过程的科研人员尤为有用。此外，该方法能够将上皮组织分析与广泛可用的 果蝇 遗传学使这一方法尤为强大。最后，这些方案可轻松地被调整用于研究其他目标蛋白的囊泡运输与分选。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>F-肌动蛋白染色（66&amp;micro;M 的 1/500）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>F-肌动蛋白染色（66&amp;micro;M 的 1/100）</td></tr><tr><td>Anti-GM130 抗体</td><td>abcam</td><td>ab30637</td><td>用于高尔基体染色（共定位）；使用浓度为 7&amp;micro;g/μL</td></tr><tr><td>Aqua-Polymount</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1860620</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>酵母（活性干酵母）</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>用于喂养果蝇以增大卵巢便于解剖</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（30% 溶液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td>用于封闭液</td></tr><tr><td>凹孔载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7156101</td><td>用于解剖（可用玻璃凹面载玻片替代）</td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Fisher scientific</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养箱</td><td>Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：Perlecan-GFP &lt;em&gt;Drosophila &lt;/em&gt;品系（ZCL1700）</td><td></td><td></td><td>Morin 等，2001</td></tr><tr><td>果蝇品系：UAS-&lt;em&gt;Crag &lt;/em&gt;RNAi 品系（TRIP 品系 HMS00241）</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>33594</td><td>靶向 Crag 的 RNA 干扰</td></tr><tr><td>果蝇品系：Viking-GFP Drosophila 品系（CC00791）</td><td></td><td></td><td>Buszczak 等，2007</td></tr><tr><td>果蝇品系：Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne 等，2017。在滤泡上皮中驱动 Crag RNAi 的表达</td></tr><tr><td>镊子（Dumont 5 型）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>玻璃凹面载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7187804</td><td>用于解剖（可用凹孔载玻片替代）</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>二抗（用于 GM130 抗体）（5 &amp;micro;g/mL）</td></tr><tr><td>Hoechst（Hoechst 33342）</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>DNA 染色（1 μg/mL）</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>精密擦拭纸</td></tr><tr><td>Leica 荧光体视显微镜&amp;nbsp; M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>用于卵巢成像</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Corning</td><td>294875X25</td><td>显微镜载玻片</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Corning Life Sciences</td><td>6720</td><td>用于卵巢固定和染色</td></tr><tr><td>Nutri-Fly BF</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Fisher Scientific: 15713</td><td>用于配制 4% PFA</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂（PBS Tablets）</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2944100</td><td>用于配制 PBS 溶液</td></tr><tr><td>ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>方形盖玻片</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>用于显微镜载玻片的盖玻片</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>用于 PBST 溶液</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900 配备 Airyscan 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦与超分辨率显微镜</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 305 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>Zeiss Zen 软件 3.3 版（蓝色版）</td><td>Zeiss</td><td></td><td>图像采集与处理</td></tr></tbody></table>

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

基底膜（BM）是一种位于上皮细胞基底侧的特化细胞外基质结构，在上皮组织形态的建立与维持以及器官形态发生过程中起着关键作用。此外，基底膜对于组织建模至关重要，它不仅作为信号传导平台，还能提供外部作用力以塑造组织和器官。尽管基底膜在正常发育和病理条件下具有多种重要功能，但调控含基底膜蛋白囊泡的细胞内运输的生物学通路，以及基底分泌如何导致基底膜蛋白的极性沉积，目前仍知之甚少。Drosophila 卵巢的滤泡上皮是研究基底膜蛋白基底侧沉积的优良模型系统，因为它能够合成并分泌基底膜的所有主要组分。通过对固定组织进行共聚焦和超分辨率成像，并结合图像处理技术，可以鉴定和表征特异性参与基底膜蛋白细胞内运输与沉积的细胞因子。本文提供了一套详细的实验方案，用于在Drosophila 卵巢滤泡上皮中利用内源性标记蛋白对含基底膜的囊泡及已沉积的基底膜进行染色与成像。该方案适用于回答定性和定量问题，并专为高通量筛选而设计，可快速高效地鉴定在上皮组织发育过程中参与囊泡极性细胞内运输与分泌的相关因子。

本文所述方法可用于高效、准确地成像和表征极化上皮细胞（如卵泡上皮细胞）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程 果蝇 卵巢。接下来，我们提供使用所述方法获得的预期结果，以及相关建议和可能遇到的问题。为此，我们使用内源性标记的Vkg蛋白Vkg-GFP，果蝇 Col IV）时使用。然而，使用其他内源性标记的基底膜蛋白（如 Pcan-GFP）也可获得相同的结果。
设置最佳采集参数（图 2） 
为准确表征上皮细胞中骨形态发生蛋白（如 Vkg 和 Pcan）的细胞内转运与分泌过程，必须按照所提供的方法正确设置共聚焦显微镜的采集参数。
利用共聚焦显微镜，可在Vkg-GFP被分泌并沉积于上皮基底膜（FE）之前，检测其在细胞内的定位（图2A）。已有研究表明，IV型胶原（Coll IV）在内质网（ER）中翻译后，会被转运至高...

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。

基底膜（BM）——一种位于上皮细胞基底部的特化细胞外基质层——对于组织结构的建立至关重要……

本方案利用果蝇阵列作为模型系统，用于表征基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程。本技术的主要优势在于，可通过内源性标记蛋白结合Airyscan超分辨率显微镜，实现对基底膜蛋白细胞内运输的高分辨率成像。尽管本方案旨在对基底膜蛋白的细胞内运输进行成像，但其可拓展应用于其他目标蛋白以及其他生物系统（包括细胞培养和类器官）的运输研究。首先，在解剖镜下用 PBS 解剖黑腹果蝇的卵巢，加入 1 毫升固定液，在摇床上固定 15 分钟。移除固定液，用 1 毫升 PBST 各进行两次快速洗涤。通过轻轻翻转微量离心管 5 至 6 次，然后在摇床上用 1 毫升 PBST 进行四次长时间洗涤，每次 10 分钟。固定并洗涤后，移除 PBST，然后加入一毫升封闭液，在旋转摇床上于 4 摄氏度下封闭卵巢，时间不少于一小时。接着，移除封闭液，加入 300 微升含有一抗的溶液，该溶液使用封闭液将一抗稀释至适当浓度。在 4 摄氏度下于旋转摇床上过夜孵育。除去一抗溶液后，如前所述进行两次快速洗涤和四次长时间洗涤，然后移除PBST，并加入500微升含有荧光标记二抗的二抗溶液，该二抗可识别所使用的一抗。将卵巢置于二抗溶液中，在室温下于旋转摇床（nutating platform rocker）上孵育两小时，随后如前所述在旋转摇床上用PBST进行两次快速洗涤和四次长时间洗涤。最后一次洗涤后，使用P-1000移液器在离心管中轻轻吹打卵巢上下液流，以分离卵室。将离心管保持直立状态5到10分钟，使卵室沉降至管底。接着，用巴斯德移液管吸除PBST，保留约50微升。随后，用P-200移液器尽可能吸除剩余的PBST，并加入两滴封片剂，用量足以在盖玻片上均匀铺展。为了便于将黏稠的封片剂从微量离心管转移至载玻片，可剪去P-200移液器吸头的尖端。接着，缓慢地将封片剂中的所有卵室转移至玻璃载玻片上，注意避免产生气泡。在解剖显微镜下，使用新的P-200移液器吸头或镊子轻轻铺开封片剂，并将卵室分散开，使其覆盖面积约为盖玻片大小。用镊子小心地以一定角度将盖玻片盖在卵室上，避免产生气泡，并将载玻片置于室温、平坦、避光处保存两天，以使封片介质充分聚合。待封片介质完全固化后，可将载玻片在避光条件下于 4 摄氏度保存数周，用于后续成像。为观察基底膜蛋白的细胞内定位，将物镜调至 63 倍，在其镜头上轻轻滴加一滴浸油，然后将载玻片盖玻片朝向物镜放置于物镜上，以定位待观察样本。使用落射荧光显微镜的目镜定位感兴趣区域，然后根据文献中所述，选择适合待成像荧光染料的配置。配置设定完成后，在采集模式下选择“实时”（Live），并将放大倍数调整为2至4倍，以优化样品的扫描区域。针对每个独立的通道，在“通道”（Channel）下选择一个轨道，然后点击“实时”（Live）。使用范围指示器工具时，调整主增益和激光功率，并遵循手稿中所述的所有指南，避免出现饱和像素，同时对每个通道重复相同操作。在采集模式切换窗口中的图像尺寸下，单击SR以最大化探测器的性能，并自动调整帧尺寸。在Airyscan模式下，将平均值保持为“无”，因为通常不需要此设置，且可减少扫描时间。然而，在某些情况下，进行 2 次平均化可改善信噪比，然后单击“Snap”以获取图像。要获取 Z 层叠图像，请在“Acquisition”选项卡下的“Z-Stack”复选框中打勾。接下来，选择所需的通道以观察样本。例如，选择 DAPI 通道并点击“Live”以开始实时扫描，然后使用显微镜上的微调旋钮设置 Z 叠层的范围。随后，通过点击“Set First”和“Set Last”来设定 Z 叠层的起始点和终止点。为了获得最佳的三维重建效果，应将 Z 叠层的步进间隔设置为低于 0.5 微米，以确定步长，然后点击“Start Experiment”开始 Z 叠层图像采集。获得图像或Z轴扫描图像后，单击“处理”（Processing），然后选择“方法”（Method）选项，并选择Airyscan处理。首先执行自动滤波，如有需要，可通过调整超分辨率值进行进一步的手动处理，以获得样本的最佳效果。确定最佳SR值后，单击“应用”（Apply）以生成处理后的图像。对于Z轴层扫图像，可通过点击3D处理框，将其作为单个Z切片或整个Z轴层扫进行处理。在获取Z轴层扫图像后，若需以三维方式观察蛋白质转运情况，可点击预览窗口中Airyscan处理图像显示控制部分的3D图标，生成三维图像。在不同的3D视图选项中，观察囊泡结构时建议使用表面（Surface）或混合（Mixed）视图。为了获得最高质量的图像，应选择“精确”设置，因为“快速”设置的准确性较低，会导致较差的3D渲染效果。图像生成后，可通过缩放和旋转操作来调整3D图像，以聚焦于理想区域。获得所需视角后，在“3D”选项卡下选择“显示分辨率”，然后点击“创建图像”，即可生成与当前视图方向一致的图像快照，并可将其以多种文件格式保存和导出。共聚焦显微镜可用于观察基底膜蛋白（如Viking-GFP）的细胞内定位和沉积，前提是成像参数经过优化。当正确进行图像采集和处理时，超分辨率显微镜相比共聚焦显微镜可提高图像分辨率。这一点可通过基底膜蛋白（如Viking）在细胞内运输过程中获得的更清晰图像得以证明。正交投影技术能够利用共聚焦或超分辨率成像，在单幅图像中可视化显示囊泡及含有基底膜蛋白的区室的整体分布情况。通过整合共聚焦或超分辨率成像所获取的光学Z轴连续切片，构建三维重建图像，用于评估细胞内基底膜蛋白的定位与分布。在突变条件下，可利用超分辨率成像确定基底膜蛋白的精确定位。例如，在Crag基因敲低的上皮细胞中，基底膜蛋白在顶端和基底侧均有积累，表明Crag调控基底膜蛋白的极性分泌。共聚焦显微镜和超分辨率显微镜也可用于共定位实验。例如，本图显示了Viking-GFP与高尔基体标志物GM-130的部分共定位，证实Viking在分泌前被分选至高尔基体。为了利用超分辨率显微镜高效成像基底膜蛋白的转运过程，我们建议仔细安装卵巢组织，并在设置图像采集和反卷积参数时格外注意。本方案已优化用于可视化基底膜蛋白的细胞内转运与分泌过程。然而，该方法也可轻松修改，以高效成像其他目标蛋白的转运过程。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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