一种用于1型糖尿病、乳糜泻和新冠肺炎的高通量多重筛查方法

新型6重ECL检测法是首个经过验证并已应用于临床试验中用于普通人群筛查的多重检测方法。该方法可同时联合六种自身抗体检测，适用于在大范围人群中筛查1型糖尿病、乳糜泻和COVID-19。与当前的标准自身抗体检测方法相比，该技术能够更高效地同时筛查多种自身抗体及多种自身免疫性疾病。

该技术的应用将使大规模筛查更具可行性且更具疾病特异性，从而实现疾病的早期预测以预防疾病，并实现更精确的诊断以指导治疗。首先，将4微升生物素化的GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8和胰岛素原抗原蛋白加入含有156微升1% BSA的离心管中，并分别与240微升相应的链霉亲和素偶联接头1、2、3、8、9和10混合。然后，在室温下孵育30分钟。

将160微升终止液分装至各管中，并在室温下孵育30分钟。然后，从每管中取出400微升混合液，合并在一起。向混合液中加入4微升钌标记的GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8和胰岛素原抗原。

然后，加入 1.6 毫升终止液和 3.2 毫升 PBS。充分混匀所有组分。此时，抗原溶液已准备好，可用于检测实验。

对于96孔PCR板，每孔分装7 µL血清，并用密封膜封板。随后，在PCR仪上将血清于56 °C预热30分钟，并以100 × g短暂离心1分钟。每孔加入63 µL制备好的抗原溶液，与血清混匀，再用密封箔膜封板以避免光照。

将酶标板置于摇床上，以450 rpm的速度在室温下振荡两小时。然后将酶标板在4°C条件下孵育18至24小时。从4°C冰箱中取出一个6-Plex板，使其恢复至室温。

然后，向6重孔板的每个孔中加入150 µL的3%封闭剂A。用铝箔覆盖孔板以避免光照。将孔板放回4°C冰箱中，过夜孵育。

孵育结束后，将酶标板从冰箱中取出，移除板上的全部缓冲液。将酶标板在纸巾上轻拍以吸干液体，并每次用150 µL洗涤缓冲液洗涤每孔，共洗涤三次。再次将酶标板在纸巾上吸干，然后将过夜孵育的PCR板中每孔的血清抗原孵育液各取30 µL，分别加入6-Plex板的两个孔中。

用锡箔纸覆盖酶标板，然后将酶标板置于板式摇床上，于室温下以 450 rpm 的速度振荡一小时。倒掉六重孔板中的溶液，并用 0.4 M 氯化钠洗涤缓冲液每孔 150 微升，洗涤三次。第三次洗涤完成后，将酶标板在纸巾上拍干，每孔加入 150 微升读板缓冲液。

通过6重ECL检测法测定的GADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA和COVID-19A六种自身抗体水平，与相应的六种单重ECL检测法以及当前标准的放射性结合检测法结果高度一致。针对所有六种抗体，每个样本的指数值均相对于相应的阳性和阴性对照进行计算。当指数值高于临界值时，判定为阳性结果。

血清中的自身抗体突破了钌标记抗原与生物素化抗原的界限，通过特定连接物形成复合物，构建了一个多重检测平台。该策略使得在普通人群中对1型糖尿病及其伴随疾病进行大规模筛查更加可行和高效，从而实现疾病的早期预测与预防。