针对 1 型糖尿病、乳糜泻和 COVID-19 的高通量多重筛查

根据2019年筛查1型糖尿病、乳糜泻和冠状病毒病的迫切需要，我们开发了一种高通量6-Plex电化学发光测定法，可同时检测所有四种胰岛自身抗体、组织谷氨酰胺转移酶自身抗体和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域的抗体。

新型 6-Plex ECL 检测是第一个经过验证的多重检测，现已应用于一般人群筛查的临床试验。它同时结合了六种自身抗体检测方法，适用于在大量人群中筛查 1 型糖尿病、乳糜泻和 COVID-19。与目前的标准自身抗体检测相比，该技术可以更有效地同时筛选多种自身免疫性疾病的多种自身抗体。

该技术的意义将使大规模筛查更加可行和具有疾病特异性，从而为预防提供早期疾病预测和更精确的治疗诊断。首先，将四微升生物素化的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原蛋白加入含有 156 微升 1%BSA 的试管中，并与 240 微升相应的链霉亲和素偶联接头 1、2、3、8、9 和 10 混合。然后，将混合物在室温下孵育30分钟。

将160微升终止溶液分装到每个管中，并将混合物在室温下孵育30分钟。现在，从每个管中取出400微升的混合物溶液并将它们混合在一起。向混合物中加入四微升钌标记的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原。

然后，加入1.6毫升停止溶液和3.2毫升PBS。彻底混合所有成分。现在，抗原溶液已准备好用于测定。

对于 96 孔 PCR 板，每孔等分试样 7 微升血清，并用密封膜覆盖板。接下来，在PCR机上将血清在56摄氏度下预热30分钟，并以100倍G短暂离心板一分钟。每孔加入63微升制备的抗原溶液，与血清混合，并用密封箔覆盖PCR板以避免光照。

在室温下以 450 rpm 的速度在摇床上摇晃板两个小时。然后，将板在 4 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。从四摄氏度的冰箱中取出一个 6 重盘子，让盘子达到室温。

然后，向6-Plex板的每个孔中加入150微升3%阻断剂A。用箔纸盖住盘子以避免光线。将盘子放回四摄氏度的冰箱中，孵育过夜。

在孵育结束时，一旦将板从冰箱中取出，从培养皿中取出所有缓冲液。将盘子拍在纸巾上晾干，每次用每孔150微升洗涤缓冲液洗涤三次。在纸巾上干燥板，并从过夜孵育PCR板的每个孔中等分试样30微升血清抗原孵育到6-Plex板的两个孔中。

用箔纸盖住板，然后将板放在摇盘器上，在室温下以 450 rpm 的速度摇晃一小时。倾倒存在于6-Plex板中的溶液，并用每孔150微升0.4M氯化钠洗涤缓冲液洗涤板三次。第三次洗涤完成后，用纸巾擦干板，并向每个孔中加入150微升读数缓冲液。

来自 6-Plex ECL 测定的 GADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA 和 COVID-19A 的六种自身抗体水平与其相应的 6 种单 ECL 测定以及当前的标准放射性结合测定密切相关。根据相应的阳性和阴性对照计算所有六种抗体的每个样品的指数值。观察到指数值大于截止值，这表明结果为阳性。

血清中的自身抗体将钌标记的抗原破坏为生物素化抗原，形成具有特异性接头的复合物，构建多重平台。这种策略使在普通人群中对一型糖尿病及其伴随疾病的大规模筛查更加可行和有效，从而对疾病进行早期预测和预防。